Un système implantable pour l’électromyographie chronique de Vivo

Résumé

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un système implantable pour l’enregistrement chronologique in vivo des potentiels électromyographiques évoqués et spontanés. Le système est appliqué à l’étude de la rénnervation des muscles laryngiens suite à des lésions nerveuses.

Résumé

L’électromyographie (EMG) mesure la réponse musculaire à la stimulation électrique ou à l’activité spontanée des unités motrices et joue un rôle important dans l’évaluation de la fonction neuromusculaire. L’enregistrement chronique de l’activité EMG reflétant le statut de réinnervation d’un muscle après une lésion nerveuse a été limité, en raison de la nature invasive des techniques traditionnelles d’enregistrement EMG. À cet égard, un système implantable est conçu pour l’enregistrement à long terme, in vivo EMG et la stimulation nerveuse. Il a été appliqué et testé dans une étude sur la rénnervation des muscles laryngiens. Ce système se compose de 1) deux poignets bipolaires de nerf d’électrode et conduit pour stimuler chacun des deux nerfs : le nerf laryngeal récurrent (RLN) et la branche interne du nerf laryngeal supérieur (SLN); 2) deux électrodes d’enregistrement EMG et conduits pour chacun des deux muscles laryngiens : le muscle cricoarytenoid postérieur (PCA) et le complexe musculaire cricoarytenoid-latéral thyroarytenoid-latéral (TA-LCA) ; et 3) un réceptacle cutané interfaçant tous les terminaux de plomb implantés à un préamplificateur et stimulateur d’enregistrement externe à l’aide d’un câble de connexion. Les fils métalliques sont en acier inoxydable de type 316 recouvert de téflon. Ils sont enroulés et peuvent s’étirer pendant le mouvement du corps de l’animal éveillé pour empêcher la rupture de plomb et la migration des électrodes. Ce système est implanté lors d’une chirurgie aseptique. Ensuite, les enregistrements EMG de base sont effectués avant que le RLN soit transecté dans la deuxième chirurgie pour étudier la réinnervation musculaire. Tout au long de l’étude, de multiples séances physiologiques sont menées chez l’animal anesthésié pour obtenir une activité EMG évoquée et spontanée qui reflète le statut de réinnervation des muscles laryngiens. Le système est compact, exempt d’infection au cours de l’étude, et très durable. Ce système implantable peut fournir une plate-forme fiable pour la recherche dans laquelle l’enregistrement à long terme ou la stimulation nerveuse est nécessaire chez un animal anesthésié ou en mouvement libre.

Introduction

L’enregistrement EMG est une technique utile pour mesurer l’activité électrique produite par un muscle squelettique lorsqu’elle est activée par la stimulation électrique de son nerf ou le tir spontané de ses unités motrices. La surveillance des signaux EMG peut être utilisée pour l’évaluation de la transmission neuromusculaire et de la biomécanique musculaire¹. L’enregistrement EMG joue également un rôle important dans la caractérisation de la qualité et de l’ampleur de la réinnervation musculaire suite à une blessure au nerf^2,3,4,5. Cependant, plusieurs enregistrements EMG sur toute la période de rénnervation ne peuvent pas être atteints par une approche invasive. Par conséquent, les dispositifs implantables ont été conçus et développés pour la stimulation et l’enregistrement répétés et chroniques dans les systèmes neuromusculaires^{6,7,8,9,10,11,12,13}. L’objectif de cet article est de décrire un protocole pour la fabrication et l’implantation d’un système stable pour obtenir des données chronologiques fiables EMG à partir du larynx.

Ce système est appliqué ici à l’étude de la réinnervation du muscle laryngique. Un bref aperçu du larynx est prévu pour l’orientation(figure 1). Une coordination précise entre les composants sensoriels et moteurs est essentielle pour un bon mouvement musculaire pendant la respiration, l’expression et la protection des voies respiratoires. Le muscle PCA, situé dans le larynx postérieur, est le seul ravisseur du pli vocal. Ce muscle est spontanément activé pendant l’inspiration pour augmenter la zone glottale pour l’inhalation. Le complexe TA-LCA est le principal adducteur du pli vocal. L’activation de ce complexe musculaire avec un autre adducteur (c.-à-d. le muscle interarytéoïde) médialiser le pli pour la production de vibrations et de sons et fermer le pli pour la protection des voies respiratoires pendant la déglutition.

En outre, les fibres de neurones moteurs innervate les muscles de ravisseur et d’adducteur dans le RLN. Les muscles abducteur et adducteur peuvent être distingués en fonction de la composition de l’unité motrice^14,15. Le muscle de PCA montre le tir accru pendant les conditions hypercapnices et/ou hypoxiques¹⁶ en raison de la présence d’unités motrices inspiratoires. En revanche, les unités motrices de fermeture glottique réflexe (RGC), qui ferment les glottis réflexivement par l’activation des récepteurs sensoriels dans la muqueuse laryngienne, est présente dans le complexe musculaire TA-LCA. La branche interne du nerf laryngeal supérieur (SLN) porte les fibres afférentes des récepteurs sensoriels dans le larynx¹⁷. Bien que l’expression soit principalement une fonction adducteur, les unités de moteur de ravisseur et d’adducteur sont impliquées dans ce comportement laryngeal fortement évolué.

