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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole décrit la culture de biofilms inter-royaume s'composés de Candida albicans et Streptococcus mutans et présente une méthode confocale basée sur la microscopie pour la surveillance du pH extracellulaire à l'intérieur de ces biofilms.

Résumé

Les biofilms transversaux composés de cellules fongiques et bactériennes sont impliqués dans une variété de maladies buccales, telles que les infections endodontiques, la parodontite, les infections muqueuses et, plus particulièrement, les caries de la petite enfance. Dans toutes ces conditions, le pH de la matrice de biofilm influe sur les interactions microbe-hôte et donc la progression de la maladie. Le protocole actuel décrit une méthode à base de microscopie confocale pour surveiller la dynamique du pH à l'intérieur des biofilms transversaux comprenant Candida albicans et Streptococcus mutans. Le spectre à double émission dépendant du pH et les propriétés de coloration de la sonde ratiométrique C-SNARF-4 sont exploités pour déterminer les baisses de pH dans les zones extracellulaires des biofilms. L'utilisation de la ratiométrie de pH avec la sonde nécessite un choix méticuleux de paramètres d'imagerie, un étalonnage approfondi du colorant et un post-traitement minutieux basé sur le seuil des données d'image. Lorsqu'elle est utilisée correctement, la technique permet l'évaluation rapide du pH extracellulaire dans différentes zones d'un biofilm et donc la surveillance des gradients de pH horizontaux et verticaux au fil du temps. Alors que l'utilisation de la microscopie confocale limite le profilage Z à des biofilms minces de 75 m ou moins, l'utilisation de la ratiométrie du pH est idéalement adaptée à l'étude non invasive d'un facteur de virulence important dans les biofilms de l'ensemble du royaume.

Introduction

Les biofilms de cross-kingdom comprenant des espèces fongiques et bactériennes sont impliqués dans plusieurs conditions pathologiques dans la cavité buccale. Candida spp. ont souvent été isolés des infections endodontiques1 et des lésions parodontales2,3. Dans les infections muqueuses, les espèces streptococciques du groupe de mitis ont été montrées pour augmenter la formation de biofilm fongique, l'invasion de tissu, et la diffusion dans les modèles in vitro etmurines 4,5,6,7. Plus intéressant encore, le transport oral de Candida spp. a été prouvé pour être associé à la prévalence des caries chez les enfants8. Comme le montrent les modèles de rongeurs, une relation symbiotique entre Streptococcus mutans et Candidas albicans augmente la production de polysaccharides extracellulaires et conduit à la formation de biofilms plus épais et plus cariogéniques9,10.

Dans toutes les conditions susmentionnées, les caries de la petite enfance en particulier, le pH du biofilm est important pour la progression de la maladie, et le rôle éminent de la matrice biofilm pour le développement de microenvironnements acidogéniques11 exige des méthodologies qui permettent d'étudier les changements de pH à l'intérieur des biofilms inter-royaume. Des approches simples et précises basées sur la microscopie confocale pour surveiller le pH à l'intérieur des biofilmsbactériens 12 et fongiques13 ont été développées. Avec le colorant ratiométrique C-SNARF-4 et le post-traitement de l'image basé sur le seuil, le pH extracellulaire peut être déterminé en temps réel dans les trois dimensions d'un biofilm14. Comparé à d'autres techniques éditées pour la microscopie-basée pH-surveillance dans les biofilms, la ratiométrie de pH avec C-SNARF-4 est simple et bon marché, parce qu'elle ne nécessite pas la synthèse des particules ou des composés qui incluent un colorant de référence15 ou l'utilisation de l'excitation de deux-photon16. L'utilisation d'un seul colorant empêche les problèmes de compartimentation de sonde, de saignement fluorescent-à travers, et de blanchiment sélectif16,17,18 tout en permettant une différenciation fiable entre le pH intra- et extracellulaire. Enfin, l'incubation avec le colorant est effectuée après la croissance du biofilm, ce qui permet d'étudier à la fois les biofilms en laboratoire et in situ.

L'objectif du présent travail est d'étendre l'utilisation de la ratiométrie du pH et de fournir une méthode pour étudier les changements de pH dans les biofilms inter-royaume. Comme preuve de concept, la méthode est utilisée pour surveiller le pH dans les biofilms à deux espèces composés de S. mutans et De C. albicans exposés au glucose.

Protocole

Le protocole pour la collecte de salive a été examiné et approuvé par le comité d'éthique du comté d'Aarhus (M-20100032).

1. Cultivation de biofilms de cross-kingdom

  1. Cultivez S. mutans DSM 20523 et C. albicans NCPF 3179 sur des plaques d'agar de sang à 37 oC dans des conditions aérobies.
  2. Transférer des colonies uniques de chaque organisme dans des tubes à essai remplis de 5 ml d'infusion cardiaque cérébrale (BHI). Cultivez pendant 18 h dans des conditions aérobies à 37 oC.
  3. Centrifuger les cultures de la nuit à 1 200 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant, suspendez les cellules en salin physiologique et ajustez l'OD550 nm à 0,5 pour C. albicans (107 cellules/mL) et S. mutans (108 cellules/mL). Diluer la suspension S. mutans 1:10 avec saline physiologique stérile (107 cellules/mL).
  4. Pipette 50 l de solution salivaire stérile, préparée selon la méthode de de Jong et coll.19, dans les puits d'une plaque optique de 96 puits pour la microscopie. Incuber pendant 30 min à 37 oC. Laver les puits 3x avec 100 l de salline physiologique stérile. Videz les puits.
  5. Ajouter 100 l de suspension C. albicans à chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 90 min. Laver 3x avec saline physiologique stérile.
    REMARQUE : Ne videz pas complètement les puits pendant le lavage. Laissez un réservoir de 20 L pour éviter les forces excessives de cisaillement.
  6. Ajouter 100 ll de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (inactivé à 56 oC pendant 30 min) à chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 2 h. Laver 3x avec saline physiologique stérile. Vider les puits, en laissant un réservoir de 20 l.
  7. Ajouter 100 l de suspension S. mutans (préparée à l'étape 1.3) à chaque puits. Ajouter 150 L de BHI contenant 5% de saccharose. Incuber à 37 oC pendant 24 h ou plus. Lorsque vous cultivez des biofilms plus anciens, changez le milieu quotidiennement en BHI frais. À la fin de la phase de croissance du biofilm inter-royaume, laver 5x avec saline physiologique stérile.

2. Imagerie par pH ratiométrique

REMARQUE : L'imagerie par pH ratiométrique doit être effectuée immédiatement après la fin de la croissance du biofilm.

  1. Pour l'imagerie par pH ratiométrique, utilisez un microscope à balayage laser confocal inversé avec une lentille d'immersion en huile ou en eau de 63x, une ligne laser de 543 nm et un système d'imagerie spectrale (c.-à-d. détecteur META) pour permettre l'imagerie des signaux fluorescents qui se chevauchent. À l'emploi d'un incubateur, chauffer le stade du microscope à 35 oC.
  2. Définir le détecteur pour assurer la détection de la fluorescence verte de 576 à 608 nm et la détection simultanée de la fluorescence rouge de 629 à 661 nm. Choisissez une puissance laser appropriée et gagnez pour éviter la surexposition et la sous-exposition.
    REMARQUE: L'exposition des images est mieux vu dans les images de palette avec de fausses couleurs.
  3. Définir la taille du sténopé à 1 unité Airy ou une tranche optique de 0,8 m. Définir la taille de l'image à 512 x 512 pixels et la vitesse d'analyse à 2. Choisissez une moyenne de ligne de 2, en utilisant l'option moyenne.
    REMARQUE : Au début d'une série d'expériences, vérifiez que les paramètres choisis au microscope offrent un contraste clair entre les cellules bactériennes, les parois des cellules fongiques, la matrice de biofilms et le cytoplasme fongique.
  4. Préparer 100 l de saline physiologique stérile contenant 0,4 % (w/v) de glucose, titré au pH 7. Préparer une solution de stock de C-SNARF-4 (1 mM en sulfoxide de diméthyle). Ajouter le colorant à une concentration finale de 30 m.
    CAUTION: Portez des gants nitriles lors de la manipulation du colorant ratiométrique.
  5. Videz l'un des puits avec un biofilm transversal, en laissant un réservoir de 20 L. Ajouter le salin stérile contenant du glucose et le colorant ratiométrique. Placez la plaque de 96 puits sur la scène du microscope et commencez à imagerier le biofilm.
  6. Acquérir des images uniques ou des piles Z à différents endroits du biofilm. Marquez la position X-Y dans le logiciel de microscope pour suivre les changements de pH dans des champs de vision particuliers au fil du temps. À intervalles réguliers, prenez des images avec le laser éteint pour corriger le décalage du détecteur.
  7. Répétez les étapes 2.4-2.6 pour l'analyse de chaque biofilm cultivé dans un puits différent.

3. Calibration du colorant ratiométrique

REMARQUE : L'étalonnage du colorant et l'installation d'une courbe d'étalonnage peuvent être effectués un jour différent de l'imagerie par pH ratiométrique.

  1. Préparer une série de tampons de 50 mM d'acide morpholinoethanesulfonic (MES) titrated à pH 4,0 à 7,8 en étapes de 0,2 pH à 35 oC. Pipette 150 l de chaque solution tampon dans les puits d'une plaque optique de 96 puits pour la microscopie.
  2. Ajouter le colorant aux puits remplis de tampons de la plaque de 96 puits à une concentration finale de 30 M. Laisser l'équilibre pendant 5 min.
  3. Réchauffer l'étape du microscope à 35 oC. Choisissez les mêmes réglages de microscope que pour l'imagerie par pH ratiométrique. Placez la plaque de 96 puits sur la scène du microscope. Concentrez-vous sur le fond des puits. Acquérir deux images (canal vert et rouge) pour toutes les solutions tampons, à 5 m au-dessus du fond du puits. À intervalles réguliers, prenez des images avec le laser éteint pour corriger le décalage du détecteur.
  4. Effectuer l'expérience d'étalonnage en triplicate.
  5. Exportez toutes les images sous forme de fichiers TIF. Importez-les dans un logiciel dédié d'analyse d'images (c.-à-d. ImageJ20). Soustrayez les images prises avec le laser désactivée des images respectives des solutions tampons en cliquant sur Processus . Calculatrice d'images Soustrayez).
    REMARQUE : Si nécessaire, recadrez les images pour éliminer les artefacts aux bordures de l'image en effectuant une sélection rectangulaire à l'aide d'Image. Crop.
  6. Divisez les images du canal vert à travers les images du canal rouge et calculez les intensités moyennes de fluorescence dans les images résultantes en cliquant sur Analyser Histogramme.
  7. À partir des expériences triplicate, tracez les rapports vert/rouge moyens par rapport au pH. Utilisez un logiciel dédié pour adapter une fonction aux données d'étalonnage (c.-à-d. MyCurveFit).

4. Analyse d'image numérique

REMARQUE : L'analyse numérique de l'image peut être effectuée à tout moment après l'étalonnage du colorant et de l'imagerie par pH ratiométrique.

  1. Conservez les images de biofilms de canal vert et rouge dans des dossiers séparés et renommez les deux séries de fichiers avec des numéros séquentiels (p. ex., GREEN_0001). Importer les images dans un logiciel dédié d'analyse d'images (c.-à-d. ImageJ). Cliquez sur Analyser Histogramme pour déterminer l'intensité moyenne de fluorescence dans les images prises avec le laser et soustraire la valeur des images de biofilm en cliquant sur Processus Mathématiques et mathématiques Soustrayez.
  2. Importer la série de 2 images dans un logiciel dédié d'analyse d'images (c.-à-d., daime21). Effectuer une segmentation fondée sur le seuil des images de canaux rouges(Segment Segmentation automatique Seuil personnalisé). Fixez le seuil « bas » au-dessus de l'intensité de fluorescence du cytoplasme fongique et le seuil « élevé » au-dessous de l'intensité des parois des cellules fongiques et des bactéries.
    REMARQUE : Lorsque des seuils appropriés ont été choisis, seules les zones extracellulaires sont reconnues comme des objets.
  3. Transférez la couche d'objet de la série d'images segmentées à la série d'images de canaux verts. Pour ce faire, cliquez sur Segment Transférer la couche d'objet.
    REMARQUE: Si le contraste entre les zones extracellulaires et le cytoplasme fongique est trop faible dans les canaux de couleur individuels, ajouter la série d'images de canal vert à la série de canaux rouges avant la segmentation en cliquant sur Edit Calculatrice d'images Ajout. Effectuez la segmentation telle que décrite sous 4.2 et transférez la couche d'objet de la série d'images segmentées à la fois à la série d'images vertes et rouges.
  4. Utilisez l'éditeur d'objets pour supprimer les pixels non-objet dans la série d'images de canaux rouges et verts (Visualiseur Éditeur d'objets Dans toutes les images Supprimer les pixels non-objet). Maintenant, les images de biofilms sont effacées des cellules bactériennes et fongiques. Exporter la série d'images traitées sous forme de fichiers TIF.
  5. Importer les deux séries d'images sur ImageJ. ImageJ attribue une intensité de 0 à tous les pixels non-objet. Supprimer ces pixels en divisant la série d'images rouges (R1) par lui-même (Processus Calculatrice d'images Image 1: R1; Opération : Diviser; Image 2: R1) et en multipliant la série d'images résultante (R2) avec la série d'images rouges d'origine (Processus Calculatrice d'images Image 1: R1; Opération: Multiplier; Image 2: R2). Une troisième série d'images (R3) est créée, identique à R1, sauf pour le fait que NaN est attribué à tous les pixels avec une intensité de 0 en R1. Procédez de la même manière avec la série d'images vertes.
  6. Utilisez le filtre 'Mean' (Processus Filtres et filtres Moyenne de l'année Rayon de rayon 1 pixel) sur la série d'images de canaux rouges et verts pour compenser le bruit du détecteur. Diviser la série d'images de canaux verts par la série d'images de canaux rouges(Processus Calculatrice d'images Image 1: G3; Opération : Diviser; Image 2: R3). La série d'images résultante (G3/R3) montre le rapport vert/rouge pour tous les pixels d'objet.
  7. Calculer le rapport moyen pour chaque image (Analysez Histogramme). Appliquer de fausses coloriage pour une meilleure représentation visuelle des ratios dans les images (Image Tables de recherche). Convertissez les ratios vert/rouge en valeurs de pH en utilisant la fonction montée en dessous de 3,6.

Résultats

Après 24 h et 48 h, de robustes biofilms croisés se sont développés dans les plaques de puits. C. albicans a montré des degrés variables de croissance filamentuse, et S. mutans a formé des amas denses de jusqu'à 35 m de hauteur. Les cellules et les chaînes simples de S. mutans regroupées autour d'hyphes fongiques, et de grands espaces intercellulaires indiquaient la présence d'une matrice volumineuse (Figure S1).

Calibration du colorant ra...

Discussion

Différents protocoles pour la culture de biofilms inter-royaume impliquant C. albicans et Streptococcus spp. ont été décrits précédemment9,22,23,24,25. Cependant, la configuration actuelle se concentre sur des conditions de croissance simples, un calendrier compatible avec les journées de travail régulières, une composition ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Anette Aakjor Thomsen et Javier E. Garcia sont reconnus pour leur excellent soutien technique. Les auteurs remercient Rubens Spin-Neto pour les discussions fructueuses sur l'analyse d'images.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Blood agar platesStatens Serum Institut677
Brain heart infusionOxoidCM1135
Brain heart infusion + 5 % sucroseBDH laboratory supplies10274
Candida albicansNational Collection of Pathogenic FungiNCPF 3179
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
daime: digital image analysis in microbial ecologyUniversität WienN/AFreeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxideLife TechnologiesD12345
Fetal bovine serumGibco Life technologies10270
GS-6R refrigerated centrifugeBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthN/AFreeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/AFreeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) bufferBioworld700728
PHM210 pH-meterRadiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objectiveZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
Sterile physiological salineVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

Références

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