Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

Résumé

Le but de ce protocole est de montrer comment utiliser la microscopie lattice Light-Sheet pour visualiser en quatre dimensions la dynamique des récepteurs de surface dans les cellules vivantes. Ici, les récepteurs des lymphocytes T sur les lymphocytes T CD4^et primaires sont montrés.

Résumé

La signalisation et la fonction d'une cellule sont dictées par les structures dynamiques et les interactions de ses récepteurs de surface. Pour vraiment comprendre la relation structure-fonction de ces récepteurs in situ, nous devons les visualiser et les suivre sur la surface des cellules vivantes avec une résolution spatiotemporal suffisante. Ici, nous montrons comment utiliser récemment développé Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) pour l'image des récepteurs à cellule T (TCRs) en quatre dimensions (4D, l'espace et le temps) à la membrane cellulaire vivante. Les lymphocytes T sont l'une des principales cellules effectrices du système immunitaire adaptatif, et ici nous avons utilisé les lymphocytes T comme exemple pour montrer que la signalisation et la fonction de ces cellules sont entraînées par la dynamique et les interactions des TCR. LLSM permet une imagerie 4D avec une résolution spatiotemporal sans précédent. Cette technique de microscopie peut donc être généralement appliquée à un large éventail de molécules de surface ou intracellulaires de différentes cellules en biologie.

Introduction

La dynamique précise du trafic et de la diffusion des molécules sur la surface tridimensionnelle des cellules en temps réel a été une énigme à résoudre. La microscopie a toujours été un équilibre de vitesse, de sensibilité et de résolution; si un ou deux sont maximisés, le troisième est minimisé. Par conséquent, en raison de la petite taille et de la vitesse immense avec laquelle les récepteurs de surface se déplacent, le suivi de leur dynamique est resté un défi technologique majeur dans le domaine de la biologie cellulaire. Par exemple, de nombreuses études ont été menées à l'aide de la microscopie interne totale de fluorescence (TIRF)^1,2,3, qui a une résolution temporelle élevée, mais ne peut imager qu'une tranche très mince de la membrane des lymphocytes T (100 nm), et manque donc des événements qui se produisent plus loin dans la cellule. Ces images TIRF ne montrent également qu'une section bidimensionnelle de la cellule. En revanche, les techniques de super-résolution, telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)⁴, la microscopie de localisation photoactivée (PALM)⁵, et la microscopie d'épuisement des émissions stimulée (STED)⁶, peuvent surmonter la limite de diffraction de l'abbéenne de la lumière. Ces techniques ont une résolution spatiale élevée (résolution de 20 nm)^4,5,6,7, mais elles prennent souvent de nombreuses minutes pour acquérir une image bidimensionnelle complète (2D) ou tridimensionnelle (3D), et donc la résolution temporelle est perdue. En outre, des techniques telles que STORM et PALM qui reposent sur des signaux clignotants peuvent avoir des inexactitudes dans le comptage^8,9. La microscopie électronique a de loin la plus haute résolution (jusqu'à 50 h de résolution)¹⁰; il peut même être effectué en trois dimensions avec la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d'ions (FIB-SEM), ayant pour résultat jusqu'à 3 nm XY et 500 nm Z résolution^11. Cependant, toute forme de microscopie électronique nécessite une préparation d'échantillons rigoureux et ne peut être menée qu'avec des cellules ou des tissus fixes, éliminant ainsi la possibilité d'imagerie d'échantillons vivants au fil du temps.

Les techniques pour obtenir la résolution spatiotemporal élevée exigée pour identifier la dynamique des molécules de surface et intracellulaires dans les cellules vivantes dans leur vraie nature physiologique 3D sont seulement récemment développées. Une de ces techniques est Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)¹², qui utilise une feuille de lumière structurée pour réduire considérablement photoblanchiment. Développé en 2014 par le prix Nobel Eric Betzig, la haute résolution axiale, le faible photoblanchiment et le bruit de fond, et la capacité d'imager simultanément des centaines d'avions par champ de vision font des microscopes LLS supérieurs aux microscopes widefield, TIRF et confocal^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Cette technique d'imagerie en quatre dimensions (x, y, z et temps), bien que toujours limitée à la diffraction (résolution XYZ de 200 nm), a une résolution temporelle incroyable (nous avons atteint un taux d'image d'environ 100 fps, résultant en une image cellulaire reconstruite en 3D avec 0,85 seconde par image) pour l'acquisition spatiale 3D.

LLSM peut généralement être utilisé pour suivre la dynamique en temps réel de toutes les molécules dans n'importe quelle cellule au niveau monomolécule et unicellulaire, en particulier ceux dans les cellules très motiles telles que les cellules immunitaires. Par exemple, nous montrons ici comment utiliser LLSM pour visualiser la dynamique des récepteurs des lymphocytes T (TCR). Les lymphocytes T sont les cellules effectrices du système immunitaire adaptatif. Les TCR sont chargés de reconnaître les ligands peptide-MHC (pMHC) affichés à la surface des cellules présentant des antigènes (APC), qui déterminent la sélection, le développement, la différenciation, le sort et la fonction d'une cellule T. Cette reconnaissance se produit à l'interface entre les lymphocytes T et les APC, résultant en un regroupement localisé des récepteurs pour former ce qu'on appelle la synapse immunologique. Bien qu'il soit connu que les TCR à la synapse immunologique sont impératifs pour la fonction effector de Cellule T, encore inconnus sont les mécanismes sous-jacents du trafic en temps réel de TCR à la synapse. LLSM nous a permis de visualiser en temps réel la dynamique des TCR avant et après le trafic à la synapse avec l'interaction pMHC-TCR qui en résulte (Figure 1). LLSM peut donc être utilisé pour résoudre les questions actuelles de la dynamique formatrice des TCR et fournir des idées pour comprendre comment une cellule fait la distinction entre l'individu et les antigènes étrangers.

Protocole

5C. C7 TCR-transgénique RAG2 knock-out souris en B10. Un fond ont été employés dans cette étude selon un protocole approuvé par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux de l'université de Chicago.

1. Récolter et activer les lymphocytes T

REMARQUE : Cette partie du protocole est basée sur des protocoles précédents. Voir les citations pour plus de détails^20,21.

1. Euthanasier un 5C de 10-12 semaines. Souris transgénique C7 de l'un ou l'autre sexe (de 20 à 25 g) selon le protocole approuvé de l'IACUC (c.-à-d. la chambre CO₂ suivie d'une luxation cervicale).
2. Vaporiser soigneusement la carcasse de souris avec 70 % d'éthanol pour tremper la fourrure et l'apporter dans une armoire de sécurité BSL-2.
3. Tournez la souris sur son côté droit et faites une petite incision dans la cavité du corps avec des ciseaux chirurgicaux. Retirez la rate à l'aide de forceps chirurgicaux. Couper le tissu conjonctif au besoin avec des ciseaux chirurgicaux.
4. Placer la rate dans une passoire à cellules en maille de 70 m m et écraser à l'arrière d'un piston à seringues de 1 ml. Lavez-vous soigneusement à travers la passoire avec le RPMI complet (RPMI avec 10% de sérum bovin foetal [FBS], 2 mM L-glutamine, 1% pénicilline/streptomycine, 50 'M 2-mercaptoethanol).
5. Centrifugelant la suspension à cellule unique des splenocytes à 300 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant.
   REMARQUE: La pastille à ce stade sera rouge.
6. Resuspendre les splenocytes dans un tampon de lyse RBC de 5 mL. Incuber 5 min, puis étancher avec 5 ml de RPMI complet.
7. Centrifugelant la suspension à cellule unique des splenocytes à 300 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant.
   REMARQUE: La pastille à ce stade doit être blanche, pas rouge.
8. Resuspendre la pastille en 5 ml de RPMI complet.
9. Transférer dans un flacon T-25 et ajouter 10 m cytochrome-C (MCC, séquence ANERADLIAYLKQATK). Placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC, 5 % de CO₂ pendant la nuit.
10. Le lendemain, ajouter la souris recombinante IL-2 à une concentration finale de 100 U/mL.
11. Observez pour les jours suivants, ajoutant des médias frais que les médias actuels devient jaune. Les lymphocytes T mourront s'ils sont laissés dans des médias jaunes sans surveillance pendant plus de 48 h. Les cellules sont prêtes à être utilisées 6 à 10 jours après la récolte.

2. Préparer les cellules

1. Incuber les couvercles ronds de 5 mm avec 0,1 % de polylysine pendant 10 min. Aspirate et laisser sécher naturellement.
2. Utilisez un réactif de gradient de densité (voir le Tableau des matériaux) pour séparer les cellules mortes et obtenir 1 x 10⁶ lymphocytes T et 1 x 10⁶ APC (CH27 cellules^21,22 transduced with cytosolic mCherry) séparément.
   REMARQUE : Les cellules sont comptées à l'aide d'un hémocytomètre.
   1. Ajouter 3 ml de réagent de gradient de densité à un tube conique de 15 ml et ajouter les cellules dans le sens goutte à bord du tube avec soin. Ne pas mélanger. Centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min à 4 oC; l'accélération/décélération : SLOW/SLOW. Enlever soigneusement la fine couche moyenne des cellules entre le milieu complet et le gradient de densité, en plaçant chaque type de cellule dans des tubes coniques séparés.
      REMARQUE: Il est nécessaire de préparer plus de cellules que nécessaire pour l'imagerie, car nous constatons que 50% est perdu en moyenne au cours du processus. Plus il y a de cellules utilisées pour le processus, plus il est facile de les récolter à partir du gradient de densité. Nous utilisons 4-8 ml des deux types de cellules pour assurer l'excès de cellules. Si désiré, les cellules peuvent être comptées avant cette étape pour assurer le volume nécessaire. Toutes les cellules supplémentaires sont remises dans leurs flacons respectifs.
   2. Laver les deux tubes des lymphocytes T et des cellules CH27 trois fois avec un RPMI complet de 5 ml (300 x g pendant 5 min). Jeter le supernatant à chaque fois pendant le lavage. Resuspendre chaque tube en 1 ml complet RPMI et compter les cellules par un hémocytomètre.
3. Resuspendre 1 x 10⁶ APC dans 500 L complet RPMI et ajouter 10 M MCC. Incuber pendant 3 h à 37 oC, 5 % DE CO_2. Laver les cellules trois fois avec un RPMI complet de 500 l (300 x g pendant 5 min). Jetez les supernatants.
4. Resuspendre 1 x 10⁶ lymphocytes T dans 500 L complet RPMI. Ajouter 2 g de Fab étiqueté e (clone H57) à 500 oL de cellules. Incuber pendant 30 min à 37 oC, 5 % de CO_2. Laver les cellules trois fois avec 500 oL de RPMI complet (300 x g pendant 5 min). Jeter le supernatant après chaque lavage.
   REMARQUE : L'anticorps anti-TCR divalent a été coupé en Fab monovalent à l'aide d'un kit de préparation Fab (voir le Tableau des matériaux) pour éviter de relier les récepteurs des lymphocytes T par l'anticorps divalent (cette étape est facultative).
5. Resuspendre les deux types de cellules dans 500 l de milieux d'imagerie (milieu L-15 sans phenol avec 10% FBS, 1% pénicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine).

3. Conduite de l'alignement quotidien LLSM

REMARQUE : (Important) Ce protocole d'alignement est basé sur l'instrument LLSM utilisé (voir le Tableau des matériaux). Chaque LLSM peut être différent et nécessiter des stratégies d'alignement différentes, en particulier celles qui sont construites à la maison. Effectuer l'alignement de routine approprié et continuer à l'article 4.

1. Ajoutez 10 ml d'eau plus 30 l de fluorescéine (1 mg/mL de bouillon) au bain LLSM (volume de 10 ml), appuyez sur Image (Home) pour déplacer l'objectif vers la position de l'image, et regardez un seul modèle de faisceau laser Bessel. Alignez le faisceau laser à l'aide des guides et de la région d'intérêt pré-réglé (ROI) pour faire du faisceau un motif mince équilibré dans toutes les directions.
   1. Le faisceau doit également apparaître concentré dans la caméra de recherche. Utilisez deux régleurs d'inclinaison de miroir, micromètre supérieur, foyer, et collier objectif d'émission pour ajuster. Voir Figure 2A,B pour faisceau correctement aligné.
2. Laver le bain et les objectifs avec au moins 200 ml d'eau pour enlever complètement la fluorescéine.
3. Perles fluorescentes standard d'image dans les supports d'imagerie (préparées en adhérant à une feuille de couverture de 5 mm avec de la poly-L-lysine, voir le Tableau des matériaux;cela peut être pré-préparé et réutilisé) pour la fonction physique de propagation des points (PSF) dans les supports d'imagerie.
   REMARQUE: Il ne peut y avoir qu'une seule perle en vue pour le traitement ultérieur, alors essayez de trouver une perle qui est par lui-même dans le spectateur ou peut facilement être recadrée pour obtenir une perle unique.
   1. Allumez le dither en réglant à 3 dans la boîte 'X Galvo'. Appuyez sur Live pour voir le champ actuel. Déplacez-vous le long de la direction Z pour trouver le bordereau de couverture et les perles. Trouver le centre d'une perle en se déplaçant le long de Z, appuyez sur Arrêtez de mettre en pause le laser. Vérifiez 3D, centre de presse, puis appuyez sur Exécuter. Cela permettra de recueillir les données.
   2. Ajustez manuellement le miroir d'inclinaison, le collier objectif et le micromètre de mise au point pour les valeurs grises les plus élevées, puis ajustez-les au besoin pour obtenir les modèles appropriés pour les modes de balayage objectif, z galvo, z-objectif (totPSF) et de capture d'échantillon (samplePSF). Voir Figure 2C-F pour les projections d'intensité maximale correctement ajustées (PMI).
      REMARQUE : Les différents modes de capture (balayage objectif, z galvo, z-objectif et analyse de l'échantillon) modifient la façon dont la feuille de lumière se déplace à travers l'échantillon. Tous les modes d'analyse doivent être utilisés pour l'alignement.
   3. L'analyse de l'échantillon montre comment les données seront recueillies au cours de l'expérience. Recueillir l'échantillon PSF en appuyant sur Execute en mode d'analyse de l'échantillon pour le dékewing et la déconvolution (voir la section 5). Changez les lasers en mode trois couleurs (488, 560, 647) et appuyez à nouveau sur Execute.
      REMARQUE : Étant donné que les images LLSM en angle (57,2 degrés), les images capturées en mode « analyse de l'échantillon » sont recueillies à cet angle et sont donc « biaisées ». Le débiais est le processus de correction de cet angle et de « réalignement » de l'image sur une véritable z-pile. Ces données doivent être collectées dans des supports d'imagerie et dans tous les canaux qui seront photographiés au cours de l'expérience. Si cela n'est pas recueilli correctement, les données ne seront pas correctement débiaisées. De même, assurez-vous que les médias ont été réchauffés à 37 oC (ou à la température expérimentale désirée).

4. Mise en place de cellules avec LLSM

1. Ajouter 100 000 APC (50 l) de l'étape 2,5 à un bordereau circulaire de 5 mm de diamètre à partir de l'étape 2.1 et leur permettre de se contenter de 10 min.
2. Graisser le support de l'échantillon, puis ajouter le coverslip cellule-côté vers le haut à elle. Ajouter une goutte de support d'imagerie à l'arrière de la couverture pour éviter les bulles avant de placer dans le bain. Visser le porte-échantillon sur le piezo, et appuyez sur Image (Home).
3. Trouvez un APC à l'image pour s'assurer que le LLSM et le logiciel d'imagerie (voir tableau des matériaux)fonctionnent correctement.
   REMARQUE : Nous imagez à la taille d'étape de 0.4 'm avec 60 z-steps et 10 ms d'exposition pour deux couleurs avec l'ensemble de fossé à 3, qui a comme conséquence 1.54 s par image de l'image 3D avec la résolution de '200 nm XY et de 400 nm Z. Ces paramètres peuvent devoir être ajustés en fonction de la taille de la cellule, de la résolution z souhaitée et de la force du signal de la technique d'étiquetage fluorescent utilisée. La consommation d'énergie au laser variera également en fonction de la technique d'étiquetage fluorescent utilisée.
   1. Appuyez sur Live pour afficher l'image actuelle. Déplacez-vous le long de Z pour trouver le bordereau de couverture et les cellules.
   2. Trouvez le centre d'un APC en se déplaçant dans la direction Z, puis appuyez sur Arrêtez pour mettre en pause le laser. Vérifiez la 3D et entrez les paramètres souhaités (voir l'étape 4.3.1), appuyez sur Centre, puis appuyez sur Exécuter. Cela permettra de recueillir les données.
4. Abaissez l'étape pour charger la position et ajoutez 50 L de lymphocytes T dans les supports d'imagerie (100 000 cellules, à partir de l'étape 2.5) directement sur le bordereau de couverture. Il est préférable de laisser une goutte se former à l'extrémité de la pointe de la pipette, puis de toucher la pointe au liquide du bain. Remontez la scène en cliquant sur "Image (Retour)".
5. Commencer l'imagerie. Assurez-vous de définir la taille de la pile désirée et la durée du laps de temps. Par exemple, imagez 60 z-stacks à une taille d'étape de 0,4 m et entrez 500 échéanciers. (Typiquement) arrêter l'enregistrement avant 500 images sont atteintes pour éviter le photoblanchiment. Utilisez le mode Live pour rechercher des paires de cellules, et lorsque les paramètres sont prêts et désirés, appuyez sur Exécuter pour collecter des données. Voir le film 1 et la figure 1 par exemple.

5. Suivre la dynamique de surface

1. Exporter les données du logiciel d'imagerie (voir le Tableau des matériaux). Cela créera des fichiers TIF z-pile pour chaque point de temps dans chaque couleur.
2. D'abord débiaiser et décongestioner les données.
   REMARQUE : Nous utilisons le pipeline LLSpy sous licence par le Janelia Research Campus^{18 de}HHMI, mais le dékewing et la déconvolution sont également disponibles dans plusieurs logiciels d'imagerie (voir Tableau des matériaux).
3. Debleach les données.
   REMARQUE: Nous utilisons la fonction de bleach Fidji avec l'assortir histogramme (Fiji Pathway: Image Ajuster Correction de l'eau de Javel Histogram Matching - France OK).
4. Importer dans le logiciel de suivi (voir le Tableau des matériaux). Suivre les clusters selon les spécifications logicielles. Voir Movie 2 pour un exemple.
   REMARQUE : Le suivi des résultats dépendra du logiciel de suivi utilisé, de l'algorithme choisi, des paramètres de sortie souhaités sélectionnés, etc. Par exemple, dans le logiciel de suivi que nous avons utilisé (voir le Tableau des Matériaux), nous avons choisi de permettre au logiciel de suivre les formes irrégulières, plutôt que d'attribuer chaque fonctionnalité un seul endroit, puisque les clusters TCR ne sont pas organisés en sphères parfaites. De plus, nous avons choisi de recueillir 35 paramètres, y compris la vitesse, la direction, le volume, l'intensité, la zone, l'emplacement et l'information sur la durée de la voie. Cependant, différentes méthodes ou paramètres seront bénéfiques pour répondre à différentes questions.
   1. Si le suivi n'est pas souhaité, utilisez le plugin ClearVolume pour Fidji pour visualiser et créer des films à partir de données hyperstack.

Résultats

Ici, nous décrivons l'isolement, la préparation, et l'imagerie de la souris primaire 5C. Cellules T C7 à l'aide d'un microscope à feuilles de lumière en treillis. Pendant la section 3, il est impératif d'aligner correctement le microscope et de recueillir quotidiennement des FPS pour décongestionner les données après la collecte. Dans la figure 2, nous montrons les images d'alignement correctes qui seront vues lors de l'alignement du microscope. La figure 2

Discussion

Le protocole présenté a été optimisé pour l'utilisation des cellules CD4^et T isolées de 5C. Les souris transgéniques C7 sur l'instrument LLSM utilisé, et donc d'autres systèmes cellulaires et LLSM peuvent avoir besoin d'être optimisés différemment. Cependant, ce protocole montre la puissance de l'imagerie 4D, car il peut être utilisé pour quantifier la dynamique d'un récepteur de surface sur une cellule entière avec le moins de distorsion dans les conditions physiologiques. Par conséquent, il ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659	For T cell harvest
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	For T cell culture
5 mm round coverslips	World Precision Instruments	502040	For Imaging
70um Sterile Cell Strainer	Corning	7201431	For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody	BioLegend	109215	For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)	X&Y Cell Culture	FBS-500	For T cell culture
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F6377	For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres	Thermo Fisher Scientific	F8810	For microscope alignment
Imaris	Bitplane	N/A	Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope	3i	N/A	Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	21083027	For Imaging
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-081	For T cell culture
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Custom Synthesis	For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	For T cell culture
Poly-L-Lysine	Phenix Research Products	P8920-100ML	For Imaging
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54	For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	For T cell culture
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	For T cell culture
Slidebook	3i	N/A	LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools	Nova-Tech International	DSET10	For T cell harvest
T-25 Flasks	Eppendorf	2231710126	For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits	Thermo Fisher Scientific	44685	For preparing Fab