Figure 1 : Anatomie du larynx. Les composants de ce système implantable sont également affichés. LE nerf laryngeal supérieur; RLN - nerf laryngeal récurrent; PCA - muscle cricoarytéoïde postérieur; TA-LCA - complexe musculaire cricoarytéoïde thyroarytéoïde-latéral; DBS - stimulation cérébrale profonde. Ce chiffre a été reproduit avec la permission de Wiley²⁷. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les blessures à la RLN peuvent entraîner une paralysie du pli vocal (VFP), ce qui compromet à la fois les fonctions d’enlèvement et d’adduction dues à la dénervation musculaire laryngienne^14,18,19. Par la suite, la régénération des fibres nerveuses RLN et la rénnervation des muscles se produit généralement. Cependant, la réinnervation est un processus aléatoire et se traduit par une reconnexion musculaire mal dirigée et inappropriée dans la plupart des cas. C’est ce qu’on appelle la synkinésie, dans laquelle l’activation spontanée des antagonistes des ravisseurs et des adducteurs est défectueuse et produit un mouvement inefficace, voire paradoxal, des plis vocaux^14,,19,20,21. Avec la synkinésie, la fonction critique qui est perdue est l’enlèvement de pli vocal, ayant pour résultat une ventilation inadéquate. Bien qu’il existe des tentatives continues pour traiter la synkinésie laryngienne par l’un ou l’autre) bloquant la fermeture glottique avec Botox^22,23 ou 2) stimuler électriquement l’ouverture glottique avec un stimulateur cardiaque implantable²⁴,^25,il n’y a aucune intervention clinique qui empêche de manière fiable la synkinèse²⁶. Cependant, il y a des preuves que le conditionnement électrique du muscle de PCA pendant la réinnervation à basse fréquence favorise la reconnexion neuromusculaire appropriée et minimise la synkinsis de se produire. Des études sont actuellement en cours pour élucider les mécanismes sous-jacents².

L’objectif de cet article est de décrire un système implantable simple et peu coûteux pour la stimulation nerveuse chronique et l’enregistrement EMG. Ce système peut être utilisé pour étudier les effets du conditionnement électrique à basse fréquence du muscle PCA sur la spécificité de sa réinnervation ultérieure. Les signaux EMG obtenus par ce système peuvent refléter la qualité et la quantité de réinnervation musculaire laryngienne au fil du temps.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Vanderbilt et a été menée conformément au Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Ce système comprend cinq composants implantables et un câble externe.

1. Deux menottes bipolaires d’électrode de stimulus RLN, chacune avec paire de fils de plomb enroulés et d’épingles terminales

1. Utilisez un fil en acier inoxydable de type 316 recouvert de téflon (d’un diamètre isolé de 0,0078" ou 0,198 mm) pour chaque fil de plomb de manchette. Couper une longueur de 70 cm de fil et l’enrouiller dans une ressort de 12 cm de long à l’aide d’un dispositif de bobine ou procurer des fils enroulés préfabriqués. Si nécessaire, étirer le ressort pour augmenter sa longueur pour chaque site d’implant. Laissez les extrémités des fils enroulés directement à 3 mm et 10 mm de longueurs et désinséculez-les.
2. Soudure une épingle femelle en cuivre plaqué or sur l’extrémité de 3 mm du plomb enroulé.
3. Pour préparer le brassard nerveux, couper un segment de 5 mm de tube de silicone (OD 0,156 , ID 0,094"; ou OD 3,96 mm, ID 2,39 mm) à partir d’un rouleau de la tuyauterie.
4. Pour insérer une avance dans le tube, utilisez une aiguille hypodermique de 25 G pour percer le mur de tubes à 1,5 mm de l’extrémité et hors centre près du mur intérieur. Remplir l’extrémité de 10 mm de la piste dans la pointe de l’aiguille. Retirez l’aiguille pour déposer la partie désinstallée dans le tube. Pliez l’extrémité du fil nu à l’extérieur du tube et tournez sur la tête à son point d’entrée dans le tube.
   REMARQUE: Utilisez un microscope de fonctionnement pour effectuer ces étapes. Une sonde peut être placée dans le tube pour courber le fil contre le mur intérieur. L’objectif est de positionner la partie nue du fil afin que les stimuli puissent être livrés au nerf sans risquer des dommages mécaniques au nerf.
5. Insérez la deuxième avance de 1,5 mm de l’extrémité opposée du tube à l’aide de la même procédure. Alignez le point d’entrée à celui de la première avance. Percer le mur avec l’aiguille de sorte que la partie nue du fil est déposée près du mur intérieur en face de la première piste.
   REMARQUE: En regardant vers le bas le tube, les deux électrodes de stimulus devraient former une forme de « V » de 45 degrés, qui chevauchera le nerf une fois en place et assurera la livraison actuelle par le nerf de l’anode à la cathode.
6. Faire une fente en forme de S dans la paroi du tube en face des points d’entrée de l’électrode à l’aide d’une paire de ciseaux incurvés.
   REMARQUE: Les lèvres spirales du brassard peuvent alors être ouvertes pour situer le nerf à l’intérieur entre les électrodes pendant la chirurgie.
7. Insérez une longueur de 6-0 monofilament, suture nonabsorbable dans la paroi de manchette à chaque extrémité à l’aide d’une aiguille microchirurgicale courbée pour la sécurisation éventuelle du brassard autour du nerf.
8. Appliquer le gel en silicone de type A de qualité médicale pour réinituler tout fil nu exposé à l’extérieur du brassard.

2. Deux menottes bipolaires d’électrode de stimulus SLN, chacune avec paire de fils de plomb enroulés et d’épingles terminales

1. Assembler le brassard d’électrode de stimulus SLN de la même manière que le brassard d’électrode de stimulus RLN. Cependant, utilisez le tube de diamètre plus petit (OD à 0,125 euros, ID à 0,062 po ; ou OD de 3,18 mm, ID et 1,57 mm), parce que le nerf est de plus petit diamètre.

