Détection de l’établissement de l’approvisionnement en sang partagé dans les souris parabiotiques par injection de glucose de veine caudale

Résumé

Ici nous décrivons une nouvelle méthode de détecter l’établissement réussi de la circulation sanguine partagée de deux parabionts par une injection caudale de veine de glucose, qui cause des dommages minimaux et n’est pas mortelle aux parabionts.

Résumé

La parabiose est une méthode expérimentale pour combiner chirurgicalement deux animaux parallèles le long de l’axe longitudinal du corps. Nous présentons un protocole pour détecter l’établissement réussi du chimerism de sang dans les parabionts par une injection caudale de veine de glucose. Des souris parabiotiques ont été construites. Le glucose a été injecté dans la souris de distributeur par la veine de queue, et la fluctuation du niveau de glucose sanguin a été mesurée dans les deux souris utilisant un glucomètre de sang à différents points de temps. Nos résultats ont prouvé qu’après injection de glucose, le niveau de glucose sanguin dans les souris de distributeur a augmenté brusquement après 1 min et a diminué lentement par la suite. Pendant ce temps, le taux de glucose sanguin des souris receveuses a atteint un sommet de 15 min après l’injection. Des résultats similaires ont été obtenus avec Evans bleu, utilisé comme un contrôle positif pour le glucose. La fluctuation synchrone des niveaux de glucose sanguin indique que le flux sanguin entre les deux souris a été établi avec succès.

Introduction

La parabiose est une méthode de modélisation dans laquelle deux organismes vivants sont réunis chirurgicalement et se développent comme un système physiologique unique avec un système circulatoire partagé¹. Ces modèles ont été largement utilisés pour étudier la physiologie en raison de l’avantage que les substances produites par un seul individu peuvent agir sur les deux animaux en même temps via le système circulatoire partagé. Depuis le milieu des années 1800, lorsque les expériences parabiotiques ont été lancées par Paul Bert², les méthodes de construction de modèles parabiotiques sont devenues standardisées. Cependant, une méthode simple et commode pour vérifier l’établissement réussi du chimérisme de sang a été manquante. Il a été rapporté que la circulation croisée peut être évaluée avec succès en injectant intrapéritonement 0,5% de colorant bleu Evans dans l’un des parabionts suivi par la mesure de l’absorption du bleu Evans dans le sang des deux parabionts avec un lecteur de microplaque³. Une autre méthode nécessite une race de sourisspécifique qui contient CD45.1 - et CD45.2- monocytes étiquetés dans chaque parabiont. La cytométrie cellulaire est ensuite utilisée pour déterminer le chimérisme sanguin en mesurant la fréquence des deux marqueurs dans les monocytes de la rate ou du sang⁴. Cependant, ces méthodes sont souvent mortelles ou encombrantes pour les animaux, et une méthode sûre et simple pour une vérification rapide et fiable des modèles parabiotiques est hautement souhaitable. Dans cette étude, nous avons établi une nouvelle méthode à cet effet, qui a été validée dans un modèle de souris de parabiose. La concentration de glucose dans les échantillons de sang prélevés dans une veine de queue est mesurée à l’aide d’un glucomètre, et le modèle de changements du niveau de glucose chez les souris donneuses et bénéficiaires est considéré comme une indication de chimérisme de circulation. Nous avons nommé cette méthode la « méthode de fluctuation du glucose ». L’application de cette méthode de validation ne se limite pas aux souris, mais pourrait être étendue à divers modèles pathologiques, sauf pour ceux qui ont une dysrégulation sérieuse du métabolisme du glucose. La procédure est simple, gain de temps, et sûr.

Protocole

Toutes les procédures impliquant les animaux et leurs soins ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale Harbin.

REMARQUE : Les outils et l’équipement requis pour la méthode sont énumérés dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation des matériaux et des animaux

1. Commandez des souris mâles C57BL/6 dont le poids se siédesde entre 20 g et 25 g auprès d’un fournisseur d’animaux de laboratoire standard.
2. Loger les souris dans un cycle de 12 h de lumière : 12 h d’obscurité à 24 à 26 oC avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.

