Utilisation des essais d'entrée virale et de l'analyse moléculaire de l'amarrage pour l'identification des candidats antiviraux contre le Coxsackievirus A16

Résumé

L'objectif du protocole est d'illustrer les différents essais relatifs à l'entrée virale qui peuvent être utilisés pour identifier les inhibiteurs de l'entrée virale candidat.

Résumé

Les analyses antivirales qui examinent mécaniquement l'entrée virale sont pertinentes pour discerner à quelle étape les agents évalués sont les plus efficaces, et permettent l'identification des inhibiteurs d'entrée virales candidats. Ici, nous présentons les approches expérimentales pour l'identification de petites molécules capables de bloquer l'infection par le coxsackievirus A16 (CVA16) non enveloppé en ciblant les particules virales ou des étapes spécifiques dans l'entrée virale précoce. Les essais comprennent l'analyse de l'heure de l'ajout de médicaments, l'analyse de liaison virale basée sur la cytométrie du flux et l'essai d'inactivation virale. Nous présentons également un protocole d'amarrage moléculaire utilisant des protéines capsides virales pour prédire les résidus potentiels ciblés par les composés antiviraux. Ces tests devraient aider à l'identification des agents antiviraux candidats qui agissent sur l'entrée virale. Les orientations futures peuvent explorer ces inhibiteurs possibles pour le développement ultérieur de médicaments.

Introduction

La maladie de la main, du pied et de la bouche (HFMD) est une maladie la plus souvent causée par le coxsackievirus A16 (CVA16) et l'entérovirus 71 (EV71) chez les jeunes enfants. Récemment, dans toute la région Asie-Pacifique, il y a eu une hausse significative de la DHHC induite par le CVA16. Bien que les symptômes peuvent être légers, des complications graves peuvent se produire qui affectent le cerveau et le cœur, avec la fatalité potentielle^1,2. À l'heure actuelle, il n'existe pas de thérapies antivirales ou de vaccins homologués pour le CVA16, et il est donc urgent d'élaborer des stratégies antivirales pour freiner les flambées futures et les complications connexes.

CVA16 est un virus non enveloppé qui a une capside icosahedral assemblé à partir de pentamers qui contiennent chacun 4 protéines structurelles à savoir VP1, VP2, VP3, et VP4. Encerclant chaque axe quintuple dans le phésse est une région «canyon» qui se manifeste comme une dépression et est connu pour son rôle dans la liaison des récepteurs³. Au fond de ce canyon se trouve une poche hydrophobe dans la région VP1 qui contient un ligand gras naturel nommé sphingosine (SPH). Les récepteurs cellulaires, tels que l'homme P selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) et le membre de classe B des récepteurs de charognards 2 (SCARB2), ont été suggérés pour jouer un rôle dans la liaison virale en déplaçant ce ligand qui a comme conséquence des changements conformationnels au capside et au éjection ultérieure du génome viral dans la cellule hôte^4,5,6. L'identification des inhibiteurs possibles qui bloquent les événements successifs dans le processus d'entrée virale pourrait fournir des stratégies thérapeutiques potentielles contre l'infection de CVA16.

Les étapes du cycle de vie du virus peuvent être disséquées par des approches expérimentales comme cibles pour aider à identifier les agents antiviraux spécifiques au mode. Une analyse de l'heure d'ajout de médicaments examine l'effet du traitement médicamenteux à différents moments de l'infection virale, y compris la pré-entrée (ajoutée avant l'infection virale), l'entrée (ajoutée en même temps que l'infection virale) et après l'entrée (ajoutée après l'infection virus)⁷. L'impact peut être évalué à l'aide d'un analyse de plaque standard en quantiant le nombre de plaques virales formées dans chacune des conditions de traitement. L'essai de liaison virale basé sur la cytométrie du flux détermine si le médicament empêche l'attachement viral aux cellules hôtes. Ceci est réalisé en déplaçant la température de 37 oC, à laquelle la majorité des infections virales humaines se produisent, à 4 oC, où les virions sont capables de se lier à la surface de la cellule hôte, mais sont incapables d'entrer dans les cellules⁷. Les particules virales liées à la membrane cellulaire sont ensuite quantifiées par immunostaining contre les antigènes viraux et évaluées par cytométrie de flux. L'analyse d'inactivation virale, d'autre part, aide à évaluer les interactions physiques potentielles du médicament avec les particules virales libres, soit en protégeant ou en neutralisant les virions, ou en causant des agrégations ou des changements conformationnels qui les rendent inactifs pour interactions ultérieures avec la surface de la cellule hôte pendant l'infection^8,9. Dans cette expérience, l'inoculum viral est autorisé à d'abord incuber avec le médicament avant d'être dilué pour titrer le médicament avant d'infecter la monocouche cellulaire hôte et d'effectuer un test de plaque standard⁸. Enfin, l'amarrage moléculaire est un outil puissant pour prédire les sites potentiels d'interaction médicamenteuse sur la surface de la virion, y compris les glycoprotéines virales des virus enveloppés et les protéines capsides virales des virus non enveloppés, en utilisant des Algorithmes. Cela permet de repérer mécanistement les cibles du mode d'action du médicament et de fournir des informations utiles qui peuvent être validées par des essais en aval.