3. Deux électrodes d’enregistrement d’enregistrement EMG de muscle PCA, chacune avec fil de plomb enroulé et épingle terminale

1. Assembler une piste enroulée pour l’électrode musculaire PCA comme fait dans l’étape 1.1.
2. S’insurquer une épingle femelle sur le plomb comme fait dans l’étape 1.2.
3. Insérez l’extrémité de 10 mm du muscle PCA conduire dans la pointe d’une stimulation cérébrale profonde (DBS) électrode en utilisant la même stratégie pour l’insertion de plomb d’aiguille dans un brassard (étape 1.4). Pliez l’extrémité de la piste pour former un crochet et le clip pour fournir un total de 5 mm de longueur d’enregistrement.
   REMARQUE: Dans cette application, le muscle PCA et ses terminaux nerveux réinnervables sont exposés au conditionnement électrique. Les stimuli sont générés par un générateur d’impulsions implantables (IPG) et livrés au muscle laryngeal par une électrode DBS(figure 1, encart). Ce système est adapté de la stimulation thérapeutique du cerveau (p. ex., la maladie de Parkinson). L’électrode DBS sera insérée dans une poche submusculaire et ancrée en place. Si la technologie pour le conditionnement électrique du muscle n’est pas nécessaire, l’électrode EMG PCA peut être directement insérée dans le muscle et ancrée par son crochet.

4. Deux électrodes d’enregistrement EMG du complexe musculaire TA-LCA, chacune avec fil de plomb enroulé et épingle terminale

1. Assembler une piste enroulée pour l’électrode musculaire TA-LCA comme fait dans l’étape 1.1.
2. S’insurquer une épingle femelle sur le plomb comme fait dans l’étape 1.2.
3. Accisez un morceau rectangulaire de 5 mm x 10 mm de greffe de polyester tricoté. Faire un trou au centre du maillage avec une aiguille hypodermique de 20 G. Introduisez l’extrémité de 10 mm de la piste dans le trou avec 3 mm de bobine supplémentaires dépassant au-delà du trou. Apposez le plomb au maillage à l’aide de 6-0 monofilament, suture nonabsorbable.
   REMARQUE: Ce morceau de maille sera utilisé pour ancrer l’électrode conduire à la cartilage thyroïde surlysant le complexe musculaire.
4. Pliez l’extrémité de la piste pour former un crochet et le clip pour fournir un total de 5 mm de longueur d’enregistrement.

5. Réceptacle de peau pour interfaçant les connexions entre les électrodes et l’équipement externe

1. Utilisez un connecteur à rayures femelles à une seule rangée pour faire le réceptacle. Couper deux morceaux (chacun de 17,5 mm de longueur) de la bande, chacun contenant huit trous d’épingle. Tout d’abord, rugueusez les surfaces extérieures de chaque pièce avec du papier de verre, puis collez-les avec du phénol dans un capot de fumée pour faire un connecteur à deux rangées. Placer le connecteur dans de l’eau de 60 à 80 oC dans une hotte à fumée pendant 30 minutes pour permettre le durcissement de la colle.
   REMARQUE: Ce format d’assemblage à deux rangées assurera la commodité dans l’attribution des trous d’épingle pour les électrodes gauche-à-droite.
2. Couper une pièce de 25,6 mm de longueur de la bande pour faire la face du connecteur (la partie qui dépassera à l’extérieur du site de l’implant pour l’ancrage de la peau). Couper un trou rectangulaire de 5,4 mm x 17,4 mm au milieu de la facette avec un scalpel.
3. Placez le connecteur à deux rangées à l’intérieur du trou rectangulaire de la facette jusqu’à ce qu’il soit rincé avec la surface de la face sans saillie. Si le connecteur ne rentre pas dans le trou rectangulaire de la face, le trou peut être légèrement agrandi avec un fichier. Puisque les trous de connecteur ne sont pas symétriques, insérez le bord de connecteur avec les trous de plus grand diamètre dans la plaque de face.
   REMARQUE: Par conséquent, une goupille femelle insérée dans le bord opposé du connecteur avec le trou de diamètre plus petit s’enclenchera et se verrouille en place.
4. Utilisez du phénol pour coller le connecteur et la plaque de face ensemble. Placer l’assemblage dans de l’eau de 60 à 80 oC dans une hotte à fumée pendant 30 minutes pour permettre le durcissement de la colle.
5. Percer un trou de 1,3 mm à chaque coin de la face et de chaque côté de la facette à mi-chemin des extrémités pour un total de six trous.
   REMARQUE: Ces trous seront utilisés pour suturer le réceptacle de la peau finale sur le site de l’implant.
6. Couper un tube de 15 mm de longueur de greffe de polyester tricoté pour entourer l’assemblage sous la plaque de face, ce qui rend l’assemblage biocompatible. Pour fixer le tube à l’assemblage, utilisez une aiguille hypodermique pour enfiler des fils en acier inoxydable à travers le mur à trois positions également espacées (chacune de 3,8 mm l’une de l’autre) le long de sa longueur.
7. Placez des encoches également espacées dans chaque coin du connecteur pour ancrer les fils contre la surface d’assemblage. Tordez les extrémités de chaque fil avec une paire de pinces pour serrer le tube à l’assemblage pour former une jupe.
8. Faites une marque permanente sur le patch en polyester à une extrémité du réceptacle.
   REMARQUE: Utilisez cette marque pour l’orientation afin d’identifier l’extrémité rostrale du réceptacle pendant la chirurgie de l’implant. Dans la direction rostrale à caudale, l’affectation suivante d’électrode d’épingle pour chacune des deux rangées (côté gauche et côté droit) devrait être la suivante : PCA EMG, TA-LCA EMG, trou vide, trou vide, anode RLN, cathode RLN, anode SLN et cathode SLN.

