Essai sur place légère pour l'analyse de Drosophila Larval Phototaxis

Résumé

Ce protocole introduit un essai de tache de lumière pour étudier le comportement phototactic larvaire de Drosophila. Dans cet analyse, un point lumineux est généré sous forme de stimulation lumineuse, et le processus d'évitement de la lumière larvaire est enregistré par un système d'imagerie infrarouge à base de lumière.

Résumé

Les larves de Drosophila melanogaster montrent un comportement évident d'évitement de la lumière pendant le stade de la recherche de nourriture. Drosophila larval phototaxis peut être utilisé comme un modèle pour étudier le comportement d'évitement des animaux. Ce protocole introduit un essai de tache de lumière pour étudier le comportement phototactic larvaire. La configuration expérimentale comprend deux parties principales : un système de stimulation visuelle qui génère la tache lumineuse, et un système d'imagerie infrarouge basé sur la lumière qui enregistre le processus d'évitement de la lumière larvaire. Cet analyse permet de suivre le comportement de la larve avant d'entrer, lors de la rencontre, et après avoir quitté la tache lumineuse. Les détails du mouvement larvaire, y compris la décélération, la pause, le moulage de la tête et le virage, peuvent être capturés et analysés à l'aide de cette méthode.

Introduction

Les larves de Drosophila melanogaster montrent un comportement évident d'évitement de la lumière pendant le stade de la recherche de nourriture. Drosophila larval phototaxis a fait l'objet d'une enquête, en particulier dans les 50 dernières années^1,2,3,4,5,6^{,7 ,8}. Ces dernières années, malgré le fait que 1) de nombreux neurones médiateurs de l'évitement de la lumière larvaire ont été identifiés^{4,5,9,10,11,12} et 2) le connectome complet du système visuel larvaire à la résolution des synapses a été établi^13,les mécanismes neuronaux sous-jacents phototaxis larvaires restent en grande partie peu clairs.

Un certain nombre d'essais comportementaux ont été utilisés dans l'étude de la phototaxie larvaire. Ils peuvent être en grande partie divisés en deux classes : l'une impliquant des gradients de lumière spatiale et l'autre impliquant des gradients de lumière temporelle. Pour les essais de gradient de lumière spatiale, l'arène est divisée en nombre égal de sections dans la lumière et l'obscurité. L'arène peut être divisée en moitiés de lumière et sombres^2,4 ou quadrants de lumière et sombre^{s'il y}a 14^,15, ou peut même être séparée en carrés alternatifs de lumière et sombres comme sur un damier⁷. Habituellement, les plaques d'agar sont utilisées pour l'analyse de gradient de lumière spatiale, mais les tubes qui sont divisés en sections de lumière et d'obscurité alternatives peuvent également être utilisés^10,14.

Dans l'ancienne version des essais, l'éclairage lumineux provient généralement de dessous les larves. Cependant, l'illumination dans les versions plus récentes provient en grande partie d'en haut, puisque les yeux larvaires (par exemple, les organes du Bolwig qui sont sensibles aux intensités de lumière faible ou moyenne¹⁶) sont contenus dans le squelette céphalopharyngé opaque avec des ouvertures vers l'avant supérieur. Cela rend les larves plus sensibles à la lumière par les directions avant supérieures que par le bas derrière les directions⁷. Pour les essais de gradient de lumière temporelle, l'intensité lumineuse est spatialement uniforme dans l'arène, mais l'intensité change avec le temps. En plus de la lumière temporelle des ondes carrées (c.-à-d. clignotant/off ou lumière forte/faible^3,7), la lumière temporellement variable qui se conforme à une rampe linéaire d'intensité est également utilisée⁸ pour mesurer la sensibilité des larves à un changement temporel de stimulus de la lumière.

Un troisième type d'essai de phototaxis est la navigation directionnelle de paysage de lumière, qui implique l'illumination d'en haut à un angle de 45^'7. Avant les travaux de Kane et coll.⁷, seuls des paramètres grossiers tels que le nombre de larves dans les régions sombres et légères, la fréquence des virages et la longueur des sentiers ont été calculés dans les essais de phototaxis larvaires. Depuis le travail de ce même groupe, avec l'analyse de l'enregistrement vidéo à haute résolution temporelle pour la phototaxie larvaire, dynamique détaillée du mouvement larvaire pendant la phototaxie (c.-à-d., vitesses instantanées de différentes parties du corps larvaire, direction de cap, angle de rotation et la vitesse angulaire correspondante) ont été analysés⁷. Ainsi, plus de détails sur le comportement de la phototaxis larvaire ont pu être découverts. Dans ces essais, les larves sont testées en groupes afin que les effets de groupe ne soient pas exclus.

Ce protocole introduit un analyse de tache légère pour l'étude des réponses comportementales larvaires à la stimulation lumineuse individuelle. La principale installation expérimentale consiste en un système de stimulation visuelle et un système d'imagerie infrarouge à base de lumière. Dans le système de stimulation visuelle, une source lumineuse LED génère une tache lumineuse ronde de 2 cm de diamètre sur une plaque d'agar, où la larve est testée. L'intensité lumineuse peut être ajustée à l'aide d'un pilote LED. Le système d'imagerie comprend une caméra infrarouge qui capture le comportement de la larve en plus de trois LED infrarouges de 850 nm qui fournissent l'éclairage pour la caméra. L'objectif de la caméra est recouvert d'un filtre de 850 nm pour empêcher la lumière du système de stimulation visuelle d'entrer dans la caméra, tandis que la lumière infrarouge est autorisée à entrer dans la caméra. Ainsi, l'interférence de la stimulation visuelle sur l'imagerie est évitée. Dans cet analyse, les détails comportementaux des réponses rapides des larves individuelles au cours d'une période, y compris avant, pendant et après l'entrée de la lumière sont enregistrés et analysés.

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Protocole

1. Préparation des larves de Drosophila

1. Préparer le milieu standard composé de farine de maïs bouillie (73 g), d'agar (5,6 g), de farine de soja (10 g), de levure (17,3 g), de sirop (76 ml) et d'eau (1000 ml).
2. Soulevez toutes les mouches à 25 oC sur le milieu standard dans une pièce avec un cycle clair/foncé de 12 h/12 h.

2. Préparation des plaques d'agar

1. Préparer une solution d'agar de 1,0 %. Peser 3 g d'agar dans un bécher de 500 ml avec un solde, puis ajouter 300 ml d'eau distillée. Placer un papier d'aluminium sur le disjoncteur pour empêcher l'eau de s'évaporer. Chauffer le bécher au micro-ondes pour qu'il bout.
2. Sortir le bécher et bien remuer à l'arme à verre, puis chauffer au four à micro-ondes pour faire bouillir. Répéter l'opération jusqu'à ce que le liquide soit complètement transparent et fluide.
   REMARQUE : La solution finale d'agar chaud devrait être exempte de bulles d'air ; sinon, verser l'agar dans la plaque entraînera une surface inégale et bosselée de la plaque d'agar, ce qui affectera les tests de comportement larvaire ultérieurs. La concentration de la solution d'agar ne doit pas être trop élevée ou faible. Si la concentration est trop élevée, la lumière diffuse la réflexion sur la plaque d'agar sera forte et enduit la limite lumière/obscurité. Si la concentration est trop faible, les larves laisseront des traces sur la plaque. Ces deux erreurs entraveront le traitement vidéo plus tard dans le protcol.
3. Versez lentement la solution d'agar chaude dans un plat Petri (diamètre 15 cm) jusqu'à ce que le fond soit uniformément recouvert d'une couche d'agar (4 mm d'épaisseur), et refroidissez à température ambiante (RT) jusqu'à ce que la solution d'agar soit solidifiée.
4. La plaque d'agar doit être employée quand elle est fraîchement préparée. Si ce n'est pas le cas, versez une couche d'eau sur la surface et conservez-la au réfrigérateur à 4 oC pour une utilisation ultérieure.

3. Mise en place du système de stimulation visuelle

1. Sélectionnez la source de lumière LED : lumière bleue LED collimated à 470 nm ou lumière blanche chaude.
   REMARQUE : La source de lumière peut être remplacée par la lumière LED de n'importe quelle autre longueur d'onde. Dans cette expérience, la LED de lumière bleue est utilisée comme exemple.
2. Rouler un morceau épais de papier d'aluminium ou de carton noir (assurer l'opacité) pour former un cylindre ouvert de 12 cm de longueur avec un diamètre similaire à celui de la LED bleu-lumière avec un diamètre de 3 cm. Laissez l'extrémité supérieure du cylindre couvrir l'extrémité avant de la LED bleu-lumière. Couvrir l'extrémité inférieure d'un carton noir avec un petit trou rond (0,5 cm de diamètre) au centre. Il s'agit de la configuration du système de source lumineuse.
3. Fixez la source de lumière préparée sur le cadre en fer avec un clip, en s'assurant que la lumière LED projette vers le bas vers le bureau. Inclinez légèrement le cylindre. L'angle entre le plan cylindre et le plan vertical est d'environ 10 degrés (voir Figure 1). Connectez la lumière LED bleue de 470 nm à la prise « LED1 » du conducteur LED de haute puissance. Allumez le conducteur, tournez le bouton dans le coin supérieur droit du conducteur pour sélectionner le canal 470 nm,puis cliquez sur LED. Ensuite, lorsque l'écran s'affiche « », un point lumineux bleu apparaît sur le bureau.
   REMARQUE : Si le cylindre fuit la lumière en plus du petit trou rond, il est recommandé d'utiliser du ruban noir sur les pièces qui fuient pour s'assurer que seul le trou peut passer la lumière à travers.
4. Cliquez OK et tournez le bouton pour ajuster l'intensité de la lumière. Faites pivoter le bouton à une intensité lumineuse plus élevée de 50 mA. Mesurer et enregistrer le spectre de la lumière à l'intérieur d'un spectromètre.
5. Déplacez la position de la source lumineuse de haut en bas pour ajuster le diamètre de la tache lumineuse à 2 cm. Le bureau doit être noir pour un meilleur effet de contraste.
6. Faites pivoter le bouton pour choisir l'intensité lumineuse en fonction des besoins expérimentaux. Utilisez une console de compteur d'énergie compacte avec un capteur de puissance photodiode standard pour mesurer la puissance de lumière maximale et minimale dans l'endroit, l'enregistrer, mesurer trois fois, et prendre la valeur moyenne.
   REMARQUE : Il est recommandé d'utiliser un capteur de puissance photodiode pour mesurer l'intensité lumineuse pour la lumière d'une longueur d'onde spécifique et d'utiliser un capteur de puissance thermique pour mesurer l'intensité lumineuse de la lumière blanche.
7. Calculez l'intensité lumineuse dans le point lumineux en divisant la puissance lumineuse mesurée par la zone du capteur.
   REMARQUE : Par exemple, si la puissance lumineuse mesurée à l'étape 2,6 est de 20 pW et que la superficie du capteur est de 0,81 mm^2,l'intensité lumineuse est de 24,69 pW/mm² (divisant 20 pW par 0,81 mm²).

4. Mise en place du système d'imagerie

1. Clamp une caméra web haute résolution avec un clip en fer, à environ 10 cm au-dessus de la tache lumineuse sur le bureau (Figure 1).
2. Ajuster l'orientation de l'objectif de la caméra vers le bureau. Connectez la caméra à un ordinateur à l'intermédiaire d'une interface USB.
3. Placez une plaque d'agar sur le bureau juste sous la caméra.
4. Ouvrez le logiciel "Amcap9.22" sur l'ordinateur avec Windows 7, et le point lumineux sera automatiquement affiché dans la fenêtre d'AMcap. Déplacez la caméra légèrement à gauche ou à droite pour vous assurer que la tache lumineuse est près du centre de la fenêtre. Assurez-vous que la caméra ne bloque pas le chemin de lumière. Le point lumineux doit être complet et rond.
   REMARQUE: Le logiciel peut être trouvé à http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fixez un filtre de bande-passe de 850 nm et 3 nm avec un clip de 5 à 7 mm juste en dessous de la caméra.
   REMARQUE: Le diamètre du filtre est d'environ 2,5 cm, et l'objectif de la caméra est inférieur à 1 cm de diamètre, de sorte que le filtre peut couvrir le champ visuel de la caméra. Avec le filtre en dessous de la caméra, le point lumineux ne doit pas être vu dans la fenêtre de AMcap.
6. Placez trois LED génératrices de lumière infrarouge (longueur d'onde centrale de 850 nm) uniformément autour de la plaque d'agar. Chaque LED doit être à environ 5 cm du bord de la plaque d'agar, et la face de la lentille de la LED doit être à un angle de 70 degrés vers le bas vers la plaque d'agar. Connectez les LED à l'alimentation grâce au convertisseur AC-To-DC.
   REMARQUE : Il est préférable de fixer les positions et les angles des LED de lumière infrarouge pour assurer la cohérence de la luminosité du champ dans divers essais expérimentaux et faciliter le traitement vidéo ultérieur.
7. Placez une planche noire entre l'ordinateur et l'appareil. Définir la luminosité de l'écran de l'ordinateur pour empêcher la lumière de l'écran de l'ordinateur d'affecter l'expérience.
   REMARQUE : Gardez l'environnement sombre lorsque vous mesurez la longueur d'onde ou l'intensité de la lumière.

5. Réglage des paramètres d'imagerie

1. Au menu du logiciel AMcap, choisissez Options Appareil vidéo (en anglais) Capturezle format , et fixez la taille de pixel de la vidéo capturée à 800 x 600 et le taux d'image à 60 fps.
2. Retirez le filtre sous la caméra, placez une règle sous la caméra et ajustez la mise au point de la caméra pour rendre la ligne d'échelle claire et parallèle à la largeur du champ de vision vidéo.
3. Cliquez sur Capture (en anglais) Mise en place de l'année. Capture vidéo pour sélectionner le chemin d'enregistrement, cliquez sur Démarrer l'enregistrement,enregistrer la distance réelle correspondant à 600 pixels, et calculer le rapport de chaque pixel à la distance réelle.

