Méthode d'électroporation pour la livraison in vivo de l'ADN de Plasmid dans le Telencephalon adulte de poisson zèbre

Résumé

Présenté ici est une méthode d'électroporation pour la livraison d'ADN plasmide et l'étiquetage des cellules épendymogliales dans le téncephalon de poisson zèbre adulte. Ce protocole est une méthode rapide et efficace pour visualiser et tracer les cellules ependymoglial individuelles et ouvre de nouvelles possibilités d'appliquer l'électroporation à un large éventail de manipulations génétiques.

Résumé

L'électroporation est une méthode de transfection dans laquelle un champ électrique est appliqué aux cellules pour créer des pores temporaires dans une membrane cellulaire et augmenter sa perméabilité, permettant ainsi l'introduction de différentes molécules dans la cellule. Dans cet article, l'électroporation est utilisée pour introduire des plasmides aux cellules éparymogliales, qui tapissent la zone ventriculaire du ténaudif zèbre adulte. Une fraction de ces cellules montre des propriétés de cellules souches et génère de nouveaux neurones dans le cerveau du poisson zèbre; par conséquent, l'étude de leur comportement est essentielle pour déterminer leurs rôles dans la neurogenèse et la régénération. L'introduction de plasmides par électroporation permet l'étiquetage à long terme et le suivi d'une seule cellule éparymoglial. En outre, les plasmides tels que Cre recombinase ou Cas9 peuvent être livrés à des cellules éparymogliales uniques, ce qui permet la recombinaison ou l'édition de gènes et offre une occasion unique d'évaluer la fonction génétique autonome de la cellule dans un système contrôlé, naturel l'environnement. Enfin, ce protocole détaillé d'électroporation étape par étape est utilisé pour obtenir l'introduction réussie des plasmides dans un grand nombre de cellules éparymogliales simples.

Introduction

Les poissons zèbres sont d'excellents modèles animaux pour examiner la régénération du cerveau après une blessure au couteau. Par rapport aux mammifères, sur l'échelle évolutive, les espèces moins évoluées telles que le poisson zèbre montrent généralement des taux plus élevés de neurogenèse constitutive et de zones plus larges de résidence de cellules souches neurales adultes, conduisant à la génération constante de nouveaux neurones tout au long la plupart des zones du cerveau dans la vie adulte. Cette caractéristique semble être en corrélation avec la capacité régénératrice significativement plus élevée du poisson zèbre par rapport aux mammifères¹, car le poisson zèbre a un potentiel remarquable pour générer efficacement de nouveaux neurones dans la plupart des modèles de lésions cérébrales étudiés^{2, 3,4,5,6,7,8}. Ici, le ténèbre telencephalon est étudié, car il s'agit d'une zone du cerveau avec une neurogenèse proéminente à l'âge adulte. Ces zones de neurogenèse adulte sont homologues aux zones neurogènes dans le cerveau des mammifères adultes^9,10,11.

Les zones neurogènes abondantes dans le téencéphale de poisson-zèbre sont présentes en raison de l'existence de gliales radiales comme les cellules ou les cellules d'éparymoglia. Les cellules ependymoglial agissent en tant que cellules souches neurales adultes résidentes et sont responsables de la génération de nouveaux neurones dans le cerveau intact et régénérant^3,5. Les expériences de traçage de lignée ont montré que les éparggies ventriculaires réagissent aux blessures, puis prolifèrent et génèrent de nouveaux neuroblastes qui migrent vers le site de lésion⁵. En raison de la nature everted du téleencéphalon de poisson-zèbre, les cellules ependymoglial tapissent la surface ventriculaire et construisent la paroi ventriculaire ventrale. La paroi ventriculaire dorsal est formée par une couche cellulaire ependymale dorsal (Figure 1A). Fait important, le poisson zèbre ependymoglia incarne les caractéristiques des cellules radiales et des cellules éparymatiques des mammifères. Les longs processus radiaux sont une caractéristique typique des cellules de la gliale radiale, tandis que les extensions cellulaires et les jonctions serrées (ainsi que leurs positions ventriculaires) sont des caractéristiques typiques des cellules éparymales^12,13,14. Par conséquent, ces cellules sont appelées cellules éparymoglial.

Pour suivre le comportement in vivo des cellules ependymoglial simples pendant la régénération, elles doivent être étiquetées de manière fiable. Diverses méthodes d'étiquetage cellulaire in vivo pour la microscopie fluorescente ont déjà été décrites, telles que les reporters endogènes ou les colorants lipophiles¹⁵. Ces méthodes, contrairement à l'électroporation, peuvent nécessiter de plus longues périodes de temps et souvent n'offrent pas la possibilité d'étiquetage à cellule unique ou de traçage permanent à long terme. L'électroporation, cependant (en plus de l'étiquetage à cellule unique), offre la possibilité d'introduire un nouvel ADN dans la cellule hôte. En outre, par rapport à d'autres méthodes de transfert d'ADN dans les cellules, l'électroporation a été démontrée comme l'une des méthodes les plus efficaces^16,17,18,19.