6. Câble de connexion externe à l’enregistrement pré-amplificateur et stimulateur

REMARQUE: Un câble est utilisé pour établir des connexions entre le réceptacle de la peau implanté et l’équipement externe pendant les séances d’enregistrement de stimulation nerveuse-EMG (sections 8 et 10). Il est composé de 12 fils isolés se terminant avec des broches mâles pour insérer dans les broches femelles dans le réceptacle de la peau. Ce câble se compose de deux parties : une fiche d’enregistrement EMG et des fils de stimulation nerveuse. Une fiche d’enregistrement est nécessaire pour isoler les signaux EMG à basse tension provenant d’artefacts de stimulation à haute tension rayonnant d’épingles de relance. Pour la même raison, deux trous dans chaque rangée du réceptacle de la peau sont laissés inoccupés pour séparer les broches d’enregistrement des broches de stimulation.

1. Pour faire la fiche d’enregistrement EMG, utilisez un connecteur à bande mâle (même longueur et largeur, mais la moitié de la hauteur d’un connecteur féminin). Coupez-le en deux morceaux, chacun ne contenant que deux trous. Apposez les deux pièces à l’aide d’adhésif phénol en utilisant la même approche pour faire le connecteur à double rangée dans le réceptacle de la peau (étape 5.1). Prenez les quatre fils d’enregistrement EMG dans le câble et insérez leurs broches mâles terminales dans chacun des quatre trous jusqu’à ce qu’ils se verrouillent en place avec les extrémités dépassant le bord de bande.
2. Utilisez du ciment osseux pour sceller le dessus de la prise pour isoler les jonctions de fil-pin.
3. Utilisez les huit fils restants dans le câble se terminant en broches mâles pour établir des connexions individuelles aux poignets de stimulation nerveuse par l’intermédiaire de leurs broches femelles.

7. Première chirurgie d’implant

1. Obtenir un chien de 1 à 2 ans, de 20 à 25 kg de l’un ou l’autre sexe d’une ferme autorisée. Acclimater l’animal avant la chirurgie d’implant aseptique. Autoclavez tout l’équipement avant la chirurgie. Retenir la nourriture pendant 10-12 h avant l’opération.
2. Préparer l’animal pour la chirurgie.
   1. Rasez la tête et le cou de l’animal et nettoyez la peau avec de l’alcool et de la solution de gommage de bêtadine. Anesthésiez l’animal par injection intraveineuse de 2 à 4 mg/kg de tiléamine et de zolazepam, suivi de 3 % d’isoflurane en oxygène par intubation.
   2. Placez l’animal sur une table d’opération avec un coussin chauffant en position de supine et drapez chirurgicalement l’animal. Surveillez la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire, la température corporelle et la saturation en oxygène des animaux au moins toutes les 15 minutes tout au long de la chirurgie afin d’assurer la stabilité physiologique à un plan modéré d’anesthésie.
3. Faire une incision du cou de milieu de ligne de l’encoche thyroïde au manubrium. Disséquez la trachée exempte de l’œsophage et exposez la bordure inférieure du cartilage cricoide.
4. Placez le brassard de stimulus sur chacun des SLN bilatéraux et des LRL. Fermez les lèvres de chaque brassard à l’aide des sutures fermées.
5. Faire une fenêtre de cartilage avec un poinçon de biopsie (4 mm de diamètre) à la surface antérieure du cartilage thyroïde de chaque côté. Exposez les aspects latéraux des deux complexes musculaires TA-LCA. Insérez les électrodes d’enregistrement EMG dans les complexes musculaires TA-LCA à l’aide d’une aiguille de 23 G en insérant la barbe dans la pointe de l’aiguille. Suture le patch en polyester d’électrode sur le cartilage.
6. Placez l’électrode DBS avec son électrode d’enregistrement EMG de crochet-fil compagnon sous le muscle PCA de chaque côté. Utilisez un endoscope pour confirmer que la stimulation produit l’enlèvement de pli vocal pour chaque canal. Ancrer les électrodes DBS au cartilage cricoide par 4-0 sutures nonabsorbables.
7. Insérez toutes les fils filaires des électrodes d’enregistrement de stimulation nerveuse-EMG dans le réceptacle par l’intermédiaire de leurs broches femelles. Appuyez sur les broches dans les trous avec un outil d’insertion façonné à partir d’un hémostat. Sceller la surface inférieure du réceptacle pour isoler les jonctions de plomb-pin à l’aide de ciment osseux.
   1. Après que le ciment durcit, placez le réceptacle à l’extrémité rostrale de l’incision de midline par la peau et suturez-la aux tissus sous-cutanés par l’intermédiaire de sa jupe en polyester. Attachez le bord de la peau au réceptacle par des sutures passant par les trous de la face.
      REMARQUE: Une mâchoire de l’hémostat a une fente d’extrémité menant à un trou de contre-évier. Le fil de plomb peut être placé à travers la fente dans le trou et le contre-vis placé contre la tête de la broche. La deuxième mâchoire est placée de l’autre côté du réceptacle. Presser l’hémostat appuie la broche dans son trou de réceptacle respectif.
8. Faites une incision sur le cou gauche pour exposer le muscle trapèze. Effectuez la dissection pour faire une poche sousmusculaire pour le placement du générateur d’impulsion implantable. Tunnel chaque DBS plomb sous-cutanée à l’incision du cou pour l’insertion dans l’IPG.
9. Fermez toutes les plaies chirurgicales avec des sutures. Surveillez l’animal de près jusqu’à la récupération complète de la chirurgie.
10. Fournir des analgésiques postopératoires (p. ex., buprénorphine : 0,01 à 0,02 mg/kg) de façon routinière jusqu’à 48 h. Administrer des antibiotiques (p. ex., la céfpodoxime : 10 mg/kg) oralement à l’animal pendant au moins 3 jours. Loger l’animal individuellement par la suite pendant tout au long de l’étude, et de restreindre l’exercice pendant une période de 10 jours pour permettre la cicatrisation normale des plaies et la stabilisation du dispositif implanté.
    REMARQUE: Le réceptacle de peau doit être nettoyé quotidiennement avec la solution antiseptique compatible avec les tissus. En outre, les broches mâles factices doivent être insérées dans les broches femelles du réceptacle de peau régulièrement excepté pendant les sessions d’enregistrement d’EMG. Cette manœuvre permettra d’éviter l’accumulation de débris dans le réceptacle, permettra de dégager des connexions efficaces avec le câble externe et de prévenir l’infection.

8. Séances d’enregistrement de stimulation nerveuse-EMG à baseline

REMARQUE: Effectuez ces séances 2x-3x après chirurgie d’implant (section 7) et avant la chirurgie de transection nerveuse (section 9) pour obtenir des signaux EMG de base lorsque les RLN bilatéraux sont intacts. Appliquer le protocole suivant lors d’une séance standard d’enregistrement de stimulation nerveuse-EMG (sections 8 et 10).

1. Retenir les aliments avant la procédure pour 10-12 h. Anesthésiez l’animal avec la combinaison de tiletamine et de zolazepam (dose initiale de chargement de 2 à 4 mg/kg par injection intraveineuse, puis maintenez avec 0,4 mg/kg par heure via une ligne i.v.). Placez l’animal sur un coussin chauffant en position de supine et maintenez l’animal dans un plan modéré d’anesthésie. Surveillez les éléments vitaux de l’animal pendant la procédure, comme décrit à l’étape 7.2.
2. Insérez un endoscope rigide à zéro degré avec une caméra vidéo CCD attachée à travers un laryngoscope pour visualiser le mouvement du pli vocal au niveau des glottes.
3. Interfacez le câble externe qui se connecte au stimulateur de laboratoire et aux préamplificateurs EMG au réceptacle de peau par l’intermédiaire de sa prise et de ses broches. Connectez les sorties des préamplificateurs à un dispositif d’acquisition de données et/ou à un oscilloscope pour afficher, enregistrer et mesurer les signaux EMG.
4. Fournir des stimuli (impulsions à ondes carrées simples, durée de 0,1 à 0,5 ms, 0,5 à 2,0 mA d’amplitude) aux RLN gauche et droite, respectivement, pour enregistrer les réponses émG évoquées des complexes bilatéraux TA-LCA et des muscles de PCA dans chaque condition.
5. Fournir des stimuli (impulsions à ondes carrées simples, durée de 0,1 à 0,5 ms, 0,5 à 2,0 mA d’amplitude) aux SLN gauche et droite, respectivement, pour enregistrer les réponses émG évoquées des complexes bilatéraux TA-LCA et des muscles de PCA dans chaque condition.
6. Fournir du CO₂ mélangé avec de l’air de la pièce par la bouche de l’animal pour induire l’hypercapnie et augmenter l’effort respiratoire de l’animal. Limitez l’exposition à 1 min, au cours de laquelle le recrutement maximal d’unités motrices inspiratoires aura lieu. Enregistrez les activités spontanées d’EMG des complexes TA-LCA et des muscles de PCA sous cette condition hypercapnique.
7. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement de l’anesthésie et retournez l’animal à l’installation.

9. Deuxième chirurgie pour la transection nerveuse et l’anastomose

1. Effectuez la deuxième chirurgie 10-14 jours après la première chirurgie. Retenir la nourriture pendant 10-12 h avant la chirurgie.
2. Anesthésiez l’animal, drapez et surveillez les signes vitaux en utilisant peropératoirement la technique décrite à l’étape 7.2.
3. Enlever les sutures et rouvrir l’incision de midline par dissection émoussée chaque fois que possible. Évitez les dommages à l’implantation précédente pendant la dissection. Exposez les LNL bilatérales par dissection. Isoler, transecter et anastomose chaque nerf avec 7-0 monofilament, sutures nonabsorbables pour induire la paralysie laryngeale bilatérale.
4. Irriguer l’incision du cou avec un antibiotique salin stérile et de gentamycine. Fermez les tissus musculaires et sous-cutanés à l’aide de sutures absorbables 3-0. Fermer la peau avec 3-0 sutures monofilament nonabsorbables.
5. Surveillez de près l’animal jusqu’à la récupération complète après la chirurgie.
6. Fournir des analgésiques (p. ex., buprénorphine : 0,01 à 0,02 mg/kg) de façon systématique jusqu’à 48 h postopératoirement. Donnez des antibiotiques (p. ex., cefpodoxime : 10 mg/kg) par voie orale à l’animal pendant au moins 3 jours. Limitez l’animal de l’exercice pendant une période de 10 jours pour permettre la cicatrisation normale des plaies.

10. Séances d’enregistrement de stimulation nerveuse-EMG à la suite de blessures bilatérales au RLN

1. Effectuez ces séances 1x par semaine au cours des 3 premiers mois, puis bihebdomadaire par la suite. Suivez le protocole décrit à la section 8 pour ces séances.

Résultats

Des exemples des composants sont indiqués dans la figure 2. De gauche à droite dans la figure 2A sont le brassard de stimulus nerveux, l’électrode d’enregistrement TA-LCA, l’électrode d’enregistrement PCA, et le réceptacle d’interface de peau, respectivement. La taille relative de ces composants peut être appréciée. Le réceptacle de la peau(figure 2B) a deux rangées de trous dans lesquels les broches femelles à l’extrémité de chaque fil enroulé(figure 2D) sont insérés. Ils sont insérés en face de la face (flèche) pendant la chirurgie d’implantation. Le réceptacle a une jupe en polyester(figure 2C) attachée à ses parois latérales connectrices. Cette jupe est conçue pour ancrer le réceptacle en position par infiltration de tissu conjonctif. Chaque plomb EMG en acier inoxydable enduit de téflon(figure 2E) est désinstallé (5 mm) à l’extrémité pour former une électrode en forme de crochet pour l’enregistrement musculaire. Le brassard de stimulation a deux électrodes enfilées contre le mur de manchette interne. Ils sont séparés par une distance de 2 mm(figure 2F) et forment une forme « V »(figure 2G) pour assurer la livraison actuelle à travers le nerf.