Nous avons récemment utilisé les méthodes décrites ci-dessus pour identifier les composés antiviraux qui ont efficacement bloqué l'infection par le CVA16⁹non enveloppé . Ici, les protocoles détaillés qui ont été utilisés sont décrits et discutés.

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Protocole

REMARQUE: Toutes les cultures cellulaires et les infections virales doivent être effectuées dans des hottes de biosécurité certifiées qui conviennent au niveau de biosécurité des échantillons manipulés. Les deux tanins de la classe des petites molécules d'acide chébulagique (CHLA) et de punicalagin (PUG), qui ont été observés pour bloquer efficacement l'infection CVA16⁹, sont utilisés comme exemples d'agents inhibiteurs candidats. Pour les principes de base dans les techniques de virologie, la propagation du virus, la détermination du titre de virus, et les concepts d'unités de formation de plaque (PFU) ou la multiplicité de l'infection (MOI), le lecteur est renvoyé à la référence¹⁰.

1. Culture cellulaire, Préparation des virus, Préparation des composés et Cytotoxicité composée

1. Les cellules de rhabdomyosarcome humain (RD) sont des cellules d'hôte permissives à l'infection de CVA16^11. Cultivez les cellules RD dans 10 ml du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 200 u/mL de pénicilline G, 200 g/mL de streptomycine et 0,5 g/mL d'amphotéricine B en T-75 flasks à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 %.
2. Préparer CVA16 en propageant le virus dans les cellules RD et déterminer le titer viral dans PFU/mL. Pour un protocole optimisé, veuillez consulter la référence¹¹.
3. Préparer les composés d'essai et les contrôles à l'aide de leurs solvants respectifs : par exemple, dissoudre le CHLA et le PUG dans le sulfoxide de diméthyle (DMSO). Pour toutes les étapes d'infection, le milieu basal s'est composé de DMEM plus 2% FBS et antibiotiques.
   REMARQUE: La concentration finale de DMSO dans les traitements composés d'essai est égale ou inférieure à 0,25% dans les expériences; 0,25% DMSO est inclus comme un traitement de contrôle négatif dans les essais à des fins de comparaison.
4. Effectuer l'essai de cytotoxicité des composés d'essai sur les cellules de RD utilisant un réactif déterminant de viabilité de cellules tel que XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxyde). Pour un protocole détaillé, veuillez consulter la référence¹². Déterminer les concentrations de cytotoxicité des composés d'essai à l'aide d'un logiciel d'analyse tel que GraphPad Prism selon le protocole du fabricant. Des concentrations de médicaments qui n'influencent pas de façon significative la viabilité des cellules (95 % des cellules viables) sont utilisées pour le reste de l'étude.