Présenté ici est un protocole d'électroporation qui a été affiné dans le but d'étiqueter les cellules ependymoglial unique dans le ténencéphale de poisson zèbre adulte. Ce protocole permet l'étiquetage des cellules éparymoglial simples afin de les suivre sur une période à long terme²⁰ ou de manipuler des voies spécifiques d'une manière cellulaire-autonome^21,22.

Protocole

Tous les animaux utilisés dans ce protocole ont été gardés dans des conditions d'élevage standard, et des expériences ont été réalisées conformément aux directives et règlements de manipulation de l'UE et du gouvernement de Haute-Bavière (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. Préparation du mélange de Plasmide pour l'électroporation

1. Diluer le plasmide de l'intérêt pour l'eau stérile et ajouter une solution de bouillon de taches vertes rapides [1 mg/mL]. Assurez-vous que la concentration finale du plasmide est de 1 g/L. Ajouter la tache à une concentration d'au plus 3 %, car son seul but est de colorer la solution et de visualiser l'injection ventriculaire.
2. Une fois préparé, mélanger la solution plasmide en faisant monter et descendre plusieurs fois ou en tapant sur les doigts. Conserver à température ambiante (RT) jusqu'à utilisation.
   REMARQUE: Pour la co-électroporation de deux plasmides dans la même cellule, assurez-vous que la concentration de chaque plasmide individuel utilisé dans le mélange est d'au moins 0,8 ng/L avec un rapport molaire de 1:1 pour obtenir 80% -90% d'efficacité de co-électroporation.

2. Préparations pour la procédure d'injection et d'électroporation

1. Préparer les capillaires en verre (diamètre extérieur 1 mm, diamètre intérieur 0,58 mm) nécessaires à l'injection dans l'appareil de traction de l'aiguille.
2. Afin d'injecter la bonne quantité de plasmide (voir ci-dessus), tirez le capillaire à une température de 68,5 oC avec deux poids légers et deux poids lourds (voir tableau des matériaux pour les spécifications du tireur).
   REMARQUE: Dans le cas où un puller différent est utilisé, calibrer le capillaire pour fournir le volume approprié de mélange d'électroporation.
3. Régler manuellement le dispositif d'injection à une pression d'injection de 200 hPa (en tournant le bouton Pi) et une pression constante de 0 hPa. Régler manuellement le temps d'injection en mode manuel et contrôler la pression avec la pédale.
4. Régler le dispositif d'électroporation en « mode LV » avec cinq impulsions à 54-57 V (25 ms chacun avec 1 s intervalles). Connectez les électrodes à l'appareil.
5. Préparer un aquarium avec de l'eau de poisson propre, où le poisson sera réveillé de l'anesthésie après la procédure d'électroporation. Aérer l'eau en gardant la pierre d'air attachée à la pompe à air pendant toute la période de récupération jusqu'à ce que le poisson soit complètement réveillé.
6. Prendre une éponge de cuisine régulière et faire une coupe longitudinale dans l'éponge pour retenir le poisson pendant la procédure d'injection et d'électroporation (voir la publication précédente³).
   REMARQUE: L'éponge de cuisine doit être lavée ou échangée régulièrement afin d'éliminer les produits chimiques toxiques potentiels.
7. Placez une petite quantité de gel à ultrasons multi-usages hautement conducteur à côté de la configuration d'injection et d'électroporation.
   REMARQUE: Cela assurera une conductivité électrique adéquate et, par conséquent, une distribution des cellules électroporated dans l'ensemble du télencéphale.

3. Anesthésie de poisson zèbre

1. Avant l'anesthésie, préparez une solution de stock d'anesthésie avec 0,2% MS222 dans l'eau distillée et ajustez le pH à 7 avec le tampon Tris-HCl. Diluer ce stock 1:10 (c.-à-d., à 0,02% MS222) en utilisant l'eau de poisson.
2. Anesthésiez les poissons en les gardant dans cette solution de travail jusqu'à ce que le mouvement du corps et des branchies s'estompe (généralement pendant quelques minutes).

4. Injection de solution de Plasmid

1. Remplissez le capillaire en verre préparé avec une solution de plasmide de 10 ll à l'aide de pointes de microchargeur. Évitez la formation de bulles d'air à l'intérieur du capillaire.
2. Appuyez sur Menu/Changer Capillary sur le dispositif d'injection. Insérez et fixez l'aiguille dans le porte-aiguille.
3. Sous un stéréomicroscope avec un grossissement de 3,2x ou 4x, couper seulement la pointe du capillaire à l'aide de forceps fins. Passez le dispositif d'injection du mode Change Capillary en mode Inject, puis appliquez la pression avec une pédale de pied pour s'assurer que la solution de plasmide s'exécute facilement hors de l'aiguille et sans obstacle.
4. Transférer le poisson du réservoir d'élevage au récipient (boîte en plastique) avec une solution anesthésique. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le mouvement des branchies s'estompe.
5. Placer le poisson dans l'éponge pré-humide avec le côté dorsal face vers le haut. Effectuez toutes les étapes d'injection suivantes sous le stéréomicroscope pour assurer l'exactitude de la procédure.
6. À l'aide d'un micro-couteau disséquant en acier inoxydable avec un tranchant de 40 mm et une épaisseur de 0,5 mm, créez un petit trou dans le crâne du poisson du côté postérieur du ténencéphale (figure 1B), juste à côté de la bordure avec tectum optique.
   REMARQUE: Cette étape doit être effectuée avec soin puisque le trou doit être très petit et superficiel, pénétrant uniquement le crâne, pour éviter des dommages au cerveau.
7. Inclinez le poisson au besoin et orientez la pointe du capillaire de verre vers le crâne dans le bon angle pour faciliter la pénétration de la pointe capillaire à travers le trou.
8. Insérez soigneusement la pointe du capillaire à travers le trou du crâne jusqu'à ce qu'il atteigne le ventricule telencéphalique (voir figure 1B). Cela nécessitera une pénétration à travers la couche cellulaire ependymale dorsale. Soyez particulièrement prudent de ne pas insérer le capillaire trop profondément pour éviter le contact avec le tissu cérébral. Gardez le capillaire précisément entre les hémisphères, en restant à l'intérieur du ventricule juste après avoir percé la couche dorsymale dorsal.
   REMARQUE: C'est une étape très délicate. La précision de cette procédure est améliorée en utilisant des lignes mutantes de pigmentation telles que brassy²⁴, permettant une meilleure visualisation de la position capillaire en verre pendant l'injection.
9. Avec la pointe capillaire à l'intérieur du ventricule, injecter la solution plasmide en appliquant une pression avec la pédale du pied pendant environ 10 s, ce qui correspond à environ 1 l de solution plasmide.
   REMARQUE: Si vous modifiez le pulleur d'aiguille, les capillaires ou l'injecteur, le système doit être calibré afin de toujours fournir 1 l de solution plasmide. L'étalonnage peut être effectué en mesurant le diamètre de la gouttelette de plasmide expulsée dans une huile minérale (p. ex. huile de paraffine) et en calculant par la suite le volume de la gouttelette. Après 10 s d'injection, il devrait y avoir 1 l de liquide plasmide expulsé dans l'huile minérale.
10. Confirmer le succès de l'étape précédente en observant la propagation du liquide dans tout le ventricule.

5. Électroporation

1. Retirer le poisson de la mise en place d'injection tout en le tenant dans l'éponge.
2. Immerger le côté intérieur de la pointe des électrodes dans le gel à ultrasons.
3. Couvrir le poisson telencephalon avec une petite quantité de gel à ultrasons.
4. Placez la tête du poisson entre les électrodes, en plaçant l'électrode positive du côté ventral de la tête du poisson et l'électrode négative du côté dorsal (figure 1C), tout en tenant le corps du poisson dans l'éponge. Cela définit la direction du flux du courant nécessaire à l'électroporate épendymoglia positionné à la zone sous-ventriculaire.
5. Appuyez doucement et précisément contre le telencephalon (Figure 1C). Administrer le courant avec la pédale du pied. Maintenez les électrodes en place jusqu'à ce que les cinq impulsions soient terminées.

6. Récupération des poissons

1. Laissez le poisson récupérer dans le réservoir préalablement préparé et continuellement aéré jusqu'à ce qu'il se réveille. Gel de lidocaïne pourrait être appliqué sur le crâne afin de soulager toute douleur éventuellement développée.

Résultats

La méthode d'électroporation décrite permet la livraison de l'ADN plasmide dans les cellules éparymogliales, qui sont situées superficiellement dans le téencéphale de poisson zèbre et juste sous la couche de cellules ependymales dorsales (Figure 1A).

Si le résultat de l'électroporation est positif, les cellules épendymoglial simples étiquetées (cellules rouges dans la figure 2A,...

Discussion

Ce protocole d'électroporation est une méthode in vivo fiable d'étiquetage des cellules ependymoglial individuelles. Le protocole peut avoir besoin d'une autre adaptation pour étiqueter d'autres types de cellules comme les neurones ou les oligodendrocytes. Pour réussir l'étiquetage, des plasmides contenant différents promoteurs peuvent être utilisés. Chicken-bêta actin promoteur, eF1alpha, CMV et ubiquitin promoteur ont déjà été utilisés pour conduire l'expression de différents transgènes dans ependymogl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161