2. Parabiose

1. Anesthésiez les souris par injection intrapéritonéale de 20 g/L 2,2,2-tribromoéthanol à une concentration de 0,1 mL/10 g. Confirmer l’anesthésiation appropriée comme indiqué par la relaxation musculaire, la respiration lente et régulière, la perte du réflexe de stimulation de la peau, et la disparition du réflexe cornéen.
2. Appliquer l’onduleur ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir les yeux secs.
3. Effectuer la procédure de parabiose comme précédemment décrit⁵.
   1. Placez les souris en position de supine. Raser soigneusement le côté gauche d’une souris et le côté droit de l’autre souris à partir d’environ 1 cm au-dessus du coude à 1 cm au-dessous du genou avec un rasage électrique. Utilisez de la crème dépilatoire pour effacer totalement la fourrure sur la peau rasée.
   2. Essuyez les zones rasées avec de l’iodophor. Placer les souris sur un coussinet chauffé recouvert d’un tampon stérile.
   3. Créez des incisions cutanées longitudinales à partir de 0,5 cm au-dessus du coude à 0,5 cm sous l’articulation du genou à l’aide d’une paire de ciseaux pointus sur le côté rasé de chaque animal.
   4. Détachez doucement la peau du fascia sous-cutané après l’incision.
   5. Connectez l’olecranon et le genou du parabiont avec une suture 3-0.
   6. Suturer la peau rasée avec une suture continue 5-0.
4. Injecter 0,5 ml de 0,9 % de NaCl sous-cutanée à chaque souris pour prévenir la déshydratation.
5. Injecter du tramadol (10 mg/25 g/jour) par voie intramusculaire à chaque souris pour soulager la douleur.

3. Validation du chimérisme de circulation

1. Méthode de fluctuation du glucose
   REMARQUE : Vérifier la construction réussie du chimerism de circulation entre les parabionts utilisant la méthode de fluctuation de glucose (aucun jeûne) le 10ème jour après chirurgie de parabiosis.
   1. Anesthésiez les parabionts par injection intrapéritonéale de 20 g/L 2,2,2-tribromoéthanol à chaque souris à une concentration de 0,1 mL/10 g.
   2. Fixez les souris donneuses dans un fixateur veineux de queue visuelle-souris.
   3. Frotter les veines caudales sur le flanc de l’une des queues du parabiont avec une boule de coton imbibée d’alcool de 70 à 75 % pour nettoyer la queue et dilater les vaisseaux sanguins.
   4. Tenez une seringue de 1,0 ml contenant du glucose dans la main droite et gardez l’aiguille parallèle à la veine (moins de 15 degrés).
   5. Insérez l’aiguille à une position située à environ 2 à 4 cm de l’extrémité de la queue.
   6. Injecter 100 ll de glucose (1,2 g/kg) dans le donneur dans les 10 s.
      REMARQUE : Le terme donneur se réfère au parabiont qui reçoit l’injection de glucose par la veine de queue. Le destinataire est l’autre parabiont, qui ne reçoit pas le glucose directement.
   7. Nettoyer les orteils avec l’iodophor. Couper les orteils des souris du donneur et du receveur à l’aide d’un ciseau et recueillir une goutte de sang à différents moments après l’injection de glucose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min et 60 min). Retirez le caillot de sang à chaque point de collecte pour éviter plus de dommages.
      REMARQUE : Le volume du sang recueilli était de 10-25 ul pour un essai, et de 90-225 ul au total.
   8. Égoutter le sang dans le centre des bandes de test de glucometer pour la détection de niveau de glucose.
2. Utilisez le Contre-tache bleu d’Evan comme un contrôle positif³.
   1. Injecter 200 l de 0,5 % de la contre-tache bleue d’Evan intraperitoneally dans la souris du donneur.
   2. 2 h plus tard, euthanasiez les parabionts par injection intrapéritonéale de 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol à chaque souris à une concentration de 0.2 mL/10 g, et recueillez le sang des deux parabionts par perforation cardiaque.
   3. Centrifuger les échantillons de sang à 916 x g pendant 15 min.
   4. Recueillir le sérum du supernatant.
   5. Diluer le sérum avec 0,9% NaCl à 1:50.
   6. Mesurer l’absorption des échantillons de sérum dilué à 620 nm à l’égard d’un spectrophotomètre.

Résultats

Chez six souris donneuses, le taux de glucose sanguin a fortement augmenté pour atteindre 26,5 'mol/L (augmentation de 173 %) à une moyenne de 1 min après l’injection de 100 l de glucose (1,2 g/kg) dans la veine de la queue, puis a diminué graduellement à 13,3 'mol/L à 60 min. Chez les souris receveuses, la glycémie augmentait lentement après l’injection et atteignait le premier niveau de pointe à 15 min (augmentation de 47 %, 12,2 'mol/L). Sur la base des résultats ci-dessu...

Discussion

Parabiose se réfère à la technique chirurgicale de connecter deux animaux vivants pour établir un système vasculaire commun par des moyens expérimentaux^6,7,8. L’avantage de ce modèle est que les substances produites par un seul individu peuvent agir sur les deux animaux en même temps. Ainsi, le modèle de parabiose peut être utilisé pour explorer le rôle d’une substance ou d’un facteur dans une maladie connexe, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#