6. Enregistrement vidéo du comportement d'évitement de la lumière

1. Maintenir une température de 25,5 oC pendant toutes les expériences. Contrôler la température ambiante à l'air conditionneur si nécessaire. Gardez l'humidité constamment à 60% avec un humidificateur.
2. Prenez une courte vidéo de la position de tache lumineuse nommée "lightarea1". Ensuite, déplacez le filtre de 850 nm et 3 nm pour couvrir l'objectif de la caméra.
   REMARQUE : Lors de l'enregistrement du comportement larvaire, l'objectif de la caméra est recouvert par le filtre de 850 nm et 3 nm de sorte que le point lumineux n'est pas montré dans la vidéo. Le point lumineux peut être reconstruit dans des vidéos avec des larves plus tard avec Matlab. Ne modifiez pas la position de la caméra et évitez de modifier le rapport de chaque pixel par rapport à la distance réelle mesurée à l'étape 4.3.
3. Allumez une lumière (c.-à-d. une lumière de pièce) loin de l'appareil expérimental. Baissez la lumière aussi bas que possible, tant que les larves peuvent être clairement visibles avec les yeux. Sortir les larves du milieu de culture à l'aide d'une cuillère, cueillir délicatement une larve de troisième étoile et laver propre à l'eau distillée. Veillez à laver la larve une à la fois pour éviter les interférences de la faim. Une seule expérience nécessite au moins 20 larves.
4. Transférer la larve au centre de la plaque d'agar placée sous la caméra pendant l'étape 3.3. Retirez délicatement l'excès d'eau de la larve à l'aide d'un pinceau ou utilisez du papier buvard pour enlever l'eau de la larve afin d'éviter le reflet de la lumière sous la lentille. Éteignez la lumière ambiante et laissez la larve s'acclimater pendant 2 min dans l'environnement sombre.
5. Allumez la lumière LED pour générer la lumière infrarouge, et brossez doucement la larve au centre de la plaque. Lorsque la larve commence à ramper tout droit, faites pivoter la plaque pour que la larve se dirige vers le point lumineux. Assurez-vous qu'il rampe directement dès le début, ou bien il peut ne pas obtenir l'accès à l'endroit lumineux.
6. Cliquez sur Capture (en anglais) Mise en place de l'année. Capture vidéo pour sélectionner le chemin d'enregistrement, puis cliquez sur Démarrer l'enregistrement pour enregistrer. Laissez la larve ramper vers le point lumineux, entrer dans le point lumineux, puis quitter le point lumineux jusqu'à ce qu'il soit presque hors du champ de vision. Cliquez sur Arrêter l'enregistrement. Si la larve se détourne du point lumineux avant de s'approcher, cliquez directement sur Arrêter l'enregistrement.
7. Éloignez le filtre de la caméra. Prenez une courte vidéo de la position du point lumineux nommé "lightarea2" et comparez-le à "lightarea1" pour vous assurer que la position du point lumineux n'est pas modifiée. Si un changement de position évident est observé, jetez les données.

7. Analyse des données

1. Utilisez SOS¹⁷ pour extraire le contour du corps animal et les paramètres de mouvement à partir de vidéos utilisant des méthodes de traitement d'image comme décrit précédemment¹⁷.
   REMARQUE : Des paramètres tels que headSpeed (vitesse de la tête larvaire), tailSpeed (vitesse de la queue larvaire), midSpeed (vitesse du point médian larvaire de la ligne de squelette) et cmSpeed (vitesse du centroïde larvaire) ont été utilisés pour mesurer la vitesse de déplacement des larvaires. Des paramètres comprenant headTheta (l'angle entre les lignes de head-midpoint et midpoint-tail) et headOmega (la vitesse changeante de headTheta) ont été employés pour mesurer la flexion de corps larvaire et la vitesse angulaire de flexion.

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Résultats

Selon le protocole, l'analyse de tache lumineuse a été employée pour étudier le comportement d'évitement de lumière de la troisième larve d'étoile qui ont été soulevées à 25 oC sur le milieu standard dans une pièce avec un cycle de lumière/obscurité de 12 h/12 h. Une seule larve w¹¹¹⁸ a été testée à l'aide de l'analyse de la tache lumineuse à 25,5 oC. L'intensité lumineuse moyenne de la tache lumineuse générée par une LED de 460 nm était de 0,59 W/cm². L'ensemble d...

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Discussion

Ce protocole présente l'analyse des points lumineux pour tester la capacité des larves de Drosophila à s'échapper de la lumière. Cet analyse permet de suivre le comportement des larves avant d'entrer, lors de la rencontre et après avoir quitté un point lumineux. Les détails du mouvement larvaire peuvent être capturés et analysés. L'argument de la tache lumineuse est très simple et possède une forte praticabilité. Le coût de l'ensemble de l'appareil n'est pas élevé. Dans l'expérience, la lumièr...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%