2. Temps d'addition de drogue (Test d'avertissement)

1. Évaluer l'influence des médicaments sur les cellules hôtes avant l'infection virale (prétraitement)
   1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 10⁵ cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 % pour obtenir une monocouche.
   2. Traiter les cellules RD avec des composés d'essai à des concentrations non cytotoxiques (déterminées à partir de l'étape 1,4) dans 1 ml de volume de support basal pendant 1 h ou 4 h.
   3. Laver les cellules avec 1-2 ml de PBS avant d'ajouter 50 PFU/puits de virus dans le milieu basal (volume final de l'inoculum est de 300 l) pendant 1 h. Rock la plaque toutes les 15 minutes.
   4. Après l'infection, laver à nouveau les monocouches à l'aide de PBS, puis superposer avec 1 ml de support basal contenant 0,8 % de méthylcellulose pour une incubation ultérieure à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 %.
   5. Après 72 h d'incubation, retirer le support de la refaçon et laver les puits à l'aide de 2 ml de PBS.
   6. Fixer les puits à l'aide de 0,5 ml de formaldéhyde à 37 % pendant 15 min.
   7. Retirez le supernatant et lavez-le à nouveau à l'aide de PBS.
   8. Tainer les puits en utilisant 0,5 ml de solution violette cristalline de 0,5%. Retirez ensuite la solution de tache dans les 2 minutes et lavez les puits avec un doux jet d'eau avant le séchage à l'air.
   9. Comptez les plaques virales en plaçant la plaque sur une boîte à lumière blanche. Calculer le pourcentage (%) Infection CVA16 comme suit: (Moyenne du virus de la plaque _/ Moyenne de contrôle du virus de la plaque _DMSO) - 100%.
2. Évaluer l'effet de l'ajout simultané des médicaments et du virus (co-addition)
   1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 10⁵ cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 % pour obtenir une monocouche.
   2. Traiter simultanément les cellules RD avec les composés d'essai aux concentrations appropriées et 50 PFU/puits de CVA16 (le volume final de l'inoculum est de 300 l) simultanément pendant 1 h. Rock la plaque toutes les 15 min.
   3. Laver les cellules avec 1 ml de PBS, puis superposer avec 1-2 ml de support basal contenant 0,8% de méthylcellulose pour une incubation ultérieure à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5%.
   4. Tachez les plaques virales avec le violet de cristal après 72 h après l'infection et déterminez l'infection cVA16% comme décrit ci-dessus.
3. Évaluer l'effet du traitement médicamenteux après l'entrée virale (post-infection)
   1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 10⁵ cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 % pour obtenir une monocouche.
   2. Inoculer les cellules RD avec 50 PFU/puits de CVA16 (volume final de l'inoculum est de 300 l) pendant 1 h. Rock la plaque toutes les 15 min.
   3. Laver les puits avec 1-2 ml de PBS et superposer les cellules avec un support basal contenant 0,8% de méthylcellulose et les concentrations appropriées de composés d'essai.
   4. Tachez les plaques virales avec de la violette cristalline et comptez après 72 h après l'infection et déterminez les % d'incubations d'infections CVA16 décrites ci-dessus.
      REMARQUE: Effectuer tous les lavages PBS doucement pour éviter de soulever les cellules.

3. Flow Cytometry-based Binding Assay

1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 10⁵ cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 % pour obtenir une monocouche.
2. Pré-réfrigérer la monocouche cellulaire à 4 oC pendant 1 h.
3. Infecter les cellules RD avec cVA16 (MOI 100) en présence et en absence des composés d'essai pendant 3 h à 4 oC.
   REMARQUE: Effectuer l'inoculation virale sur la glace et l'incubation qui s'ensuit dans un réfrigérateur de 4 oC pour maintenir la température à 4 oC, ce qui permet une liaison virale, mais pas l'entrée.
4. Enlever l'inoculum du virus et laver une fois avec 1-2 ml de PBS glacé.
5. Soulevez les cellules en ajoutant 1 ml de tampon de dissociation glace-froid aux puits sur glace pendant 3 min, avant de recueillir les cellules et de les suspendre dans un tampon de cytométrie à débit froid (1x PBS plus 2 % de FBS).
6. Laver les cellules deux fois à l'aide du tampon de cytométrie à débit froid et fixer les cellules avec 0,5 ml de paraformaldéhyde de 4 % pendant 20 min sur glace.
7. Laver les cellules à l'aide de PBS pour éliminer les virus non liés ou faiblement liés, puis tacher les cellules avec 1 ml d'anticorps anti-VP1 (1:2,000; dilué en PBS contenant 3% bSA) sur la glace pendant 1 h, suivie d'une incubation avec un secondaire Alexa 488-conjugué anti-souris IgG (1:250; dilué en PBS contenant 3 % de BSA) sur la glace pendant 1 h. Effectuer des lavages PBS (3 fois) après chaque traitement d'anticorps.
8. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml du tampon de cytométrie de l'écoulement de glace et effectuer une analyse de cytométrie d'écoulement sur un cytomètre d'écoulement en utilisant des procédures standard. Présenter des données dans les histogrammes à l'aide du logiciel associé et quantitate pour la représentation graphique à barres.

