Un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires

Résumé

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole simple pour étudier la croissance neurite dans les neurones corticaux embryonnaires de rat en co-transfectant avec l'EGFP et la protéine d'intérêt.

Résumé

La croissance neurite est un événement fondamental dans la formation des circuits neuronaux pendant le développement du système nerveux. Les dommages graves de neurite et le dysfonctionnement synaptique se produisent dans diverses maladies neurodegenerative et dégénérescence relative à l'âge. L'étude des mécanismes qui règlent la croissance de neurite jetterait non seulement la lumière valable sur des processus développementals de cerveau mais également sur de tels désordres neurologiques. En raison de la faible efficacité de transfection, il est actuellement difficile d'étudier l'effet d'une protéine spécifique sur la croissance neurite chez les neurones mammifères primaires. Ici, nous décrivons une méthode simple pour l'étude de la croissance de neurite par la co-transfection des neurones corticaux primaires de rat avec EGFP et une protéine d'intérêt (POI). Cette méthode permet d'identifier les neurones transfectés POI par le signal EGFP, et ainsi l'effet de l'IPI sur la croissance neurite peut être déterminé avec précision. Cet exemple d'EGFP fournit une approche pratique pour l'étude des voies régulant la croissance neurite.

Introduction

Les neurites, y compris les axones et les dendrites, sont les projections des neurones impliqués dans l'établissement des réseaux neuronaux. La croissance dynamique des neurites est essentielle au neurodéveloppement. Cependant, les mécanismes de réglementation sous-jacents restent flous. En particulier, des dommages de neurite sont souvent observés dans diverses maladies neurodegenerative et après des dommages de cerveau^1. Par conséquent, l'étude des rôles des molécules putatives dans diverses voies réglementaires de croissance neurite améliorerait notre compréhension du processus. En outre, il peut révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour divers désordres neurologiques. Les lignées cellulaires neuronales sont des modèles précieux pour l'étude des processus neuronaux, y compris la croissance neurite car ils sont faciles à manipuler et transfect^2,3. Cependant, la dérive génétique a été rapportée pour se produire dans quelques lignées de cellules couramment utilisées, qui pourraient mener aux variations dans leurs réponses physiologiques^4. En outre, l'expression différentielle de protéine a été montrée entre des lignes neuronales de cellules et des neurones primaires. Par exemple, PC12, une lignée cellulaire neuronale dérivée de la glande surrénale rat qui est largement utilisé pour étudier la croissance neurite^2,3, n'exprime pas les récepteurs NMDA⁵. En outre, il a été proposé que la réactivité réduite de la ligne de neuroblastome de souris neuro-2a aux neurotoxines par rapport aux neurones primaires est due au manque d'expression de certains récepteurs de membrane et canaux d'ion^6. Par conséquent, les neurones primaires sont un modèle plus souhaitable et représentatif pour l'étude de la croissance neurite. Cependant, l'utilisation des neurones primaires est entravée par leur faible efficacité de transfection⁷.

Ici, nous décrivons une méthode qui implique la co-transfection de la protéine d'intérêt (POI) et de l'EGFP aux neurones corticaux primaires de rat. L'EGFP agit comme un marqueur morphologique pour l'identification des neurones transfectés avec succès et permet de mesurer les neurites. Nous avons validé cette méthode en utilisant des composés/molécules qui ont été rapportés pour moduler la croissance de neurite. En outre, FE65, une protéine adaptatrice neuronale qui a été montrée pour stimuler la croissance neurite, a été employée pour illustrer cette approche^8,9. Ce protocole implique (1) l'isolement des neurones corticaux primaires des embryons embryonnaires de rat 18 (E18), (2) la co-transfection des neurones avec EGFP et le POI (FE65 dans cette étude) et (3) l'imagerie et l'analyse des neurones en utilisant le traitement de l'image logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ^10,11.

Protocole

Toutes les procédures suivies étaient conformes aux normes éthiques du comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université chinoise de Hong Kong.

1. Préparation des fiches de couverture

1. Placez un bordereau circulaire stérile de 18 mm dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire de 12 puits.
2. Enrober la couverture d'une solution poly-Lysine de 5 g/mL dans un incubateur humidifié de 37 oC pendant au moins 1 h.
3. Aspirez la solution poly-D-lysine de la plaque de culture tissulaire et rincez les couvertures enduites une fois avec de l'eau stérile.

