Modèle murine de l'impact cortical contrôlé pour l'induction des dommages traumatiques de cerveau

Résumé

Ici nous décrivons un protocole pour l'induction des dommages de cerveau traumatiques murins par l'intermédiaire d'un impact cortical contrôlé à tête ouverte.

Résumé

Les Centers for Disease Control and Injury Prevention estiment que près de 2 millions de personnes subissent un traumatisme crânien (TBI) chaque année aux États-Unis. En fait, l'ITC est un facteur contributif à plus d'un tiers de toute la mortalité liée aux blessures. Néanmoins, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la pathophysiologie de tBI sont mal compris. Ainsi, les modèles précliniques de TBI capables de reproduire les mécanismes de blessure pertinents au TBI dans les patients humains sont un besoin critique de recherche. Le modèle d'impact cortical contrôlé (ICC) de TBI utilise un dispositif mécanique pour avoir un impact direct sur le cortex exposé. Bien qu'aucun modèle ne puisse récapituler complètement les modèles disparates de dommages et la nature hétérogène de TBI dans les patients humains, CCI est capable d'induire un large éventail de TBI médicalement applicable. De plus, l'ICC est facilement normalisée, ce qui permet aux chercheurs de comparer les résultats entre les expériences et entre les groupes d'enquête. Le protocole suivant est une description détaillée de l'application d'un CCI sévère avec un dispositif d'impact disponible dans le commerce dans un modèle murine de TBI.

Introduction

Les Centers for Disease Control and Injury Prevention estiment qu'environ 2 millions d'Américains subissent une lésion cérébrale traumatique (TBI) chaque année^1,2. En fait, TBI contribue à plus de 30% de tous les décès liés aux blessures aux États-Unis avec des coûts de soins de santé près de 80 milliards de dollars par an et près de 4 millions de dollars par personne et par an survivant à une grave TBI^3,4,5. L'impact de TBI est accentué par les complications neurocognitives et neuropsychiatriques à long terme significatives souffertes par ses survivants avec le début insidieux des déficiences comportementales, cognitives, et motrices appelées encéphalopathie traumatique chronique (Etc) ⁶ Annonces ^{, 7 Annonces , 8 Annonces , 9} (en) ^{, 10}. Même les événements de concussive subcliniques— ces impacts qui n'entraînent pas de symptômes cliniques — peuvent conduire à un dysfonctionnement neurologique à long terme^11,12.

Des modèles animaux pour l'étude de TBI ont été employés depuis la fin des années 1800¹³. Dans les années 1980, un impacteur pneumatique destiné à modéliser tBI a été développé. Cette méthode est maintenant appelée impact cortical contrôlé (ICC)¹⁴. Le contrôle et la reproductibilité de l'ICC ont amené les chercheurs à adapter le modèle pour une utilisation chez les rongeurs¹⁵. Notre laboratoire utilise ce modèle pour induire tBI via un impacteur disponible dans le commerce et un dispositif d'actionnement électronique^16,17. Ce modèle est capable de produire un large éventail d'états TBI cliniquement applicables en fonction des paramètres biomécaniques utilisés. L'évaluation histologique des cerveaux de TBI après une blessure grave induite dans notre laboratoire démontre la perte corticale et hippocampal ipsilateral significative aussi bien que l'odème contralatéral et la distorsion. En outre, l'ICC produit une altération constante de la fonction motrice et cognitive mesurée par des tests comportementaux¹⁸. Les limites de l'ICC comprennent le besoin de craniotomie et les dépenses d'acquisition de l'impacteur et de l'appareil d'actionnement.

Plusieurs modèles supplémentaires de TBI existent et sont bien établis dans la littérature, y compris le modèle de percussion fluide latéral, modèle de chute de poids, et le modèle de blessure de souffle^19,20,21. Bien que chacun de ces modèles aient leurs propres avantages distincts, leurs principaux inconvénients sont les blessures mixtes, la mortalité élevée et l'absence de normalisation, respectivement²². De plus, aucun de ces modèles n'offre la précision, la précision et la reproductibilité de l'ICC. En ajustant les paramètres biomécaniques de l'entrée dans le dispositif d'actionnement, le modèle CCI permet à l'enquêteur de contrôler avec précision la taille de la blessure, la profondeur de la blessure et l'énergie cinétique appliquée au cerveau. Cela donne aux chercheurs la possibilité d'appliquer l'ensemble du spectre de tBI à des zones spécifiques du cerveau. Il permet également la plus grande reproductibilité de l'expérience à l'expérience.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. Les souris C57BL/6 ont été achetées au Jackson Laboratory et au groupe logés dans une installation de barrière au Center for Comparative Medicine de l'Université Northwestern (Chicago, IL). Tous les animaux étaient logés dans un cycle clair/sombre de 12/12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l'eau.

1. Induire l'anesthésie

1. Anesthésiez la souris à la kétamine (125 mg/kg) et à la xylazine (10 mg/kg) injectées par voie intrapéritone.

2. Signes vitaux surveillant toutes les 15 min

1. Surveillez la température, la fréquence respiratoire et la couleur de la peau. La souris doit se sentir chaude au toucher. La peau doit apparaître rose et bien perfused. Le taux respiratoire devrait varier de 50 à 70 respirations par minute.

3. Procédures préchirurgicales

1. Peser toutes les souris le jour précédant l'induction des blessures.
2. Stériliser un ensemble d'instruments chirurgicaux en autoclantant pour chaque sujet expérimental. Stériliser le dispositif d'impact avant utilisation.
3. Préparer une cage de récupération en plaçant une cage propre sur un coussin chauffant électrique réglé à "faible" réglage et positionné d'une manière que les souris peuvent s'éloigner de la chaleur une fois ambulatoire.
4. Installez le bloc opératoire dans une hotte stérilisée à flux laminaire.
   1. Placez le cadre de fonctionnement stéréotaxique.
   2. Fixez l'appareil d'impact au cadre stéréotaxique.
   3. Définiz le dispositif d'actionnement avec les paramètres biomécaniques souhaités pour la vitesse et le temps d'occupation.
      REMARQUE : Dans ce protocole une lésion cérébrale grave est décrite utilisant une pointe d'impact de 3 millimètres de diamètre par l'intermédiaire d'une craniectomy de 5 millimètres de diamètre avec la vitesse fixée à 2.5 m/s et un temps d'occupation de 0.1 s. Un large éventail de paramètres biomécaniques peut être utilisé pour induire tout le spectre de TBI.
5. Enfilez de nouveaux équipements de protection individuelle et des gants stériles.
6. Raser la fourrure du site opératoire à l'aide de tondeuses électriques.
7. Appliquer une pommade opthalmique protectrice sur les yeux de la souris pour prévenir les blessures cornéennes et le séchage.
8. Placez la souris dans le bloc opératoire.
9. Préparer la peau avec un gommage chirurgical à base d'iode alterné avec de l'alcool trois fois.

4. Application d'un impact cortical contrôlé

1. Inciser le cuir chevelu 1 cm dans la ligne médiane avec un scalpel exposant le crâne.
2. Placez la souris dans un cadre de fonctionnement stéréotaxique en fixant les os temporels bilatéraux entre les barres d'oreilles miniatures et en verrouillant les incisifs à l'intérieur d'une pince incisif créant une retenue stable à trois points sur la tête de la souris.
3. Retirez le cuir chevelu loin du site opératoire avec un hemostat ou des forceps de verrouillage pour s'assurer que le cuir chevelu n'entre pas en contact avec le bit de forage pendant craniectomy.
4. Identifiez les sutures sagittales et coronales sur le crâne exposé.
   REMARQUE : Ce protocole centre la craniectomy 2 mm gauche de la suture sagittale et 2 mm rostral à la suture coronale.
5. Effectuer une craniectomy à l'aide d'une perceuse avec un peu de perceuse de trephine.
   1. Pour effectuer la craniectomy, activez d'abord la perceuse à la vitesse maximale et puis appliquez le bit perpendiculaire de perpendiculaire de perpendinence de trephine au crâne au site de craniectomy.
   2. Appliquer une pression douce et uniforme sur la perceuse une fois que le contact est fait avec le crâne. Un léger "donner" sera ressenti une fois que la perceuse pénètre à travers le crâne. Ne pénétrez pas dans la dura sous-jacente.
      REMARQUE : Ce protocole utilise un morceau de perceuse de trephine de 5 mm pour effectuer la craniectomy.
6. Utilisez des forceps et une petite jauge aiguille hypodermique pour enlever le lambeau d'os, exposant entièrement le dura mater sous-jacent.
7. Faites pivoter la pointe de l'impacteur dans le champ opératoire et abaissez-le jusqu'à ce qu'il entre en contact avec le dura mater exposé. Une fois le contact effectué, le capteur de contact de l'instrument donnera une tonalité audible pour avertir le chirurgien que le contact a été fait. Cela marquera le point zéro à partir duquel la profondeur de déformation est fixée.
   REMARQUE : Ce protocole utilise une pointe d'impact de 3 mm pour générer une blessure grave. Des conseils aussi petits que 1 mm peuvent être utilisés pour appliquer des blessures plus localisées.
8. Retirez la pointe d'impact et fixez la profondeur d'impact désirée en abaissant la position de l'impacteur sur le cadre stéréotaxique.
   REMARQUE : Dans ce protocole nous décrivons une blessure grave en réglant la profondeur de déformation à 2 millimètres.
9. Appliquer la blessure en activant l'impacteur sur le dispositif d'actionnement.
10. Faites pivoter le dispositif d'impact hors du champ et retirez l'animal du cadre stéréotaxique.

5. Fermeture du site chirurgical

1. Contrôlez le saignement du crâne et la surface corticale blessée avec la pression directe d'un applicateur stérile de pointe de coton.
2. Séchez le crâne à l'' instauration d'un applicateur stérile à pointe de coton.
3. Fermez le cuir chevelu au-dessus de la craniectomie à l'aide d'un adhésif chirurgical disponible dans le commerce ou d'une suture monofilament.
   REMARQUE : Dans ce protocole, un adhésif chirurgical vétérinaire est utilisé pour fermer le cuir chevelu. Le lambeau osseux n'est pas remplacé et est jeté.

6. Soins et surveillance postopératoires

1. Administrer l'analgésie postopératoire (p. ex., buprénorphine à libération prolongée 0,1 à 0,5 mg/kg administrée sous-cutanée fournissant 72 h d'analgésie soutenue).
2. Placer l'animal dans la position latérale de récupération decubitus dans une cage propre et réchauffée.
3. Observez les animaux jusqu'à ce qu'ils soient éveillés et mobiles, puis retournez chaque souris dans sa cage d'origine.
4. Assurer un accès gratuit à la nourriture et à l'eau. La consommation normale de nourriture et d'eau reprend généralement dans les une à deux heures suivant la blessure.
5. Mesurez le poids corporel tous les trois jours tout au long de l'expérience.

Résultats

L'impacteur se monte directement sur le cadre stéréotaxique permettant jusqu'à 10 m de résolution pour le contrôle du point d'impact, de la profondeur et de la pénétration. Les forces électromagnétiques utilisées peuvent donner des vitesses d'impact allant de 1,5 à 6 m/s. Cela permet une précision et une reproductibilité inégalées sur l'ensemble de la gamme de TBI cliniquement pertinents. Les chercheurs peuvent mener des expériences pilotes modifiant les paramètres de blessures tels que la taille de la p...

Discussion

Il y a plusieurs étapes qui sont essentielles pour appliquer une blessure fiable et cohérente. Tout d'abord, la souris doit atteindre un plan profond d'anesthésie chirurgicale assurant aucun mouvement pendant la performance de la craniectomy. Tandis que de nombreux régimes anesthésiques peuvent être employés pour induire l'anesthésie générale chez les rongeurs, les anesthésiques qui induisent la dépression respiratoire telle que les anesthésiques inhalés peuvent avoir comme conséquence l'arrêt respiratoir...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50