4. Inactivation virale Dis

1. Effectuer l'inactivation virale comme précédemment décrit¹² en utilisant les conditions suivantes:
   - Concentration de départ de 10⁶ PFU/mL de CVA16.
   - monocouches de cellules RD dans des plaques de 12 puits à partir d'une densité d'ensemencement de 2 x 10⁵ cellules/puits.
   - dilution 50 fois plus diluée pour titrer les composés médicamenteux, ce qui entraîne une concentration finale du virus de 50 PFU/puits.
   - Laver les étapes à l'aide de 1-2 ml de PBS.
   - Couverture des supports contenant 0,8 % de méthylcellulose.
2. Effectuer la lecture finale de l'infection virale en utilisant la coloration violette de cristal de la procédure de plaques virales comme détaillé ci-dessus.

5. Analyse moléculaire de l'amarrage

1. Téléchargez des molécules 3D de composés d'essai de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Si les molécules n'ont pas de structure 3D téléchargée, téléchargez les structures 2D ou utilisez la séquence de cordes SMILES et transformez-les en molécules 3D via un programme moléculaire (p. ex. CORINA).
2. Téléchargez l'unité d'assemblage biologique virale de RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) et préparez le modèle de structure virale à l'aide d'un programme de bioinformatique (p. ex. LA chimère de l'UCSF). Par exemple, dans le cas de la structure de cristal de virion mature CVA16 (PDB : 5C4W)³, supprimer les solvants du fichier PDB, remplacer les chaînes latérales incomplètes à l'aide des données de la bibliothèque Rotamer Dunbrach 2010, et ajouter des hydrogènes et des charges à la structure comme précédemment signalé¹³. Les cibles d'amarrage peuvent être toutes les protéines virales pertinentes pour l'analyse prévue avec une information d'assemblage biologique (Banque de données de protéines).
3. Les composés de test de dock sur l'unité de virus préparée utilisant par exemple la chimère d'UCSF, et analysent les fichiers de sortie avec un logiciel de visualisation (par exemple, Autodock Vina, PyMol) :
   1. Téléchargez le fichier composé de test dans la chimère de l'UCSF en tant que «ligand» et effectuez l'amarrage à l'aveugle en sélectionnant la protéine virale préparée en tant que « récepteur ». Utilisez la souris d'ordinateur ou le trackpad pour redimensionner le volume de recherche à l'ensemble du « récepteur ». Dans les « options avancées », permettre au nombre de modes de liaison d'être au maximum. Les cadres d'amarrage seront automatiquement classés de l'énergie de liaison la plus élevée à la plus faible.
   2. (Facultatif) Plus loin à l'amarrage aveugle, confinez le site d'amarrage à la protéine virale dans les régions d'intérêt dérivées des résultats d'amarrage à l'aveugle à l'aide de la souris ou du trackpad à nouveau pour réduire le volume de recherche (p. ex., 100 x 100 x 100). Cette étape permet de confirmer les résultats d'amarrage à l'aveugle et augmente la spécificité.
   3. Utilisez un système graphique moléculaire (p. ex. PyMol) pour analyser les positions des modes de liaison en téléchargeant le fichier d'amarrage. Trouvez des contacts polaires du composé à la protéine virale en sélectionnant le «ligand» et en identifiant les contacts polaires avec l'option «à tous les atomes»; examiner les résultats.

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Résultats

L'exemple de l'heure d'ajout de drogue est indiqué à la figure 1 et montre l'influence du traitement à l'aide des petites molécules CHLA et PUG sur l'infection cVA16 soit pré-virale (prétraitement), lors de l'entrée virale (co-addition), ou post-virale entrée ( post-infection). Les deux petites molécules n'ont produit qu'un impact marginal contre l'infectiosité CVA16, que ce soit dans le prétraitement des cellules hôtes avant l'infection virale (<...

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Discussion

Dans ce rapport, nous avons décrit les protocoles qui sont utiles pour l'identification des candidats antiviraux qui ciblent l'entrée virale, en particulier contre le CVA16 non enveloppé. Les essais sont conçus de manière à disséquer les premiers événements lors de l'entrée virale, ce qui est utile pour clarifier le mécanisme d'action et les cibles potentielles de l'activité antivirale des agents d'essai. L'« analyse de l'heure de l'ajout de médicaments » permet de déterminer de façon générale la cible...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco