Synthèse d'une norme deuterated pour la quantification de 2-Arachidonoylglycerol à Caenorhabditis elegans

Résumé

Ce travail décrit une méthode robuste et simple pour détecter et quantifier l'endocannabinoïde 2-arachidonoylglycérol (2-AG) dans C. elegans. Une norme analytique délutée nous a préparé et utilisé pour la quantification de 2-AG par dilution isotopique et la spectrométrie de masse d'ionisation-tandem d'ionisation d'électrospray liquide (LC-ESI-MS/MS).

Résumé

Ce travail présente une méthode pour préparer une norme analytique pour analyser le glycérol 2-arachidonoyl (2-AG) qualitativement et quantitativement par la spectrométrie de masse d'ionisation-tandem de chromatographie-électrospray (LC-ESI-MS/MS). Les endocannabinoïdes sont des médiateurs lipidiques conservés qui régulent plusieurs processus biologiques dans une variété d'organismes. Dans C. elegans, 2-AG s'est avéré posséder différents rôles, y compris la modulation de la formation dauer et le métabolisme du cholestérol. Ce rapport décrit une méthode pour surmonter les difficultés associées aux coûts et à la stabilité des normes deuterated exigées pour la quantification de 2-AG. La procédure de synthèse de la norme est simple et peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire, sans avoir besoin d'expertise en synthèse organique ou d'équipement spécial. En outre, une modification de la méthode de Folch pour extraire la norme deuterated de la culture de C. elegans est décrite. Enfin, une méthode quantitative et analytique pour détecter 2-AG à l'aide de l'analogue stable étiqueté isotopique 1-AG-d₅ est décrite, ce qui fournit des résultats fiables dans une course à la chromatographie rapide. La procédure est utile pour étudier les rôles multiples de 2-AG dans C. elegans tout en étant applicable à d'autres études de métabolites dans différents organismes.

Introduction

Les endocannabinoïdes régulent plusieurs processus biologiques dans une variété d'organismes et sont des médiateurs lipidiques conservés¹. Les premiers endocannabinoïdes découverts et les plus bien caractérisés sont l'anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) et le glycérol 2-arachidonoyl (2-AG). Les endocannabinoïdes jouent de nombreux rôles critiques, y compris ceux impliqués dans les systèmes de récompense du cerveau ainsi que la toxicomanie, la mémoire, l'humeur, et les processus métaboliques². AEA et 2-AG ne sont synthétisés qu'en cas de besoin et ont une courte durée de vie, et ils sont dégradés par le transport de la reprise de protéines et de l'hydrolyse³.

L'utilisation de modèles animaux comme Caenorhabditis elegans (C. elegans) est devenue importante pour étudier la grande variété de processus biologiques, y compris l'apoptose, la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire, la polarité cellulaire, la régulation des gènes, le métabolisme, le vieillissement, et la détermination du sexe^4,5. En outre, C. elegans est un excellent modèle pour étudier les rôles physiologiques des acides gras polyinsaturés (PUFA). L'AEA a été identifiée chez C. elegans et est réduite en vertu de la restriction alimentaire⁶. Cette insuffisance prolonge la durée de vie du nématode par un mécanisme diététique de restriction qui peut être supprimé par la supplémentation avec l'endocannabinoïde. Récemment, il a été découvert que 2-AG et AEA jouent un rôle fondamental dans la réglementation du trafic de cholestérol dans C. elegans⁷. Plus important encore, il a été déterminé que la supplémentation avec exogène 2-AG peut sauver l'arrestation dauer, qui est causée par le trafic de cholestérol altéré dans Niemann-Pick type C1 C. elegans mutants.

Pour mieux comprendre la relation de 2-AG avec le trafic de cholestérol et d'autres processus biologiques dans le nématode (c.-à-d. la signalisation monoaminergique, la nociception et la locomotion), il est crucial d'étudier ce métabolite endogène et comment il est affectés dans certaines conditions environnementales et diététiques^{8,9,10,11,12,13}. Par conséquent, il est impératif de concevoir et d'optimiser une méthode pour détecter et quantifier endogène 2-AG dans C. elegans qui est simple à utiliser pour les scientifiques de différents domaines, en particulier ceux qui étudient le comportement du nématode par rapport à cette endocannabinoïde.

En 2008, Lethonen et ses collègues ont réussi à identifier 2-AG et AEA dans C. elegans en utilisant les méthodes d'analyse LC-MS¹⁴. En 2011, ils ont réussi à étendre cette technique à d'autres endocannabinoïdes¹⁵. Des travaux plus récents ont montré d'autres méthodes analytiques qui ont réussi à détecter et à quantifier les endocannabinoïdes chez C. elegans, y compris la spectrométrie de masse et GC-MS^16,17,18, et il a également signalé que des méthodes analytiques similaires peuvent être étendues à d'autres modèles¹⁹.

Les méthodes analytiques précédemment signalées utilisées pour quantifier le 2-AG dans les échantillons biologiques impliquent habituellement l'utilisation de normes diluées qui sont acquises commercialement et nécessitent une disponibilité pour l'achat^20,21. De nombreuses normes analytiques pour la quantification des endocannabinoïdes LC-MS/MS sont disponibles dans le commerce auprès de différents fournisseurs. Néanmoins, ils sont chers, sont sensibles, et s'oxydent au fil du temps, en raison de la présence de multiples liaisons doubles. Les versions les plus courantes de ces normes sont basées sur l'acide arachidonique delué d'octa et conviennent à la quantification par dilution isotopique LC-MS/MS^14,22. En outre, la plupart de ces normes sont substituées dans la position 2 du glycérol, les rendant instables dans la plupart des conditions puisqu'elles sont sujettes à la migration d'acyl^19,23.

Pour surmonter les difficultés associées aux coûts et à la stabilité de ces normes deuterated, une méthode commode et simple est présentée pour préparer une norme analytique basée sur le glycérol-d₅. La séquence pour préparer la norme penta-deuterated exige une procédure en trois étapes qui a comme conséquence la norme 1-AG-d₅, qui est stable et ne subit pas la migration d'acyl (la question principale en visant à synthétiser 2-monoacylglycerols).

L'objectif principal ici est de montrer une méthode simple et reproductible pour étudier 2-AG dans C. elegans, y compris la synthèse de la norme analytique deuterated, la préparation et l'extraction des échantillons de nématode, et l'analyse par LC-MS/MS (Figure 1 ). Cette procédure synthétique est réalisable sans la connaissance sophistiquée de synthèse organique ou l'équipement spécial, le rendant approprié pour des scientifiques de différents domaines qui étudient le comportement de C. elegans sous l'influence endocannabinoïde. La méthode est également extensible à d'autres modèles d'étude, ce qui la rend utile pour différentes cibles. La norme, préparée comme indiqué ici, a été appliquée pour développer avec succès une méthode chromatographique rapide et fiable qui permet une détection efficace et la quantification de 2-AG d'une manière reproductible.

Protocole

1. 1-AG-d₅ préparation

REMARQUE : Pour obtenir 1-AG-d₅ comme norme interne diluée pour les tests de quantification, suivez le protocole comme détaillé ci-dessous.

1. Protection différentielle
   1. Pour protéger uniquement les alcools primaires, ajoutez d'abord 38 mg de glycérol-d₈ à un tube de réaction de 10 ml à l'aide d'une pipette Pasteur et ajoutez un agitateur magnétique.
   2. Ajouter 5 ml de dichlorométhane anhydre (DCM) à l'aide d'une seringue Hamilton de 5 ml, et remplir le tube de N₂ sec pour donner une atmosphère inerte.
   3. Préparer un bain à l'aide d'un flacon de guerre peu profond rempli d'acétate d'éthyle distillé.
   4. Ajustez le tube de réaction hermétiquement fermé à l'intérieur du bain et refroidissez-le en ajoutant lentement le liquide N₂ à l'acétate d'éthyle jusqu'à ce que le solvant soit gelé.
      CAUTION: Le liquide bout violemment à température ambiante (RT) et peut causer de graves brûlures lors de l'contact avec les yeux et la peau.
   5. Ajouter 54 mg de collidine anhydre à l'aide d'une seringue Hamilton.
      CAUTION: Collidine est volatile et a un parfum très fort et désagréable.
   6. Ajouter 70 mg de chlorure de tert-butyldimethylsilyl et remuer la solution entière pendant 3 h à -78 oC sur un agitateur magnétique.
   7. Après 3 h, laisser la réaction au chaud à RT et continuer à remuer pendant 12 h supplémentaires.
   8. Ajouter 2 ml de saumure pour éteindre la réaction.
   9. Extraire la solution 3x avec 2 ml de dichlorométhane distillé à l'aide d'un entonnoir de séparation, en économisant l'extrait organique à chaque fois.
   10. Mélanger les trois extraits organiques et les sécher sur du sulfate de sodium.
   11. Évaporer le dichlorométhane sous pression réduite dans un évaporateur rotatif sous vide soigneusement pour éviter les projections de solvants.
   12. Purifiez le mélange brut par chromatographie de colonne utilisant le gel de silice comme phase stationnaire et un gradient croissant d'hexane/acétate d'hexane de 10%, commençant à partir de 100% d'hexane et terminant avec 100% d'acétate éthylique.
   13. Combinez les fractions contenant le produit et retirez le solvant sous pression réduite dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir le glycérol-d₅ pur de 1-O,3-O-Bis-(TBDMS) comme liquide incolore.
2. Estérification
   1. Ajouter 10 mg de la 1-O,3-O-bis(TBDMS)-glycérol-d₅ (précédemment synthétisé) à un tube de réaction de 10 ml à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter un agitateur magnétique.
   2. Ajouter 2 ml de dichlorométhane anhydre à l'aide d'une seringue Hamilton de 5 ml et remplir le tube de N₂ sec pour donner une atmosphère inerte.
   3. Refroidir la solution à 0 oC à l'aide d'un bain de glace.
   4. Ajouter 36 mg d'acide arachidonique à l'aide d'une micropipette réglable en plusieurs volumes et remuer.
   5. Ajouter 15 mg de 4-dimethylaminopyridine et remuer.
   6. Ajouter 15 mg de N,N'-diisopropylcarbodiimide à l'aide d'une micropipette réglable en plusieurs volumes et remuer.
   7. Laisser réagir le mélange à 0 oC pendant 3 h.
   8. Après 3 h, laisser la réaction au chaud à RT et continuer à remuer pendant 12 h supplémentaires.
   9. Ajouter 2 ml d'eau pour éteindre la réaction.
   10. Extraire la solution organique 3x avec 2 ml de dichlorométhane distillé (DCM) à l'aide d'un entonnoir de séparation.
   11. Placer les trois extraits organiques dans le même tube et les sécher sur du sulfate de sodium.
   12. Évaporer le dichlorométhane sous pression réduite dans un évaporateur rotatif sous vide soigneusement pour éviter les projections de solvants.
   13. Purifiez le mélange brut par chromatographie de colonne utilisant le gel de silice comme phase stationnaire et un gradient croissant d'hexane/acétate d'hexane de 10%, commençant à partir de 100% d'hexane et terminant avec 50% d'hexane/50% d'acétate d'éthyle.
   14. Combinez les fractions contenant du produit et retirez le solvant sous pression réduite dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir le pur 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅ comme liquide jaunâtre.
3. Déprotection
   1. Ajouter 15 mg de la 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅ (précédemment synthétisé) à un tube de réaction de 10 ml à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter un agitateur magnétique.
   2. Ajouter 2 ml de THF anhydre à l'aide d'une seringue Hamilton de 5 ml et remplir le tube de N₂ sec pour donner une atmosphère inerte.
   3. Refroidir la solution à 0 oC à l'aide d'un bain de glace.
   4. Ajouter 150 ll de 1 M de solution de fluorure de tétrabutylammonium dans le THF à l'aide d'une seringue Hamilton.
   5. Laisser la réaction chaude à RT et remuer pendant 1 h.
   6. Après 1 h, ajouter 2 ml d'eau pour éteindre la réaction.
   7. Extraire la solution 3x avec 2 ml de dichlorométhane distillé à l'aide d'un entonnoir de séparation.
   8. Mélanger les trois extraits organiques et les sécher sur du sulfate de sodium.
   9. Évaporer le dichlorométhane sous pression réduite dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir le pur 1-AG-d₅ comme liquide jaunâtre.
4. Surveillez toutes les réactions par chromatographie de couche mince exécutée sur le gel de silice 60 F₂₅₄ les feuilles d'aluminium pré-enduites. Visualisez les bandes sous une lampe UV de 254 nm après coloration avec une solution éthanolique de 4-anisaldéhyde.

2. Préparation de stock standard et de solutions de mesure

1. Dissoudre 1 mg de la norme interne 1-AG-d₅ en 1 ml d'ACN et sonicate pendant 1 min pour obtenir la solution de stock standard de 1000 ppm.
2. Pour préparer la solution de 1 000 ppb utilisée pour la quantification des vers, préparez d'abord une solution de 10 ppm : prenez 10 l de la solution de stock à l'aide d'une seringue Hamilton et diluez-la à un volume final de 1 mL en ajoutant 990 l d'ACN.
3. Prenez 100 L de la solution produite à l'étape 2.2 à l'aide d'une seringue Hamilton, et diluez-la à un volume final de 1 ml en ajoutant 900 L d'ACN pour obtenir la solution de 1 000 ppb utilisée pour la quantification.
4. Sonicate pendant 1 min entre chaque étape pour assurer une solubilité complète. Entreposez les solutions à -78 oC pour maintenir les concentrations et l'intégrité des normes. Après l'utilisation de la solution standard, écoulez un peu d'azote avant de fermer le flacon pour éviter l'oxydation.

3. Croissance et entretien de C. elegans

REMARQUE : Seed the nematode growth medium (NGM) agar plates with E. coli OP50 and propagate the worms on these plates.

1. Mélanger 3 g de NaCl avec 17 g d'agar.
2. Ajouter 2,5 g de peptone, puis ajouter 975 ml de H₂O.
3. Autoclave pendant 50 min, puis refroidir le flacon à 55 oC.
4. Mélanger ce qui suit: 1 ml de 1 M CaCl₂, 1 ml de 1 M MgSO₄, 25 ml de 1 M KH₂PO₄ tampon (qui ont tous été précédemment autoclaved), et 1 ml de 5 mg/ml de cholestérol dans l'éthanol.
5. Tout en maintenant un environnement stérile, distribuez la solution NGM en plaques Petri de 60 mm, en remplissant les plaques aux deux tiers de leur volume. Conserver les assiettes à 4 oC.
6. Ststreak la culture bactérienne E. coli à partir d'un stock de glycérol de -80 oC sur la plaque d'agar LB. Laissez-le pousser sur la plaque pendant la nuit à 37 oC.
7. Ramassez une seule colonie pour inoculer 100 ml de LB liquide pendant la nuit à 37 oC avec agitation.
   REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de vérifier l'O.D. parce que cette souche peut atteindre la phase stationnaire au cours de cette période.
8. Retirez les plaques NGM stockées, retirez les couvercles du capot d'écoulement laminaire et laissez-les ouvertes pour permettre l'évaporation de l'excès d'humidité des plaques.
9. Une fois les plaques séchées, utiliser une pipette Pasteur pour ajouter 100 OL d'OP50 E. coli au centre de la plaque sans se propager.
10. Laissez la pelouse OP50 E. coli pousser toute la nuit à RT ou à 37 oC pendant 8 h.
11. Ajouter le nombre désiré d'embryons de vers obtenus par traitement à l'hypochlorite ou « blanchiment » (section 4).
    REMARQUE: Refroidir les plaques à RT avant l'ajout de vers.

4. Technique de blanchiment pour synchroniser les cultures C elegans

1. Les vers de graines et de morceaux sur des plaques NGM de 6 cm.
2. Laissez les vers pousser pendant 2-3 jours pour obtenir un nombre suffisant d'œufs et d'adultes gravidés dans l'assiette.
3. Une fois qu'il y a assez d'œufs/adultes, versez 5 ml de M9 sur l'assiette.
4. Transférer les vers dans un tube centrifugeuse de 15 ml à l'aide d'une pipette en verre.
5. Centrifuger le tube pendant 2 min à 2 000 x g et granuler les vers.
6. Succion de la majeure partie de la M9, en évitant la perturbation de la pastille de ver.
7. Ajouter 3 mL de solution de blanchiment (2:1:1 ratio de NaOH:NaOCl:H₂O).
8. Inverser doucement pour mélanger la solution pendant 5 min ou jusqu'à ce que le nombre de vers adultes intacts diminue.
   CAUTION: Ne pas blanchir pendant plus de 5 min.
9. Centrifugeuse pendant 1 min à 2 000 x g et aspiration la plupart de la solution de blanchiment sans déranger la pastille de ver.
10. Ajouter 15 ml de M9 et bien mélanger.
11. Centrifugeuse à nouveau à 2000 x g pendant 1 min.
12. Souction sur la plupart de la M9 sans déranger la pastille de ver.
13. Répétez les étapes 4.10-4.12 une ou deux fois de plus.
14. Ajouter 5 ml de M9 frais et agiter.
15. Laisser les œufs éclore toute la nuit avec un léger basculement.

5. Préparation de l'échantillon de ver

1. Laisser les embryons N2 obtenus par la procédure de blanchiment éclosent pendant la nuit dans le tampon M9 (5 ml dans un tube de centrifugeuse de 15 ml) à 20 oC.
2. Récoltez les L1 synchronisés en centrifuant le tube pendant 2 min à 2 000 x g.
3. Laver les vers avec M9 tampon 1x, puis quantifier le nombre de vers L1 vivants.
4. Ensemencez environ 10 000 vers dans des plaques NGM (10 cm de diamètre) avec 1 ml d'OP50 E. coli (précédemment séché).
5. Incuber les plaques pendant 48 h à 20 oC jusqu'à ce que les vers atteignent le stade L4.
6. Récoltez les vers à l'aide d'un tampon M9 froid dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, lavez-les 1x, puis transférez-les dans un tube de 1,5 ml.
7. Pelleter les vers par centrifugation à 2 000 x g pendant 1 min, éliminer la majeure partie du supernatant, immerger les tubes dans de l'azote liquide et les stocker à -80 oC.

6. Extraction lipidique

1. Décongeler environ 100 l de granulés de vers congelés appartenant à N2 sur la glace, ajouter 1,3 ml de méthanol et sonicate l'échantillon pendant 4 min.
2. Ajouter 2,6 ml de chloroforme, et 1,3 ml de 0,5 M KCl/0,08 M H₃PO₄ à un rapport final de 1:2:1, 1 000 ppb de la norme interne 1-AG-d₅, et hydroxytoluene butylé comme agent antioxydant à une concentration finale de 50 g/mL.
3. Vortex les échantillons pour 1 min et sonicate dans un bain d'eau à ultrasons pendant 15 min sur la glace.
4. Vortex les échantillons 2x pour 1 min et centrifugeuse pendant 10 min à 2 000 x g pour induire la séparation de phase.
5. Recueillir la phase inférieure et la recueillir dans un tube propre, le sécher sous l'azote, et resuspendre les résidus solides dans 100 l l d'ACN.

7. Analyse endocannabinoïde par HPLC-MS/MS

1. Utilisez une chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse triple quadrupole ESI pour détecter et quantifier 2-AG à partir d'échantillons de nématodes.
2. Utilisez le ratio suivant pour la phase inversée HPLC: de 0.0-0.5 min H₂O:ACN (40:60), 0.5-6.5 min H₂O:ACN (40:60) à (25:75), 6 .5-7.5 min H₂O:ACN (25:75), 7.5-8.0 min H₂O:ACN (25:75) à (40:60), 8.0-12.0 min H₂O: ACN (40:60).
3. Maintenir la température de la colonne à 40 oC et fixer la température du plateau de l'autosampler à 10 oC.
4. Définir les conditions d'ionisation suivantes : mode d'ion positif; gaz de séchage (N₂) température de 300 oC; taux d'écoulement du gaz de séchage de 10 L/min; pression nébuliseur 10 UA; et le plafond. tension de 4 kV.
5. Pour la détection de l'analyte, utilisez MRM avec les transitions suivantes : 379,2 m/z à 289,2 m/z pour 2-AG; et 384,2 m/z à 289,2 m/z pour 1-AG-d₅.

8. Quantification endocannabinoïde dans les vers

1. Utilisez la norme interne deuterated 1-AG-d₅ et calculez les ratios de surface de pointe de l'analyte à la norme interne.
2. Utilisez les transitions suivantes : 384,2 m/z à 287,2 m/z pour 2-AG; et 379,2 m/z à 287,2 m/z pour 1-AG-d₅.
3. Calculer la concentration de l'endogène 2-AG en comparant aux ratios de surface de pointe de la norme diluée en utilisant la valeur de concentration de la norme.

Résultats

Un analogue isotopique étiqueté a été synthétisé avec succès à partir de 8-glycérol et acide arachidonique disponibles dans le commerce à l'aide d'une méthode synthétique en 3 étapes ( Figure2, Figure 3). Ces étapes sont simples et ne nécessitent pas d'équipement sophistiqué, des conditions spécialement contrôlées ou des réactifs coûteux. Ainsi, cette méthode est robuste et peut être prolongée ...

Discussion

Les endocannabinoïdes sont une classe de lipides qui ont été impliqués dans la régulation de la formation dauer dans C. elegans⁷. Plus précisément, la synthèse des acides gras polyinsaturés (PUFA) est importante pour le trafic de cholestérol et le développement reproducteur des vers. Il est révélé ici que 2-AG, un acide arachidonique contenant de l'endocannabinoïde, est responsable de restituer la larve dauer à son cycle normal dans les vers qui ont altéré le métabolism...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)