Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Résumé

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Résumé

Les modifications post-traductionnelles dépendantes de l'ubiquitine (ubl) des protéines jouent des rôles biologiques fondamentaux de régulation au sein de la cellule en contrôlant la stabilité des protéines, l'activité, les interactions et la localisation intracellulaire. Ils permettent à la cellule de répondre aux signaux et de s'adapter aux changements de son environnement. Les modifications au sein de ces mécanismes peuvent conduire à des situations pathologiques graves telles que les maladies neurodégénératives et les cancers. Le but de la technique décrite ici est d'établir des profils de PTMdépendants dépendants d'ub/ubls, rapidement et exactement, des lignées cellulaires cultivées. La comparaison de différents profils obtenus à partir de différentes conditions permet d'identifier des altérations spécifiques, telles que celles induites par un traitement par exemple. La transduction des cellules médiées lentivirales est effectuée pour créer des lignées cellulaires stables exprimant une version à deux étiquettes (6His et Drapeau) du modificateur (ubiquitine ou ubl comme SUMO1 ou Nedd8). Ces étiquettes permettent la purification de l'ubiquitine et donc des protéines ubiquitinated des cellules. Cela se fait par un processus de purification en deux étapes: Le premier est effectué dans des conditions dénaturantes en utilisant l'étiquette 6His, et le second dans des conditions natives en utilisant l'étiquette drapeau. Cela conduit à un isolement très spécifique et pur des protéines modifiées qui sont ensuite identifiées et semi-quantifiées par chromatographie liquide suivie par la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) technologie. L'analyse informatique facile des données De SP à l'aide du logiciel Excel permet l'établissement de profils PTM en éliminant les signaux d'arrière-plan. Ces profils sont comparés entre chaque condition afin d'identifier des altérations spécifiques qui seront ensuite étudiées plus spécifiquement, à commencer par leur validation par des techniques de biochimie standard.

Introduction

La méthode proposée ici est dédiée à l'étude des PTM médiées par les membres de la famille de l'ubiquitine à partir de cellules de mammifères cultivées afin d'identifier les altérations potentielles associées à une condition spécifique (traitement, différenciation, etc.). Les PTM représentent la dernière étape de la régulation des fonctions des protéines¹. En effet, une fois produites par la machinerie translationnelle, la plupart sinon toutes les protéines subissent différents types de PTM qui modulent leur activité, interactions moléculaires, et emplacement intracellulaire¹. Parmi la pléthore de PTM sont ceux médiés par la famille d'ubiquitine de protéines, l'ubiquitine elle-même et toutes les ubiquitine-likes, ont le potentiel de réguler toutes les protéines intracellulaires ou partiellement cytoplasmiques². Parce qu'elles sont elles-mêmes des protéines, elles peuvent être conjuguées les unes aux autres, formant des chaînes homogènes et hétérogènes de diverses topologies, chacune associée à des fonctions réglementaires spécifiques². Des outils sont nécessaires pour essayer de déchiffrer et de comprendre cette machinerie complexe. Beaucoup d'approches ont été développées dans le monde entier, ayant leurs propres avantages et inconvénients, et ici nous proposons un avec la haute performance adaptée aux cellules cultivées.

Le principal avantage de cette méthode est sa précision. En effet, la pureté des protéines modifiées isolées est fortement améliorée par l'utilisation combinatoire des deux étiquettes (6His et Flag) et les deux étapes-procédure et donc il est beaucoup plus sélectif qu'une seule étiquette fusion Ub/Ubl^3,4. La présence de l'étiquette 6His permet une première étape de purification dans un état totalement dénaturant évitant ainsi toute co-purification des protéines contenant des domaines de liaison d'ubiquitine ou d'autres protéines se liant aux ubiquitinated. Il s'agit d'un problème technique rencontré par plusieurs autres approches basées sur la purification d'affinité des protéomes ubiquitinated utilisant des anticorps spécifiques⁵ ou des éléments de liaison d'ubiquitine de tandem (TUBEs)^6. Fait important, cette technique n'est pas biaisée en faveur de la purification d'un certain type d'ubiquitination, comme cela pourrait être le cas pour d'autres approches, puisque les deux types de mono et différents types de polyubiquitinations ont été identifiés⁷. Par conséquent, une fois trouvé, une altération de l'ubiquitination devra être étudiée plus en détail par des approches biochimiques standard afin d'identifier le type exact d'ubiquitination impliquée.

