Method Article
Nous présentons ici un test d’hybridation in situ de nouvelle génération pour identifier des séquences spécifiques d’ARN ou d’ADN viral dans des tissus inclus dans la paraffine fixée au formol (FFPE). Cette approche permet de visualiser de faibles copies d’ARN et d’ADN en moins de 24 h avec une sensibilité et une spécificité très élevées.
L’hybridation in situ est une technique puissante pour identifier des séquences d’ARN ou d’ADN spécifiques dans des cellules individuelles dans des coupes de tissus, fournissant des informations importantes sur les processus physiologiques et la pathogenèse des maladies. L’hybridation in situ (ISH) est utilisée depuis de nombreuses années pour évaluer l’emplacement des cellules infectées par des virus, mais récemment, une approche ISH de nouvelle génération a été développée avec une stratégie de conception de sonde unique qui permet l’amplification du signal et la suppression simultanée du bruit de fond pour obtenir une visualisation d’une seule molécule tout en préservant la morphologie des tissus. Cette ISH de nouvelle génération est basée sur une approche similaire à la PCR ramifiée, mais réalisée in situ et est plus facile, sensible et reproductible que les méthodes ISH classiques ou les approches PCR in situ pour détecter régulièrement l’ARN ou l’ADN dans les tissus inclus dans la paraffine fixée au formol (FFPE). Au cours des dernières années, notre laboratoire a utilisé cette plateforme ISH pour la détection de cellules positives à ARN viral (ARNv) et/ou à ADN viral (ADNv) dans une multitude de tissus FFPE positifs pour le déficit humain (VIH) et l’immunodéficience simienne (SIV). Avec ce manuscrit technique détaillé, nous aimerions partager nos connaissances et nos conseils avec toutes les personnes intéressées à utiliser l’ISH de nouvelle génération dans leurs recherches.
L’ISH est l’approche expérimentale utilisée pour cibler et visualiser des brins d’ADN, d’ARN ou d’acides nucléiques modifiés complémentaires (c’est-à-dire des sondes) à des séquences d’ADN ou d’ARN spécifiques au sein d’une cellule ou d’une section de tissu. L’ISH permet la localisation et la visualisation spécifiques de séquences nucléiques spécifiques dans les tissus, ce qui est important pour comprendre le niveau d’expression, l’organisation, la distribution et les interactions entre la cible et son environnement cellulaire, ce qui constitue une information précieuse qui ne peut être obtenue avec l’utilisation d’autres techniques populaires, telles que la qPCR. Jusqu’à récemment, l’ISH était couramment réalisée avec un ADN complémentaire marqué ou un ARN complémentaire (riboprobe). Ces sondes ont été soit conjuguées directement avec des bases marquées par radio, par fluorescence ou par antigène (par exemple, 35 S, FITCet digoxigénine), puis localisées et quantifiées dans le tissu à l’aide d’approches d’autoradiographie, de microscopie à fluorescence ou d’immunohistochimie, respectivement. Bien que ces technologies in situ continuent d’être des approches précieuses, il y a encore beaucoup à faire pour développer des approches moins exigeantes en main-d’œuvre, plus simples, plus rapides, sensibles et spécifiques.
Une autre approche commerciale d’ISH de nouvelle génération (p. ex., le test RNAscope), décrite pour la première fois en 2012, pour la détection de l’ARN messager de l’hôte (ARNm) est basée sur la PCR ramifiée. La détection de l’ARNm est effectuée dans les cellules et les tissus FFPE, avec une sensibilité proche de la visualisation de molécules d’ARN unique dans des cellules individuelles1. La spécificité de cette approche est obtenue à la condition unique que deux sondes cibles double-Z se lient de manière contiguë à leurs séquences d’ARN (ou d’ADN) complémentaires respectives pour qu’un préamplificateur de signal se lie séquentiellement à1. Cela permet d’initier une cascade d’amplification du signal via des étapes d’hybridation ultérieures similaires à l’ADN ramifié (ADNb)1,2. De plus, cette approche est remarquablement rapide et facile, avec des résultats obtenus en seulement 1 jour (<8 h), un avantage significatif par rapport à jusqu’à 4 semaines avec des techniques alternatives, y compris Radio-ISH 1,2. Cette ISH de nouvelle génération a ouvert de nouvelles perspectives et opportunités pour la recherche sur le VIH/SIV. Les principaux obstacles à la guérison du VIH sont les réservoirs cellulaires et tissulaires qui s’établissent au cours des premiers stades de la maladie 3,4. L’objectif global de cette technique est d’identifier, de localiser et, en fin de compte, de comprendre les principaux compartiments tissulaires qui agissent comme un réservoir viral et qui persistent dans un hôte infecté. Cela contribuera à son tour à l’élaboration de stratégies de traitement efficaces contre le VIH.
Dans ce manuscrit, nous expliquons en détail notre protocole ISH multiplex ARN/ADN duplex de nouvelle génération (par exemple, RNAscope/DNAscope) et expliquons comment nous avons modifié le protocole ISH RNA existant pour optimiser l’ISH de nouvelle génération pour nos échantillons et cibles spécifiques. Ce protocole permet la visualisation, la localisation et la quantification de l’ARN viral et de l’ADN viral du VIH/VIS dans des coupes de tissus de 5 μm. La visualisation simultanée de l’ARNv et de l’ADNv est réalisée en combinant deux ensembles de sondes personnalisées : l’une détective, ciblant le brin codant de l’ADNv (sonde C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense [416141-C1]), et l’autre antisens, ciblant les transcrits d’ARNv (sonde C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense [416131-C2]) couvrant différentes régions du génome viral (Tableau 1), à l’aide de deux canaux de visualisation différents, C1 et C2. Dans ce protocole, les canaux C1 et C2 nous permettent de visualiser les signaux de différentes couleurs (c’est-à-dire AP en rouge et HRP en marron) et de détecter les sondes avec différentes approches. À l’exclusion du traitement de la fixation des tissus et de la coupe, ce test prend 2 jours. Voici le protocole d’hybridation in situ de l’ARNv duplex et de l’ADNv qui peut être réalisé sur des cuillers cellulaires ou des coupes de tissus.
1. Préparation des sections et des lames
2. Préparation au four
3. Récupération d’épitopes induite par la chaleur
4. Prétraitement de la protéase
5. Hybridation de sonde et amplification du signal
REMARQUE : Pour éviter l’évaporation, assurez-vous que le plateau à humidité contrôlée se ferme correctement afin que les tissus ne se dessèchent pas pendant les étapes d’incubation. Remettez la chambre d’humidité dans le four pendant l’étape de lavage pour qu’elle reste à 40 °C.
6. Détection du signal cible du canal 1 (C1)
REMARQUE : Ceci est effectué à l’aide de la phosphatase alcaline rouge et de l’amplification chromogène rouge rapide 6 à partir de kits de détection 2-plex (voir le tableau des matériaux) contenant des marqueurs de phosphatase alcaline et la détection chromogène. Il utilise le rouge rapide comme substrat pour générer un signal rouge.
7. Détection du signal cible du canal 2 (C2)
REMARQUE : Ceci est effectué à l’aide de kits chromogènes Brown HRP et DAB disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux). L’amplification 10 de la détection 2-plex contient des marqueurs de peroxydase de raifort, et la détection chromogène est effectuée à l’aide de DAB pour générer un signal brun.
8. Contre-coloration et montage
9. Protocole d’analyse d’images quantitatives pour RNAscope à l’aide de CellProfiler5
Dans un manuscrit précédent 2,6,7,8,9,10,11, nous avons rapporté que les plateformes ISH de nouvelle génération détectant soit l’ARNv, soit l’ADNv, peuvent être combinées, à l’aide de sondes sensorielles (ADNv) ciblant la partie 5' gag-pol du génome SIV/VIH et de sondes antisens (ARNv) ciblant les gènes de la moitié 3' du génome (vif, vpx, vpr, tat, env et nef) ainsi que l’élément TAR dans le génome 5' (tableau 1). Cette approche distingue les cellules transcriptionnellement actives (vRNA+, vDNA+) des cellules infectées transcriptionnellement inactives (présumées latentes) ou des cellules hébergeant des provirus transcriptionnellement incompétents (vRNA-, vDNA+) dans la même sectiontissulaire 2 (Figure 1).
Figure 1 : Détection de l’ARN viral et de l’ADNv dans la même section de tissu. Combinaison d’un test d’hybridation d’ARN (rouge) et d’hybridation d’ADN (brun) dans un ganglion lymphatique RM infecté par le SIV aiguë, démontrant la capacité de détecter l’ARNv et l’ADNv dans la même section de tissu et fournissant une approche puissante pour identifier in situ les cellules d’ADNv+ vRNA+ transcriptionnellement silencieuses. Cette figure a été modifiée de Deleage C. et al.2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ensembles de sondes ARN/DNAscope Plex simples | |||
Nom | Catalogue ACD # | Nombre de ZZ | Description |
SIVmac239 (Anti-Sens) | 312811 | 83 | Ciblage de la sonde antisens entre 1251 et 9420 pb de D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env et nef) |
SIVmac239 (Sense) | 314071 | 83 | Sonde Sense ciblant le brin inverse entre 1251 et 9420 pb de D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env et nef) |
V-HIV1-Clade A (anti-sens) | 416101 | 80 | Sonde antisens ciblant entre 879 et 7629 pb du consensus du clade A du VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env et nef) |
V-HIV1-Clade A (Sens) | 426341 | 80 | Sonde sensorielle ciblant le brin inverse dans un rayon de 879 à 7629 pb du consensus du clade A du VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env et nef) |
V-HIV1-Clade B (Anti-Sens) | 416111 | 78 | Sonde antisens ciblant entre 854 et 8291 pb de AF324493.2, VIH-1 clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env et nef) |
V-HIV1-Clade B (Sens) | 425531 | 78 | Sonde Sense ciblant le brin inverse entre 854 et 8291 pb de AF324493.2, VIH-1 clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env et nef) |
V-HIV1-Clade D (anti-sens) | 416121 | 76 | Sonde antisens ciblant dans les 894-7697 pb du consensus du clade D du VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef) |
V-HIV1-Clade D (Sense) | 426351 | 76 | Sonde sensorielle ciblant le brin inverse dans un rayon de 894 à 7697 pb du consensus du clade D du VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef) |
Ensembles de sondes ARN/DNAscope Multi-Plex | |||
Nom | Catalogue ACD # | Nombre de ZZ | Description |
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1 | Référence 416141-C1 | 40 | Sonde Sense ciblant le brin inverse entre 1251 et 4093 pb de D01065.1 (gag et pol) |
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (Anti-sens) | Réf. 416131-C2 | 47 | Ciblage de la sonde antisens entre 5381 et 10257 pb de D01065.1 (vif, vpx, vpr, tat, env, nef et l’élément TAR) |
V-HIV1-Clade_B-gag-pol-sense-C1 | Référence 444051-C1 | 40 | Sonde Sense ciblant le brin inverse entre 854 et 3940 pb de AF324493,2, VIH-1 clade B NL4-3 (gag et pol) |
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-sens) | Référence 444061-C2 | 40 | Sonde antisens ciblant entre 5042 et 9673 pb de AF324493.2, VIH-1 clade B NL4-3 (vif, vpr, tat, env, nef et l’élément TAR) |
V-HIV1-Clade_C-gag-pol-sense-C1 | Référence 444021-C1 | 48 | Sonde sensorielle ciblant le brin inverse entre 888 et 5032 pb de la séquence consensuelle du clade C du VIH-1 (gag et pol) |
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-sens) | Référence 444041-C2 | 49 | Ciblage de la sonde antisens entre 5078 et 9698 pb de la séquence consensuelle du clade C du VIH-1 (vif, vpr, tat, env, nef et l’élément TAR) |
V-HIV1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1 | Référence 444011-C1 | 55 | Sonde Sense ciblant le brin inverse entre 890 et 4812 pb de AF259954.1, EA du clade du VIH-1 (gag et pol) |
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Antisens) | Réf. 444031-C2 | 57 | Sonde antisens ciblant entre 5052 et 9694 pb de AF259954,1, EA du clade du VIH-1 (vif, vpr, tat, env, nef et l’élément TAR) |
Tableau 1 : Liste des sondes pour cibler l’ARNv et l’ADNv du VIH-1 et du VIS.
L’hybridation in situ est un test méticuleux qui nécessite de la rigueur et des connaissances de base en chimie des acides nucléiques, en biologie cellulaire et en histologie pour pouvoir adapter chaque étape critique pour localiser une cible dans un environnement bien conservé. Dans cette discussion, nous aimerions mettre en évidence les étapes critiques où le dépannage est crucial pour obtenir des résultats précis et interprétables.
La fixation et le traitement des tissus sont essentiels et doivent être abordés dès le départ pour s’assurer que le test peut donner les meilleurs résultats. Le fixateur PFA à tampon neutre (4 % fraîchement préparé) est optimal pour le dosage recto-verso. Cependant, le test peut également être effectué sur des tissus congelés (OCT) avec les conditions de fixation post-cryosectionnement appropriées.
Le prétraitement des coupes de tissus est une étape cruciale. Il y a deux étapes de prétraitement dans ce test : la première est une récupération d’épitopes induite par la chaleur (HIER). Cette étape est importante pour l’inversion des réticulations des ponts méthylènes et la restauration des structures protéiques, ce qui est nécessaire dans les tissus fixés. L’efficacité de ce traitement dépend du temps, de la température, du type de tampon de récupération et du pH. Le deuxième prétraitement est une récupération d’épitopes induite par la protéase (PIER). Cette étape clive les peptides, exposant l’antigène ou les nucléotides, et utilise des enzymes telles que la protéinase K, la trypsine et la pepsine. Il s’agit d’une étape extrêmement sensible qui pourrait potentiellement endommager à la fois la morphologie des tissus et la cible d’intérêt. La concentration de l’enzyme, ainsi que le temps et la température d’incubation sont essentiels dans ce processus. La surdigestion entraîne une mauvaise démarcation des noyaux et des difficultés dans les étapes de quantification. Il est essentiel de trouver un équilibre entre un accès optimal à la cible ARN/ADN et des conditions de prétraitement qui n’endommagent pas le tissu ou la cible d’intérêt. Chaque type de tissu a un niveau de sensibilité différent à chacun de ces prétraitements et chaque paramètre (concentration enzymatique, temps, température) doit être testé empiriquement.
La rigueur du tampon de lavage est basée sur trois paramètres principaux : la température, la concentration des sels et du détergent et le temps. Le tampon de lavage est un tampon salin de citrate de sodium (SSC), et la concentration en sel à l’intérieur du tampon contrôle la rigueur pendant les étapes de lavage. Dans son protocole, ACD conseille d’utiliser le tampon de lavage à une concentration finale de 0,1x SSC, 0,03 % de dodécylsulfate de lithium. En travaillant sur l’optimisation du DNAscope et du multiplexage, nous avons déterminé que l’utilisation du tampon de lavage à une concentration finale de 0,05x SSC nous donnait de meilleurs résultats pour visualiser le signal de l’ADN et contribuait considérablement à réduire l’hybridation hors cible non spécifique résultant de l’incubation nocturne de la sonde sensorielle.
Le choix de l’approche de détection, chromogène (rouge ou brun) ou fluorescence, doit être réfléchi en fonction du type de tissu et de l’objectif avant de commencer le test. L’approche chromogène rouge donnera un joli contraste, car le rouge ne se trouve pas naturellement dans les tissus. Le chromogène brun donnera des résultats similaires au chromogène rouge. Cependant, il est important de garder à l’esprit que certains produits de dégradation du sang présents dans le tissu ont une couleur similaire, et l’encre de tatouage sera difficile à séparer du signal brun lors de la quantification. Une approche de détection par fluorescence permettra une distinction claire des différents marqueurs cellulaires et le multiplexage offrira un test parfait pour phénotyper les cellules hébergeant l’ARNv et/ou l’ADNv.
De multiples contrôles sont nécessaires pour garantir la spécificité des sondes et la qualité du dosage. Chaque sonde nouvellement conçue doit être testée sur des tissus de contrôle positifs et négatifs connus ou sur des pastilles cellulaires. Nous générons souvent des plasmides contenant la séquence que nous avons ciblée et effectuons la transfection dans des lignées cellulaires pour générer des contrôles positifs. Pour chaque passage, nous ajoutons un tissu négatif connu (VIH ou SIV négatif), un témoin sans sonde contenant uniquement le diluant de la sonde, et un témoin traité par RNase pour garantir la qualité et la spécificité du test.
La quantification est une étape extrêmement importante et doit être effectuée à l’aide des outils et de l’algorithme appropriés en fonction de la question posée. Dans ce manuscrit, nous avons présenté un logiciel d’analyse d’images (par exemple, Cellprofiler), que nous avons choisi après évaluation de plusieurs options. Nous avons estimé que ce logiciel était le meilleur logiciel pour nos besoins, mais il existe de nombreux logiciels d’analyse d’images qui pourraient être utilisés.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce projet a été financé en totalité par des fonds fédéraux de l’Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat n°. HHSN261200800001E et par l’Oregon National Primate Research Center NIH grant P51OD011092 (J.D.E). Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les opinions ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas l’approbation du gouvernement américain. Le duplex a été développé à l’aide d’Advanced Cell Diagnostics.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ACD HybEZII Hybridization system (110V) with ACD EZ-Batch Slides system | ACD | 321710 | Hybridization oven |
CAT Hematoxylin | Biocare medical | CATHE-GAL | colorstain |
Clear-Mount | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 17985-15 | mounting reagent for red chromogen |
Immpact DAB Peroxidase Kit | Vector | SK-4105 | Used to reveal HRP - DAB (Brown) to replace the DAB coming in the ACD kit |
lithium carbonate | Fisher chemical | L119-500 | bluing solution |
paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15714-S | for tissue fixation (4%) |
PBS | life technology | 14190-136 | |
Permount Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | SP15-100 | mounting regaent for brown chromogen |
Prolong Gold | ThermoFisher Scientific | P36930 | mounting regaent for fluorescence |
ribonucleases A | ThermoFisher Scientific | 12091039 | for RNAse treatment in DNAscope protocol |
ribonucleases T1 | Roche | R1003 | for RNAse treatment in DNAscope protocol |
RNAscope 2.5, 2-plex detection reagent | ACD | 322430 | Brown and red kit chromogen detection |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD | 322000 | retrieval buffer |
SuperFrost Plus Glass Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-17 | |
TBS | BOSTON BIOPRODUCTS | BM-301-4L | for washes |
TSA Plus Fluorescence palette kit (Cy3, Cy5, TMR, Fluorescein) | Perkin elmer | NEL760001KT | HRP Fluorescence detection |
Tween 20 | SIGMA | P1379-1L | for washes |
XYLENE 20LT | ThermoFisher Scientific | AC422680200 |
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