2. Dissection embryonnaire de neurone de rat

1. Sacrifiez un rat Sprague-Dawley au moment où il est enceinte à l'âge gestationnel de 18 jours (E18) par luxation cervicale ou asphyxie au CO_2.
   REMARQUE: S'il vous plaît vérifier les règlements locaux pour le sacrifice des rats enceintes.
2. Ouvrez la cavité abdominale du rat enceinte avec des ciseaux disséquants et transférez l'utérus dans un plat Petri de 10 cm.
3. Ouvrez soigneusement l'utérus et le sac amniotique avec de petits ciseaux disséquants et retirez le placenta de l'embryon de rat à l'aide de petits ciseaux disséquants. Transférer l'embryon entier dans un plat Petri de 10 cm avec du phosphate tamponné préréfrigéré, complété par du glucose (PBS-glucose, 10 mM de phosphates de sodium, 2,68 mM de chlorure de potassium, 140 mm de chlorure de sodium et 3 g/L de glucose) à l'aide d'une paire de petits forceps.
4. Couper le long de la suture sagittale du crâne et l'ouvrir soigneusement avec une paire de petits ciseaux disséquants. Transférer le cerveau embryonnaire à l'eau avec une petite spatule plate dans un plat Petri de 10 cm avec du PBS-glucose glacé.
5. Séparez les deux hémisphères cérébraux du cervelet et du tronc cérébral à l'aide de deux pinces #5 sous un microscope à dissection.
   REMARQUE: Veuillez consulter la référence¹² pour la structure du cerveau du rat.
6. Retirer les méninges à l'aide de la pince à épiler #5.
7. Isolez le cortex des hémisphères cérébraux avec deux pinces #5 droites.
8. Transférer le cortex isolé au PBS-glucose glacé dans un tube centrifugeur de 15 ml.

3. Culture primaire de neurones corticales

REMARQUE: Toutes les procédures aux étapes 3 et 4 sont effectuées à l'intérieur d'un coffret de biosécurité de classe II.

1. Régler le cortex isolé par gravité à 4 oC pendant 5 min et aspirer le PBS-glucose.
2. Ajouter 1 ml de 0,05 % de trypsine-EDTA au cortex isolé et mélanger délicatement en tapant et incuber le tissu dans un bain d'eau de 37 oC pendant 10 min pour permettre une digestion enzymatique. Appuyez doucement sur le tube pour mélanger toutes les 2 minutes.
3. Ajouter 4 ml de milieu d'entretien (p. ex., Neurobasal Medium) au mélange tissu/trypsine.
   REMARQUE: Tout le support d'entretien utilisé dans ce protocole est complété par la pénicilline-Streptomycine et B-27 supplément¹³.
4. Dissocier doucement le tissu par trituration à l'aide d'une pipette de 1 ml.
5. Pelleter les cellules dissociées par centrifugation à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant.
6. Répétez les étapes 3,5 à 3,7 deux fois.
7. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu d'entretien.
8. Ajouter 10 L de 0,4% de solution Trypan Blue à 10 l de suspension cellulaire pour le comptage des cellules viables par un hémocytomètre.
9. Plaquer les neurones à une densité de 65 000/cm² (cellules viables) dans 1 ml de milieu d'entretien par puits dans une plaque de 12 puits.

4. Transfection et fixation cellulaires

1. À 2 jours in vitro (DIV2), transfect 0.5 'g de la construction d'EGFP (pEGFP-C1) aux neurones ensemble avec ou sans de 0.5 'g de POI en utilisant 1 'L de réactif de transfection (par exemple, Lipofectamine 2000). Utilisez les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Des constructions d'expression de mammifères ont été préparées en utilisant un kit libre de préparation de plasmide d'endotoxine. Le traitement avec des produits chimiques/molécules (dans ce manuscrit cytochalasin D (Cyto D) et facteur de croissance de nerf (NGF) ont été employés) peut être fait à 6 h après transfection.
2. Aspirer le milieu de culture 24 h après la transfection et laver les cellules transfectées une fois avec 37 OC de PBS (10 mM de phosphates de sodium, 2,68 mM de chlorure de potassium, 140 mM de chlorure de sodium).
3. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde en PBS pendant 10 min dans l'obscurité à température ambiante.
4. Laver les cellules fixes trois fois avec DU PBS.
5. Ajouter un minimum de milieu de montage de fluorescence sur une lame de verre de microscope. Transférer délicatement la plaque de couverture de la plaque de 12 puits sur le support de montage avec l'échantillon face à la glissière de verre.
   REMARQUE: Scellez le bord de la glissière avec du vernis à ongles si un milieu de montage aqueux est utilisé.

5. Mesure de la croissance neurite

1. Utilisez un objectif 40x pour capturer des images à l'aide d'un microscope épifluorescent.
2. Capturez des images d'au moins 40 neurones intacts avec le signal EGFP par transfection.
3. Ouvrez l'image capturée dans le logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ¹¹ pour mesurer la longueur de la plus longue neurite, du corps cellulaire à la pointe du cône de croissance, de chaque neurone image.
4. Analyser les données obtenues avec le logiciel pour déterminer l'effet des protéines ciblées dans la croissance neurite.

Résultats

Pour tester cette méthodologie, nous avons utilisé Cyto D et facteur de croissance nerveuse NGF, qui ont été montrés pour inhiber et stimuler la croissance neurite respectivement^14,15,16. La longueur neurite des neurones transfectés avec EGFP ont été mesurées après traitement avec Cyto D ou NGF. L'efficacité de transfection de l'EGFP aux neurones était de 2,7 % (1 068 neurones compté...

Discussion

Comme indiqué précédemment, PC12 et ses sous-clones sont largement utilisés pour étudier l'extension de neurite parce qu'ils ont une excellente efficacité de transfection^2,3. En revanche, les neurones primaires ont un faible taux de transfection, qui est un obstacle majeur pour l'étude des régulateurs de croissance neurite par transfection⁷. Ici, nous décrivons un protocole commode pour quantifier la croissance de neurite dans les...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061