Figure 2 : Composants du système d’implant. (A) de gauche à droite se trouve le brassard de stimulus nerveux, l’électrode d’enregistrement TA-LCA, l’électrode d’enregistrement PCA et le réceptacle d’interface de peau, respectivement. (B) Le réceptacle de peau montrant deux rangées de trous. (C) Le réceptacle montrant une jupe en polyester attachée à ses parois latérales connectrices. (D) Le fil enroulé contenant des broches femelles à insérer dans B. (E) le plomb EMG en acier inoxydable enduit de téflon est désinstallé (5 mm) à l’extrémité pour former une électrode en forme de crochet pour l’enregistrement musculaire. (F) Le brassard de stimulation a deux électrodes enfilées contre le mur de manchette interne, qui sont séparés par 2 mm.  (G) formation de forme "V" d’électrodes pour assurer la livraison actuelle à travers le nerf. Ce chiffre a été modifié avec la permission²⁷. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La figure 3 montre le réceptacle de la peau implanté et la façon dont le câble de l’équipement externe est interagé aux réceptacles. Il convient de noter que les broches mâles factices (non montrées) sont insérées dans les broches femelles du réceptacle pour les garder exemptes de débris entre les sessions d’enregistrement.

Figure 3 : Réceptacle de peau et câble d’interface. (A) Le réceptacle de peau implanté sur le cou antérieur sans broches mâles factices est montré. (B) L’image montre comment les broches de stimulus et la fiche d’enregistrement EMG (flèche) du câble à partir de l’équipement externe sont interambusées au réceptacle au cours d’une séance d’enregistrement stimulation nerveuse-EMG. Ce chiffre a été modifié avec la permission²⁷. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La figure 4 montre un enregistrement EMG de l’une des sessions de référence avec les LNL intactes.

Figure 4 : Enregistrements EMG des muscles laryngiques avec l’innervation normale. (A) Exemple d’enregistrement du muscle PCA où la stimulation RLN produit un artefact de stimulus (flèche) suivi d’un grand potentiel d’EMG évoqué. (B) Exemple d’enregistrement du complexe musculaire TA-LCA, dans lequel la stimulation SLN produit un artefact de stimulus (flèche). Représenté ici est (a) une réponse musculaire monosynaptique de latence courte et (b) une réponse polysynaptique plus longue de RGC. (C) Bursts (flèches) de l’activité EMG spontanée enregistrée à partir du muscle PCA lors d’inspirations normales. (D) Augmentation de l’activité EMG inspiratoire au cours de la livraison de CO_2. Ce chiffre a été modifié avec la permission²⁷. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dans un enregistrement du muscle PCA(figure 4A), la stimulation RLN produit un artefact de stimulus (flèche) suivi d’un grand potentiel d’EMG évoqué. Les réponses maximales RLN-évoquées fournissent un bon indice de l’ampleur globale de l’innervation normale aussi bien que le niveau de réinnervation suivant la neurorrhaphy suivante, indépendamment du type d’unité de moteur. C’est vrai parce que le RLN contient des fibres nerveuses des unités motrices de fermeture glottique inspiratoires et réflexes (RGC). La stimulation RLN recrute les deux types d’unités. L’activité de l’unité moteur EMG évoquée est rectifiée et intégrée sur une période de 20 ms pour obtenir une mesure quantitative de l’innervation musculaire.

Dans un enregistrement du complexe musculaire TA-LCA(figure 4B), la stimulation SLN produit un artefact de stimulus (flèche). Cet artefact est suivi d’une réponse musculaire monosynaptique à latence courte (a) et d’une réponse RGC polysynaptique à latence plus longue (b). Le potentiel (a) est une réponse directe du muscle cricothyroïde, parce que ce muscle est innervated par la branche externe voisine de la SLN. L’activation errante de cette branche se produit généralement pendant la stimulation de manchette de nerf de la branche interne pour activer la réponse de RGC. Le potentiel cricothyroïde est enregistré par l’électrode TA-LCA, car ce muscle est situé près du complexe. Des études antérieures ont montré que le potentiel cricothyroïde évoqué par la stimulation interne des branches peut être supprimé sélectivement en sectionnant la branche externe du SLN (Zealear, observations inédites). Les réponses EMG maximales évocées par SLN reflètent l’ampleur de l’innervation naturelle du complexe TA-LCA par sa voie sensorielle-moteur RGC. Avant la neurorrhaphy de RLN, il n’y a aucune innervation de RGC du muscle de PCA, ainsi aucun potentiel de SLN ne devrait être détecté de ce muscle. Après la transection et la réparation de nerf, les potentiels SLN-évoqués reflètent la quantité de réinnervation correcte de RGC du complexe de TA-LCA et la réinnervation incorrecte de RGC du muscle de PCA. L’activité RGC est quantifiée par rectification et intégration sur une période de 20 ms pour capturer l’ensemble de la forme d’onde RGC.

Dans (figure 4C), des éclats (flèches) de l’activité spontanée EMG sont enregistrés à partir du muscle PCA lors d’inspirations normales. Cette activité inspiratrice d’EMG augmente au cours de la livraison de CO_2, comme le montre lafigure 4D( à une vitesse de balayage plus lente. L’activité spontanée d’EMG de PCA fournit une bonne estimation de l’ampleur de l’innervation normale de ce muscle par ses motoneurons inspiratoires originaux. Il n’y a pas d’innervation inspiratoire du complexe TA-LCA, donc aucun potentiel inspiratoire ne devrait être détecté à partir de ces muscles. C’est parce que seules les unités motrices inspiratoires sont impliquées dans l’enlèvement du pli vocal à l’effort inspiratoire maximal dans l’animal anesthésié. Après la transection et la réparation de nerf, les potentiels inspiratoires spontanés reflètent l’ampleur de la rénnervation correcte du muscle de PCA et l’ampleur de la réinnervation incorrecte du complexe TA-LCA. Les enregistrements de l’activité INspiratoire emG sont amplifiés, rectifiés et intégrés sur une période de 8 s.

Discussion

Cet article décrit les étapes requises dans la fabrication d’un système nouveau, économique et implantable pour la stimulation des nerfs laryngiques et l’enregistrement des réponses EMG des muscles laryngiens sur un long terme. Le protocole est simple et peut produire un implant qui est assez compact pour être utilisé chez un animal aussi petit qu’un rat. Il y a plusieurs étapes critiques qui devraient être soulignées. Tout d’abord, les fils de plomb doivent être enroulés soigneusement et uniformément pour empêcher la désolation du plomb, le pliage ou la rupture. Si une machine à bobine n’est pas disponible, des fils enroulés préfabriqués peuvent être obtenus commercialement. Deuxièmement, la stratégie d’insertion de fils de plomb dans un tube de silicone pour former un «V» qui chevauche le nerf est essentiel pour promouvoir la livraison actuelle à travers le nerf à l’intérieur du brassard. Si les deux fils sont placés sur le même côté du tube, le shunting du courant entre les électrodes peut se produire. Il est également important que les fils soient placés contre le mur intérieur du tube pour éviter la possibilité de lésions cérébrales.

Troisièmement, pendant la chirurgie d’implantation, les nerfs laryngiques doivent être disséqués soigneusement pour empêcher des dommages. Au stade ultérieur de l’implantation, lors de l’insertion des broches dans le réceptacle, la force doit être appliquée sur la broche en alignement sur son trou pour empêcher une flexion soudaine de la tête de la broche. Par la suite, le ciment osseux doit être distribué en profondeur sur le fond du réceptacle pour l’isolation complète et la prévention du crosstalk entre les canaux. Enfin, la prévention de l’infection est essentielle pour assurer l’intégrité du système d’implant au fil du temps. Il peut être réalisé par une combinaison de plusieurs manœuvres: ajout d’une jupe au réceptacle, administration d’antibiotiques, nettoyage quotidien de la plaie et du réceptacle avec une solution antiseptique compatible avec les tissus, et le placement de broches mâles factices dans les broches femelles du réceptacle pour les garder propres des débris entre les sessions.

Le protocole a été prouvé succès dans ce modèle de laryngeal de chien. Toutefois, certaines modifications ou stratégies alternatives peuvent être envisagées pour d’autres applications. Par exemple, les pointes de détection désinsimulées des électrodes EMG PCA et TA-LCA sont ancrées dans les muscles par un moyen externe, soit la greffe de polyester, soit par l’électrode DBS. Dans une application dans laquelle l’ancrage externe n’est pas nécessaire ou effectué, le barb de l’électrode seul peut servir d’ancre. Dans un tel cas, le fil de monofilament en acier inoxydable enduit de téflon peut être préférable au fil multifilament en raison de sa plus grande résistance tendue, fournissant un barb plus stable dans les tissus. Cependant, il convient de noter que les fils multifilaments peuvent être moins enclins à la rupture. Une stratégie alternative à la fabrication et à l’assemblage du réceptacle de la peau consiste à imprimer en 3D à l’aide de polymères biocompatibles (p. ex., MED610 par Stratasys). Cela peut simplifier le processus de fabrication.

Après la chirurgie d’implantation et la récupération de l’animal, des sessions physiologiques sont menées avec les LNL encore intactes pour obtenir des données de base. Pendant une session, l’absence de signaux EMG d’un muscle laryngeal peut se produire après la stimulation RLN. Afin de dépanner la cause (tableau 1), il faut d’abord déterminer si le mouvement du pli vocal est présent. S’il est présent, cela signifie que le nerf est effectivement activé par le brassard, mais il ya un problème avec le plomb EMG. Dans cette situation, les utilisateurs devraient examiner davantage l’artefact de stimulation EMG. Si l’artefact EMG est absent, il est probable qu’il y ait une discontinuité dans l’entrée emG au préamplificateur. Le bruit de soixante cycles sera également présent et grand dans l’amplitude. Si l’artefact est grand, le shunting d’une goupille de stimulus à la goupille d’enregistrement peut être responsable de la saturation du préamplificateur du canal et d’effacer la réponse EMG. Si l’artefact est normal, alors le plomb EMG a probablement disloqué du muscle et ne peut pas détecter son activité. D’autre part, si le mouvement de pli vocal est absent, alors le nerf n’est pas activé. Si l’artefact est absent, il peut y avoir une discontinuité dans le circuit de stimulation, empêchant l’activation du nerf. Si l’artefact semble normal, le nerf peut avoir été blessé pendant la chirurgie d’implant ou le brassard peut avoir migré outre du nerf. Une stratégie similaire peut être appliquée pour dépanner la cause des signaux EMG absents pendant la stimulation SLN.

Nerf stimulé	Muscle cible(s)	Mouvement de pli vocal ipsilateral	Artefact de stimulation	Causes
RLN (RLN)	PCA et/ou TA-LCA	Oui	Absent (60 cycles de bruit présent)	Discontinuité dans l’entrée EMG au préamplificateur (p. ex. plomb, broche, câble);
			Grande	Cross-talk entre stim et épinglettes d’enregistrement au réceptacle
			Normal	Dislocation d’électrode EMG
		non	Absent	Discontinuité dans le circuit de stimulation
			Normal	1. Blessure RLN; 2. Dislocation de manchette
Sln	Ta-LCA	Oui	Absent (60 cycles de bruit présent)	Discontinuité dans l’entrée EMG au préamplificateur (p. ex. plomb, broche, câble);
			Grande	Cross-talk entre stim et épinglettes d’enregistrement au réceptacle
			Normal	Dislocation d’électrode EMG
		non	Absent	Discontinuité dans le circuit de stimulation
			Normal	1. Blessures à SLN ou RLN; 2. Dislocation de manchette

Tableau 1 : Guide de dépannage.

Il convient de mentionner qu’il y a deux limites mineures dans l’application actuelle de cette technologie. Tout d’abord, la flexion soudaine de la goupille femelle pendant l’insertion dans le réceptacle s’est produite dans plusieurs cas. Heureusement, les broches peuvent être redressées et insérées dans leurs trous avec succès. Si les dommages causés par la broche sont irréparables, le plomb et l’ensemble de son composant doivent être remplacés. Par conséquent, les composants de sauvegarde doivent être facilement disponibles avant la chirurgie. Deuxièmement, le temps nécessaire pour terminer l’implantation chirurgicale est long (10 h). La longue durée reflète en partie le grand nombre de composants de stimulation et de recodage requis pour cette étude : quatre nerfs, quatre muscles, un réceptacle et un IPG. Si moins de composants sont nécessaires à l’aide de cette technologie, le temps d’implantation devrait être considérablement réduit (p. ex., le modèle de langue de rat²⁸).

Cette approche technologique introduit plusieurs caractéristiques qui ont un avantage sur les méthodes existantes. L’encoulage des fils de plomb est la caractéristique la plus nouvelle et la plus importante de ce système. Les pistes enroulées ne sont pas couramment disponibles pour l’expérimentation animale non commerciale malgré les nombreux avantages qu’elles procurent. Un plomb enroulé peut être étendu à la longueur désirée pendant l’implantation. En outre, il s’étirera dans le éveillé, déplaçant l’animal pour empêcher la dislocation de la pointe d’électrode ou de rupture de fil après l’implantation. Cette fonctionnalité assure la longévité de l’implant et la stimulation nerveuse stable et l’enregistrement musculaire sur le long terme. En outre, l’ajout d’une jupe compatible tissu autour du réceptacle empêche l’exposition de la plaie à ce corps étranger et favorise la fibrose normale et la cicatrisation des plaies en l’absence d’infection. Des études antérieures sans cette jupe ont eu comme conséquence l’infection tôt et l’arrêt prématuré de l’expérience. Enfin, ce système d’implant est compact et multicanalisé, permettant l’acquisition efficace de données à partir de nombreuses structures neuromusculaires dans des modèles animaux de tailles diverses.

Cette approche technique a été adaptée et traduite avec succès sur un modèle de rat. Cette étude a été conçue pour étudier l’effet du conditionnement électrique en empêchant l’atrophie de muscle de langue et le dysfonctionnement dans le rat vieillissant. Les nerfs hypoglossal ont été implantés avec les électrodes de manchette pour le conditionnement et la langue implantée avec les électrodes d’enregistrement EMG²⁸. Cette technologie peut également être utilisée dans d’autres applications de recherche. Comme une extension du protocole actuel dans le larynx canin, les effets du conditionnement électrique sur la promotion de la réinnervation sélective sont actuellement à l’étude dans les muscles faciaux de lapin. Cette étude peut fournir une base pour la prévention de la synkinésie faciale chez les patients atteints de paralysie de Bell, une condition médicale commune et débilitante. Une dernière utilisation potentielle de cette technologie est de stimuler et d’enregistrer des animaux éveillés et en mouvement libre. À l’heure actuelle, ces données ont été obtenues par câble externe de rats éveillés et non retenus²⁸. À l’avenir, ce système économique pourrait également être combiné à une technologie de stimulation de l’enregistrement à distance (p. ex., télémétrie) pour activer ou sonder les systèmes neuromusculaires sans fil.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G x 1" Gauge hypodermic needle	BD	305175
23 G x 1" Gauge hypodermic needle	BD	305145
25 G x 1" Gauge hypodermic needle	BD	305125
3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL	Ethicon	J219H
3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene	Ethicon	8684G
4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene	Ethicon	8871H
6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene	Ethicon	8805
7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene	Ethicon	M8735
Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98%	ACROS	code 194790100	for dilution of modical adhesive silicone
Bone cement	Zimmer	1102-16	20g powder 10 mL liquid
Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl)	Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd	12496-0757-1
CCD video camera attached to the endoscope	Sony	MCC500MD
Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets)	Zoetis	5228
Data acquisition device , PowerLab 16/35	ADInstruments, Inc	5761-E
Deep-brain stimulation (DBS) electrodes	Abbott	6172ANS
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO71304SX
Implantable pulse generator (IPG), Infinity	Abbott	6660ANS
Knitted polyester graft	Meadox Medical Inc	92220	20 mm in diameter
Medical Grade Polyethylene Micro Tubing	Amazon.com	BB31695-PE/13-10	OD 0.156", ID 0.094"
Metal female pin	Allied Electronics & Automation	220-S02-100
Metal male pin	CDM electronics	220-p02-1
Prefabricated coiled leads	Medical innovations Inc.
Silastic Laboratory Tubing	Cole-Parmer	2415569	OD 0.125", ID 0.062"
Silastic Medical Adhesive Silicone	Dow corning	Type A, 2 oz
Stainless steel monofilament wire	The Harris Products Group	type 316	0.008" (coated), 0.005" (bare)
Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm)	Sklar Instruments	96-1146
Strip connector	CDM electronics	2.6 x 11.6 x 101.5 mm	single row, round, through hole
Teflon-coated multi-filament stainless steel wire	Medwire	Part 316, ss7/44T
Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL	Zoetis	004866
Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon	Zoetis	540561
Zero-degree rigid endoscope	Karl Storz	8712AA