Enfin, un autre avantage technique de ce protocole est l'utilisation de lentivirus, qui crée facilement et rapidement des lignées cellulaires stables exprimant avec un niveau raisonnable d'expressions de modificateur marqué sans interférer avec le comportement cellulaire normal.

Alors qu'un rôle important de l'ubiquitination est de cibler les protéines pour la dégradation protéasomale, il est maintenant connu qu'il a de nombreuses autres propriétés réglementaires pour potentiellement la plupart des protéines intracellulaires ou partiellement intracellulaires¹. Le nombre de ces fonctions est encore augmenté par l'existence de nombreuses ubiquitines comme les protéines, formant une famille de protéines régulant presque tous les mécanismes cellulaires¹. Leurs altérations peuvent avoir un impact drastique sur la biologie cellulaire et peuvent conduire ou participer à des situations pathologiques⁸, comme le cancer⁹. Par conséquent, des outils sont nécessaires pour explorer ce vaste paysage et identifier les altérations associées à une condition pathologique qui pourrait servir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Ce protocole est dédié aux cellules en culture car elles doivent être transduisées pour exprimer exogène marqué Ub / Ubl. Une fois créées, ces lignées cellulaires stables peuvent être utilisées pour générer des profils Ubl à partir de la culture en 2D ou 3D ou xénogreffes, prolongeant ainsi l'horizon des différents modèles expérimentaux qui peuvent être appliqués pour étudier les profils ptMs.

Protocole

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant 6His-Flag-Ubl

REMARQUE : Co-transfection des cellules HEK-293T avec pCCL-6HF-Ubl, pVSVG et delta-Helper.

1. Jour 0 : Seed 293T cells in a 6-well plate to obtain 50-70% confluence the day after.
2. Jour 1 : Co-transfect 50-70% cellules confluentes avec un mélange de 1 g de pCCL-6HF-Ubl ou pCCL-GFP, 1 g de pVSVG et 1 g de vecteurs delta-Helper, à l'aide d'un réactif de transfection et d'un protocole pour la production de lentivirus. Après 6 h de transfection, changer le milieu pour un milieu frais correspondant aux cellules à transduire. Ensemencez les cellules à transduire dans une plaque de 6 puits afin d'obtenir une confluence de 10-20% le lendemain (le jour du démarrage de la transduction).
3. Jour 2: 24 h après la transfection, récupérer le milieu contenant des particules lentivirales et filtrer à l'aide de filtres de 0,45 m. Si nécessaire, ajouter le milieu frais à ce point afin de produire un deuxième lot de lentivirus. Remplacer le milieu des cellules à transduire (10-20% de confluence) par celui contenant des lentivirus.
   REMARQUE : Le milieu lentiviral peut être maintenu à 4 oC pendant plusieurs jours avant la transduction ou stocké à -80 oC pendant des mois.
4. Incuber les cellules avec des lentivirus entre 24 h à 72 h dans un incubateur standard (37 oC, 5 % de CO₂), puis changer le milieu pour un standard frais. Si possible, vérifiez l'expression GFP à l'aide d'un microscope fluorescent inversé pour évaluer l'efficacité de la transduction : pourcentage de cellules exprimantes et niveau relatif d'expression par cellule. Si aucune fluorescence n'est détectée, attendez 2-3 jours supplémentaires car l'expression peut prendre plus de temps selon le type de cellules à transduire.
5. Si le contrôle de GFP est positif, cultivez toutes les cellules jusqu'à avoir assez pour exécuter un contrôle d'expression de 6HF-Ubl par immunofluorescence et tache occidentale utilisant l'anticorps anti-Flag.

2. Double purification des protéines modifiées

REMARQUE: Buffer 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Tampon 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glycerol, pH 8.0.
Tampon 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. Lyse cellulaire : Une fois prêt, lavez la vaisselle de culture au moins une fois à l'alin salin tamponné par le phosphate (PBS) à température ambiante (RT) et passez à la lyse cellulaire ou, alternativement, au gel flash dans le liquide N₂ et entreposez-le à -80 oC. Pour la lyse, ajouter 2 ml de tampon 1 par plat de 15 cm à RT. Utilisez un grattoir cellulaire pour récupérer tous les lysates dans des tubes coniques de centrifugeuse de 50 ml (volume final d'environ 20 ml).
2. Sonicate les lysates trois fois pour 30 s séparés par une pause de 1 min.
3. Centrifugeles les lysates sonicated à 15.000 x g pendant 15 min.
4. Transférer le supernatant dans un nouveau tube à l'aide d'une passoire cellulaire (40 m).
5. Déterminer la concentration des échantillons et ajuster, si nécessaire, pour obtenir la même quantité de protéines et le même volume. Utilisez une quantité totale de protéines entre 50 et 100 mg (10 plats de 15 cm de diamètre pour les cellules MiaPaCa-2).
6. Ajouter les perles Ni^2MD-NTA,en utilisant 2 ll de perles par 1 mg de protéines.
7. Tourner à 30 tr/min pendant 2,5 h à RT.
8. Pelleter les perles à 500 x g pendant 5 min.
9. Laver les perles avec 1 ml de tampon 1, transférer les échantillons à un tube microcentrifuge de 1,5 ml, puis transférer les tubes sur la glace. Effectuer toutes les prochaines étapes sur la glace ou à 4 oC.
10. Laver deux fois avec 1 ml de tampon 2 glacé contenant 10 mm d'imidazole.
11. Pour éliuer les protéines liées, ajouter 600 l de tampon 2 contenant 250 mM d'imidazole et faire pivoter pendant 2 h à 4 oC.
12. Pelleter les perles par centrifugation à 500 x g pendant 1 min. Transférer les supernatants dans de nouveaux tubes pré-refroidis de 1,5 mL et ajouter 50 l de perles conjuguées d'anticorps M2 anti-Flag.
13. Tourner à 30 tr/min pendant 2,5 h à 4 oC, puis laver 2 fois avec 500 l de tampon 2, puis 2 fois avec 500 oL de tampon 3.
14. Pour l'élution finale, ajouter 100 oL de tampon 3 contenant un peptide de drapeau à 0,1 g/L et tourner à 4 oC pendant 1,5 h.
15. Centrifugeuse à 500 x g pendant 1 min et transférer les supernatants dans de nouveaux tubes pré-refroidis.
16. Prenez 10 % (10 l) pour charger sur SDS-PAGE et effectuez une coloration argentée du gel pour contrôler la qualité de purification. Si la purification semble bonne, analysez les 90% laissés par LC-MS/MS.

3. Traitement des données de spectrométrie de masse pour générer des profils de PTM Ub/Ubls et identifier des différences significatives entre eux

REMARQUE : Les résultats de l'analyse de la SP contiennent de nombreuses informations, y compris le nombre total de peptides ainsi que les valeurs de la zone de pointe (moyenne de la zone peptide TOP 3¹⁰) pour chaque protéine identifiée dans chaque échantillon. Ces données peuvent être traitées à l'aide des nombres de nombres de peptides ou des valeurs de zone de pointe, ou les deux. Pour le calcul avec les zones de pointe, parce que ces valeurs sont généralement de l'ordre de 10⁶, il est nécessaire de les diviser par cet ordre avant d'appliquer les mêmes formules que ci-dessous. Les résultats obtenus avec les deux méthodologies de comptage devraient montrer une forte corrélation comme il le fait habituellement. Pour chaque protéine identifiée, utilisez les formules suivantes où :
v1 peptides values in non-treated ubiquitin sample (p. ex., Ub - drug)
v2 peptides values in Gemcitabine treated ubiquitin sample (p. ex., Ub et drug)
k1 peptides values in non-treated control GFP sample (p. ex., GFP - drug)
k2 peptides valeurs dans Gemcitabine traité échantillon de contrôle GFP (par exemple, GFP - médicament).

1. Normalisation : Normaliser les valeurs entre les cellules traitées par médicaments et les cellules non traitées pour l'ubiquitine et le GFP en utilisant les formules suivantes. Normalisé v et V et k normalisé.
   V1 v1. (v1 ' v2) / (2. ' v1) ; V2 v2. (v1 v2) / (2. v2)
   K1k1. (k1 k2) / (2. k1) ; K2k2. (k1 k2) / (2. k2)
2. Enlèvement de l'arrière-plan : À l'aide des formules suivantes, soustrayez les valeurs dans l'échantillon témoin (GFP) des valeurs de l'échantillon d'ubiquitine afin d'obtenir des valeurs spécifiques (V'1 et V'2) pour chaque protéine identifiée dans les deux conditions.
   V'1-V1-K1 si V1-K1-0; V'1-0 si V1-K1-lt;0
   V'2-V2-K2 si V2-K2 0; V'2 '0 si V2-K2'lt;0
3. Variation (Var) de l'ubiquitination. Pour obtenir un score (entre -100 et 100 euros) pour les variations positives et négatives des PTM induites par un médicament, utilisez la formule suivante dans laquelle la différence entre les valeurs spécifiques des échantillons traités et non traités est divisée par la somme de toutes les valeurs, y compris celles (pour pénaliser les protéines également identifiées dans le contrôle du GFP), et multiplier par 100.
   Var (V'2-V'1)/(V1'K1'V2'K2)100; -100 lt;Var-lt;100;
   Les variations inférieures à -50 (répression du PTM) ou au-dessus de 50 (induction du PTM) sont généralement considérées comme significatives.
4. Confiance (Conf). Utilisez la formule suivante pour obtenir une valeur de confiance comprise entre 0 et 100 %:
   Conf ((V1'V2)²/(1'V1'V2'K1'K2)²) 100 - 100/(1'V'1'V'2'2) ; 0 si le lt;0
   Les valeurs supérieures à 50 sont généralement considérées comme confiantes.
5. Pour obtenir une plus belle répartition des valeurs d'induction/répression et tenir compte des paramètres de variation et de confiance, multipliez les valeurs Var et Conf selon la formule suivante où V Var et C Conf
   'SI(V2'gt;0;((V2'C2) '2)/(10'6);-((V2'C2) '2)/(10'6)))
   REMARQUE : Comme les valeurs de zone de pointe sont généralement plus précises que le comptage des peptides, il est possible d'utiliser des logiciels spécifiques qui sont dédiés à l'interprétation de ce type de données telles que Persée (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), suivant recommandations d'utilisation.

Résultats

Transduction des cellules mammifères de culture pour créer des cellules exprimant gFP et 6HF-Ub
Pour produire des lentivirus qui seront utilisés plus tard pour transduire les cellules MiaPaCa-2, 70 % des cellules HEK-293T confluentes sont cotranscérées avec une quantité égale des trois vecteurs, pCCL-6HF-Ubiquitin ou GFP/Delta-Helper/pvSvG. Après 24 h de production, le milieu contenant des particules lentivirales est récupéré et filtré. Il est possible à c...

Discussion

Nous avons développé une méthodologie robuste et fiable pour générer des profils de protéines modifiées par les principaux membres de la famille de l'ubiquitine. En effet, nous avons appliqué avec succès ce protocole pour générer des profils de PTM par ubiquitine, mais aussi par SUMO et Nedd8, et pour détecter les altérations associées à un traitement⁷, en réponse à la surexpression ou à l'élimination d'un certain gène (données non montré) et dans les cellules qui ont acquis ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag