Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and "Neuron Ball" Culture

Shumaia Parvin; Renoma Takeda; Yukio Sasaki

doi:10.3791/59893

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Résumé
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Résumé

La formation de presynapse est un processus dynamique comprenant l'accumulation de protéines synaptiques dans l'ordre approprié. Dans cette méthode, la formation de presynapse est déclenchée par des perles conjuguées avec une protéine d'organisateur de presynapse sur des feuilles axonales de la culture de « boule de neurone », de sorte que l'accumulation des protéines synaptiques soit facile à analyser pendant la formation de presynapse.

Résumé

Pendant le développement neuronal, la formation de synapse est une étape importante pour établir des circuits neuraux. Pour former des synapses, les protéines synaptiques doivent être fournies dans l'ordre approprié par transport à partir de corps cellulaires et/ou par traduction locale dans des synapses immatures. Cependant, il n'est pas entièrement compris comment les protéines synaptiques s'accumulent dans les synapses dans l'ordre approprié. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour analyser la formation presynaptique en utilisant la combinaison de la culture de boule de neurone avec des perles pour induire la formation de presynapse. Les boules de neurones qui sont des agrégats cellulaires neuronaux fournissent des feuilles axonales loin des corps cellulaires et des dendrites, de sorte que les signaux fluorescents faibles des presynapses peuvent être détectés en évitant les signaux accablants des corps cellulaires. Comme perles pour déclencher la formation de presynapse, nous utilisons des perles conjuguées avec le neuromembrane de transmembrane de répétition leucine-riche 2 (LRRTM2), un organisateur presynaptic excitateur. En utilisant cette méthode, nous avons démontré que le transporteur vésiculaire de glutamate 1 (vGlut1), une protéine synaptique de vésicule, s'est accumulé dans les presynapses plus rapidement que Munc18-1, une protéine active de zone. Munc18-1 a accumulé la traduction-dépendant dans la presynapse même après avoir enlevé des corps cellulaires. Cette constatation indique l'accumulation de Munc18-1 par traduction locale dans les axones, et non par le transport des corps cellulaires. En conclusion, cette méthode convient pour analyser l'accumulation de protéines synaptiques dans les presynapses et la source de protéines synaptiques. Comme la culture neuronale est simple et qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser un appareil spécial, cette méthode pourrait s'appliquer à d'autres plates-formes expérimentales.

Introduction

La formation de Synapse est l'une des étapes critiques pendant le développement des circuits neuronaux¹^,²^,³. La formation de synapses qui sont des compartiments spécialisés composés de pré- et de post-synapses est un processus complexe et en plusieurs étapes impliquant la reconnaissance appropriée des axones et des dendrites, la formation de la zone active et la densité postsynaptique, et l'alignement approprié de canaux ioniques et récepteurs neurotransmetteurs¹^,². Dans chaque processus, de nombreux types de protéine....