Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels

Résumé

Nous présentons un dispositif microfluidique centrifuge à moteur qui peut cultiver des sphéroïdes cellulaires. À l'aide de cet appareil, les sphéroïdes de types de cellules simples ou multiples pourraient être facilement cocultivés dans des conditions de haute gravité.

Résumé

Une culture tridimensionnelle de cellules sphéroïdes peut obtenir des résultats plus utiles dans les expériences cellulaires parce qu'elle peut mieux simuler les microenvironnements cellulaires du corps vivant que la culture cellulaire bidimensionnelle. Dans cette étude, nous avons fabriqué une plate-forme de culture de laboratoire sur un CD (disque compact) à moteur électrique, appelée système de culture sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS), pour créer des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels (3D) mettant en œuvre une force centrifuge élevée. Cet appareil peut varier les vitesses de rotation pour générer des conditions de gravité de 1 x g à 521 x g. Le système CMS est de 6 cm de diamètre, a cent 400 micropuits m, et est fait en moulage avec du polydiméthylsiloxane dans un moule en polycarbonate préfabriqué par une machine de contrôle numérique de l'ordinateur. Un mur de barrière à l'entrée du canal du système CMS utilise la force centrifuge pour répartir les cellules uniformément à l'intérieur de la puce. À l'extrémité du chenal, il y a une région de glissement qui permet aux cellules d'entrer dans les micropuits. Comme démonstration, les sphéroïdes ont été générés par la monoculture et la coculture des cellules souches adipeuses humaines et des fibroblastes pulmonaires humains dans des conditions de haute gravité utilisant le système. Le système CMS a utilisé un schéma d'opération simple pour produire des sphéroïdes de coculture de diverses structures de concentrique, Janus, et sandwich. Le système CMS sera utile dans les études de biologie cellulaire et d'ingénierie tissulaire qui nécessitent des sphéroïdes et la culture organoïde de types de cellules simples ou multiples.

Introduction

Il est plus facile de simuler des microenvironnements biologiques in vivo avec une culture tridimensionnelle (3D) de cellules sphéroïdes qu'avec la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) (p. ex., la culture conventionnelle des cellules de plat Petri) pour produire une culture expérimentale plus réaliste sur le plan physiologique résultats¹. Actuellement disponibles méthodes de formation sphéroïde comprennent la technique de chute de suspension², technique de superpose use liquide³, technique de cellulose carboxymethyl⁴, technique microfluidique à base de force magnétique⁵, et l'utilisation de bioréacteurs⁶. Bien que chaque méthode ait ses propres avantages, une amélioration supplémentaire de la reproductibilité, de la productivité et de la production de sphéroïdes de coculture est nécessaire. Par exemple, alors que la technique microfluidique à base de force magnétique⁵ est relativement peu coûteuse, les effets des champs magnétiques forts sur les cellules vivantes doivent être soigneusement examinés. Les avantages de la culture sphéroïde, en particulier dans l'étude de la différenciation et de la prolifération des cellules souches mésenchymales, ont été rapportés dans plusieurs études^7,8,9.

Le système microfluidique centrifuge, également connu sous le nom de laboratoire-sur-un-CD (disque compact), est utile pour contrôler facilement le fluide à l'intérieur et exploiter la rotation du substrat et a donc été utilisé dans des applications biomédicales telles que les immunossays¹⁰, essais colorimétriques pour détecter les marqueurs biochimiques¹¹, amplification de l'acide nucléique (PCR), systèmes automatisés d'analyse sanguine¹², et tout-en-un dispositifs microfluidiques centrifuges¹³. La force motrice contrôlant le fluide est la force centripète créée par la rotation. En outre, plusieurs fonctions de mixage, de valorisation et de fractionnement d'échantillons peuvent être effectuées simplement dans cette plate-forme CD unique. Cependant, par rapport aux méthodes d'analyse biochimique mentionnées ci-dessus, il y a eu moins d'essais appliquant des plates-formes de CD aux cellules de culture, en particulier les sphéroïdes^14.

Dans cette étude, nous montrons la performance du système sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS) par monoculture ou coculture de cellules souches d'adipose humaine (hASC) et de fibroblastes pulmonaires humains (MRC-5). Cet article décrit en détail la méthodologie de recherche de notre groupe¹⁵. Ainsi, la plate-forme de laboratoire de culture sphéroïde sur un CD peut être facilement reproduite. Un système de génération CMS comprenant une puce de culture CMS, un support de puce, un moteur DC, une monture de moteur, et une plate-forme tournante, est présenté. La monture moteur est imprimée en 3D avec du styrène butadéin acrylonitrile (ABS). Le support de puce et la plate-forme rotative sont CNC (contrôle numérique de l'ordinateur) usiné avec le PC (polycarbonate). La vitesse de rotation du moteur est contrôlée de 200 à 4 500 tr/min en codant un algorithme PID (proportionnel-dérivé-dérivé) basé sur la modulation de la largeur des impulsions. Ses dimensions sont 100 mm x 100 mm x 150 mm et il pèse 860 g, ce qui le rend facile à manipuler. En utilisant le système CMS, les sphéroïdes peuvent être générés dans diverses conditions de gravité de 1 x g à 521 x g, de sorte que l'étude de la promotion de la différenciation cellulaire sous haute gravité peut être étendue à partir de cellules 2D^16,17 à 3D Sphéroïde. La coculture de divers types de cellules est également une technologie clé pour imiter efficacement l'environnement in vivo¹⁸. Le système CMS peut facilement générer des sphéroïdes monoculturels, ainsi que des sphéroïdes de coculture de différents types de structures (p. ex. concentrique, Janus et sandwich). Le système CMS peut être utilisé non seulement dans de simples études sphéroïdes, mais aussi dans des études d'organoïdes 3D, pour tenir compte des structures des organes humains.

Protocole

1. Fabrication de puces de culture à base de microfluoïdes centrifuges (CMS)

1. Faire des moules PC pour les couches supérieures et inférieures de la puce de culture CMS par l'usinage CNC. Les dimensions détaillées de la puce sont indiquées à la figure 1.
2. Mélanger la base PDMS et l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 10:1 (w/w) pendant 5 min et placer dans un dessiccateur pendant 1 h pour enlever les bulles d'air.
3. Après avoir versé le mélange De PDMS dans les moules de la puce de culture CMS, retirer les bulles d'air pendant 1 h de plus et guérir dans une chambre chauffante à 80 oC pendant 2 h.
4. Placez-les dans le nettoyeur de plasma aspiré avec les surfaces à recollé s'il fait face et exposez-les au plasma assisté par air à une puissance de 18 W pour 30 s.
5. Attachez les deux couches de la puce de culture CMS et placez-la dans la chambre chauffre à 80 oC pendant 30 min pour augmenter la force d'adhérence.
6. Stériliser la puce de culture CMS dans un stérilisateur autoclave à 121 oC et 15 psi.

2. Préparation cellulaire

1. Décongeler le 1 ml de flacon contenant 5 à 10⁵et 10⁶ cellules de LAC ou DEM5 dans un bain d'eau à 36,5 oC pendant 2 min.
2. Ajouter 1 ml de Médium Aigle Modifié (DMEM) de Dulbecco dans un flacon et mélanger délicatement avec une pipette de 1 000 l.
3. Mettre 15 ml de la DMEM préréchauffée à 36,5 oC dans un plat Petri de 150 mm de diamètre à l'aide d'une pipette et ajouter les cellules du flacon.
4. Après 1 jour, aspirez le DMEM et remplacez-le par 15 ml de DMEM frais. Par la suite, changez les médias tous les 2 ou 3 jours.
5. Pour détacher les cellules du plat Petri, ajouter 4 ml de trypsine aux plats Petri et les placer dans un incubateur à 36,5 oC et 5 % de CO₂ pendant 4 min.

3. Formation sphéroïde de monoculture

1. Mettre 2,5 mL de 4 % (w/v) solution pluronique F-127 dans le trou d'entrée de la puce de culture CMS (Figure 2A) tout en faisant pivoter la puce à 500 à 1 000 tr/min, puis faire pivoter la puce à 4 000 tr/min pendant 3 min à l'aide du système CMS (Figure 2B).
   REMARQUE : Le revêtement pluronique empêche l'attachement cellulaire au port d'entrée pendant que la puce tourne. Assurez-vous que l'air n'est pas emprisonné dans les micropuits.
2. Incuber la puce de culture CMS remplie de solution pluronique pendant la nuit à 36,5 oC dans 5 % de CO₂.
3. Retirez la solution pluronique, lavez la solution pluronique restante avec DMEM, et séchez la puce pendant 12 h sur un banc propre.
4. Ajouter 2,5 ml de DMEM à la puce de culture CMS et faire pivoter la puce à 4 000 tr/min pendant 3 min pour prémouiller l'intérieur de la puce.
5. Arrêtez la rotation et retirez 100 l de DMEM pour faire de la place pour l'injection de la suspension cellulaire.
6. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires qui contiennent soit 5 '10⁵ hASCs ou 8 '10⁵ MRC-5s par pipetting Distribuer uniformément les cellules en pipetting 3-5x pour la resuspension.
7. Faire pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min pour piéger les cellules de chaque micropuits par une force centrifuge.
   REMARQUE : Une vitesse de rotation excessive peut provoquer une évasion cellulaire par des trous d'éjection de solution.
8. Culture des cellules pendant 3 jours dans l'incubateur à 36,5 oC, 95 % d'humidité, et 5 % de CO_2,tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Changer de culture média tous les jours.

4. Formation sphéroïde de coculture

1. Formation de sphéroïdes concentriques
   1. Ajouter les premières cellules, 2,5 à 10⁵ hASC, et faire pivoter la puce à 3 000 tr/min. Après 3 min, ajouter les deuxièmes cellules, 4 à 10⁵ MRC-5, et faire pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min. Injecter un total de 100 l de suspensions cellulaires par tuyauterie. Lorsque les cellules sont injectées, déplacez la vitesse de rotation à 500-1000 tr/min.
   2. Culture les cellules de l'incubateur à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO₂ en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Les sphéroïdes concentriques sont créés dans les 24 h. Pour la culture à long terme, changer le milieu de la culture tous les jours.
2. Formation sphéroïde de Janus
   1. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les premières cellules, 2,5 à 10⁵ hASC, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
   2. Incuber la puce à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO₂ en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min pendant 3 h.
   3. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant le deuxième ensemble de cellules, 4 à 10⁵ MRC-5, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
   4. Culture les cellules de l'incubateur à 36,5 oC, 95 % d'humidité, et 5 % de CO₂ en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Les sphéroïdes Janus sont créés dans les 24 heures. Pour la culture à long terme, changer le milieu de la culture tous les jours.
3. Formation sphéroïde de sandwich
   1. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les premières cellules, 1,5 à 10⁵ hASC, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
   2. Incuber la puce à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO₂ en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min pendant 3 h.
   3. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les deuxièmes cellules, 3 à 10⁵ MRC-5, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
   4. Incuber la puce à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO₂ en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min pendant 3 h.
   5. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les troisièmes cellules, 1,5 à 10⁵ hASC, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
   6. Culture les cellules de l'incubateur à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO₂ en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Les sphéroïdes sandwich sont créés dans les 12 h. Pour la culture à long terme, changer le milieu de la culture tous les jours.

5. Coloration cellulaire

1. Réchauffer le colorant de fluorescence cellulaire à température ambiante (20 oC).
2. Ajouter 20 l de diméthylsulfoxide anhylsulfoxide (DMSO) par flacon pour faire une solution de 1 mM.
3. Diluer la fluorescence à une concentration de travail finale de 1 M à l'aide de DMEM.
4. Ajouter la fluorescence à la suspension cellulaire et resuspendre doucement à l'aide d'une pipette.
5. Incuber 20 min à 36,5 oC, humidité de 95 % et 5 % de CO₂.

Résultats

La puce de culture CMS de 6 cm de diamètre (figure 2) a été réalisée avec succès selon le protocole ci-dessus. Tout d'abord, la puce a été faite séparément à partir d'une couche supérieure et une couche inférieure, puis colléensemble par liaison plasmatique. Les sphéroïdes qui en résultent peuvent être facilement recueillis en détachant la puce. Le canal de la puce de culture CMS comprend un port d'entrée et des régions centrales, de glissement et de micropuits (

Discussion

Le CMS est un système fermé dans lequel toutes les cellules injectées pénètrent dans le micropuits sans déchets, ce qui le rend plus efficace et économique que les méthodes conventionnelles de production de sphéroïdes à base de micropuits. Dans le système CMS, les supports sont remplacés tous les 12 à 24 h par un trou d'aspiration conçu pour enlever les supports de la puce (Figure 3A). Pendant le processus d'aspiration des médias, presque aucun média s'échappe de l'intérie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021