Intégration des approches bioinformatiques et des validations expérimentales pour comprendre le rôle de la signalisation de l'entaille dans le cancer de l'ovaire

Résumé

La bioinformatique est un moyen utile de traiter les ensembles de données à grande échelle. Grâce à la mise en œuvre d'approches bioinformatiques, les chercheurs peuvent obtenir rapidement, de manière fiable et efficace des applications perspicaces et des découvertes scientifiques. Cet article démontre l'utilisation de la bioinformatique dans la recherche sur le cancer de l'ovaire. Il valide également avec succès les résultats de la bioinformatique par l'expérimentation.

Résumé

La signalisation d'encoche est une voie réglementaire fortement conservée impliquée dans beaucoup de processus cellulaires. La dysrégulation de cette voie de signalisation conduit souvent à l'interférence avec le développement approprié et peut même avoir comme conséquence l'initiation ou la progression des cancers dans certains cas. Parce que cette voie sert des fonctions complexes et polyvalentes, elle peut être étudiée en profondeur à travers de nombreuses approches différentes. Parmi ceux-ci, la bioinformatique fournit une méthode d'étude indéniablement rentable, accessible et conviviale. La bioinformatique est un moyen utile d'extraire de plus petites informations à partir de jeux de données à grande échelle. Grâce à la mise en œuvre de diverses approches bioinformatiques, les chercheurs peuvent interpréter rapidement, de façon fiable et efficace ces grands ensembles de données, donnant des applications perspicaces et des découvertes scientifiques. Ici, un protocole est présenté pour l'intégration des approches bioinformatiques pour étudier le rôle de la signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire. En outre, les résultats de la bioinformatique sont validés par l'expérimentation.

Introduction

La voie de signalisation Notch est une voie très conservée qui est importante pour de nombreux processus de développement au sein des organismes biologiques. La signalisation d'encoche a été montrée pour jouer un rôle significatif dans la prolifération et l'auto-renouvellement de cellules, et les défauts dans la voie de signalisation de notch peuvent mener à beaucoup de types de cancers^1,2,3,4,5,6. Dans certaines circonstances, la voie de signalisation Notch a été liée à la fois à la croissance des tissus et le cancer ainsi que la mort cellulaire et la suppression des tumeurs⁷. Les récepteurs de l'entaille multiple (NOTCH 1-4) et le mastermind de l'activateur co-u2012 (MAML 1-3), tous avec des fonctions diverses, ajoutent un niveau supplémentaire de complexité. Alors que la voie de signalisation Notch est sophistiquée en termes de fonctions, sa voie de base est simple sur une base moléculaire⁸. Les récepteurs d'entaille agissent comme protéines transmembranaires composées de régions extracellulaires et intracellulaires⁹. Une liaison de ligand à la région extracellulaire des récepteurs notifient facilite le clivage protéolytique, qui permet au domaine intracellulaire Notch (NICD) d'être libéré dans le noyau. NICD se lie ensuite à mastermind co-u2012activateur pour activer l'expression du gène en aval¹⁰.

Ces dernières années, notch signalisation a été montré à jouer une variété de rôles dans l'initiation et la progression de plusieurs types de cancers à travers différentes espèces^6,11. Par exemple, la signalisation Notch a été liée à la tumorigénèse impliquant le gène humain NOTCH1 ¹². Récemment, les gènes NOTCH2, NOTCH3, Delta-like 3 (DLL3), Mastermind-u2012like protein 1 (MAML1), et un domaine de disintegrin et de métalloproteinase-u2012 contenant la protéine 17 (ADAM17) gènes se sont avérés fortement associés au cancer de l'ovaire, particulièrement avec la faible survie globale des patients¹³.

À mesure que la quantité de données expérimentales et associées aux patients augmente continuellement, la demande d'analyse des données disponibles augmente également. Les données disponibles sont dispersées dans les publications, et elles peuvent fournir des conclusions contradictoires, voire contradictoires. Avec le développement de nouvelles technologies au cours des dernières décennies, comme le séquençage de la prochaine génération, la quantité de données disponibles a augmenté de façon exponentielle. Bien que cela représente des progrès rapides dans la science et des possibilités de recherche biologique continue, l'évaluation de la signification des données accessibles au public pour résoudre les questions de recherche est un grand défi¹⁴. Nous croyons que la bioinformatique est un moyen utile d'extraire de plus petites informations à partir de jeux de données à grande échelle. Grâce à la mise en œuvre de diverses approches bioinformatiques, les chercheurs peuvent interpréter rapidement, de façon fiable et efficace ces grands ensembles de données, ce qui donne lieu à des découvertes perspicaces. Ces découvertes peuvent aller de l'identification de nouvelles cibles potentielles de pharmacothérapie ou de biomarqueurs de la maladie, aux traitements personnalisés des patients^15,16.

La bioinformatique elle-même évolue rapidement, et les approches sont en constante évolution à mesure que les progrès technologiques balayent la science médicale et biologique. À l'heure actuelle, les approches bioinformatiques courantes comprennent l'utilisation de bases de données accessibles au public et de programmes logiciels pour analyser les séquences d'ADN ou de protéines, identifier les gènes d'une pertinence ou d'une importance particulière, et déterminer la pertinence des gènes et des produits géniques par le biais de la génomique fonctionnelle¹⁶. Bien que le domaine de la bioinformatique ne se limite certainement pas à ces approches, celles-ci sont importantes pour aider les cliniciens et les chercheurs à gérer les données biologiques dans l'intérêt de l'ensemble des patients.

Cette étude vise à mettre en évidence plusieurs bases de données importantes et leur utilisation pour la recherche sur la voie de signalisation Notch. NOTCH2, NOTCH3, et leur co-u2012activator MAML1 ont été utilisés comme exemples pour l'étude de base de données. Ces gènes ont été utilisés parce que l'importance de la voie de signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire a été validée. Des analyses systématiques des données récupérées ont confirmé l'importance de la signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire. En outre, parce que la signalisation Notch est bien conservé entre les espèces, il a été confirmé que la surexpression de Drosophila melanogaster NICD et Mastermind ensemble peut induire des tumeurs dans les ovaires Drosophila, soutenant les résultats de la base de données et le rôle significatif et conservé de la signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire.

Protocole

1. Prévision des résultats cliniques à partir de profils génomiques (PRECOG)

REMARQUE : Le portail PRECOG (precog.stanford.edu) accède aux données accessibles au public à partir de 165 ensembles de données sur l'expression du cancer, y compris les niveaux d'expression génique et les résultats cliniques des patients¹⁷. Il fournit spécifiquement l'analyse Meta-u2012Z, qui intègre de grands ensembles de données pour fournir des scores de différents gènes dans 39 types de cancer pour indiquer la survie globale du patient. Les taux de survie médiocres et bons sont indiqués par des valeurs positives et négatives de Z-u2012score, respectivement.

1. Créez un compte avec un e-mail affilié à un universitaire pour accéder à cette base de données. Entrez l'adresse e-mail et le mot de passe associés au compte.
2. Cliquez sur le bouton Afficher les détails situé sous le titre d'analyse Meta-Z.
3. Entrez le gène d'intérêt dans la barre de recherche.
4. Utilisez la barre de défilement située en bas de l'écran pour obtenir le z-score de survie pour le type spécifique de cancer d'intérêt.

2. CSIOVDB

REMARQUE: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) est une base de données sur les microréseaux développée par le Cancer Science Institute de Singapour pour étudier le cancer de^{l'ovaire 18}. Cette base de données contient des données de carcinomes de différents sites tumoraux ainsi que des données normales sur les tissus des ovaires. En outre, CSIOVDB fournit des parcelles de survie de Kaplan-u2012Meier pour évaluer la survie du patient avec des niveaux différentiels d'expression de gène. CSIOVDB peut être appliqué pour étudier l'association entre les niveaux d'expression des gènes et les stades/grades du cancer de l'ovaire.

1. Gène d'entrée d'intérêt, puis cliquez sur le bouton Recherche.
2. Cliquez sur l'onglet État de la maladie.
   REMARQUE : Cet onglet fournit des statistiques sommaires de l'expression génique du gène cible d'intérêt dans les états de maladie de cancer de l'ovaire.
3. Cliquez sur l'onglet Histologie.
   REMARQUE : Cet onglet fournit des statistiques sommaires de l'expression génique du gène cible d'intérêt pour les histologies majeures du cancer de l'ovaire.
4. Cliquez sur l'onglet Paramètres clinico-pathologiques.
   REMARQUE : Cet onglet fournit une comparaison des niveaux d'expression de gène entre différents stades, grades, et réponses cliniques de cancer de l'ovaire avec des essais de Mann-Whitney.
5. Cliquez sur l'onglet Survie.
   REMARQUE : Cet onglet fournit des parcelles Kaplan-Meier associées à la survie globale et à la survie sans maladie. Pour cette base de données, la survie sans maladie est considérée comme une survie sans progression et sans récurrence¹⁸. Des analyses multivariées pour la survie globale et la survie sans maladie se trouvent également sous cet onglet. Les analyses multivariées comparent les caractéristiques qui se rapportent aux pronostics du cancer de l'ovaire (stade, grade, débulking chirurgical, histologie, âge) et au gène d'intérêt.
6. Cliquez sur l'onglet Sous-type.
   REMARQUE : Cet onglet fournit des statistiques sommaires et des tests Mann-Whitney pour le niveau d'expression du gène d'intérêt dans les sous-types moléculaires du cancer de l'ovaire. Cet onglet fournit également des parcelles Kaplan-Meier associées à la survie globale et à la survie sans maladie du gène d'intérêt pour les sous-types moléculaires du cancer de l'ovaire.

3. Expression génique à travers le tissu normal et tumoral (GENT)

REMARQUE : Le portail GENT (medical-u2012genome.kribb.re.kr/GENT) est développé et maintenu par l'Institut de recherche coréen en biosciences et biotechnologie (KRIBB)¹⁹. Il recueille 16 400 (U133A; 241 ensembles de données) et 24 300 (U133plus2; 306 ensembles de données) échantillons accessibles au public. Après normalisation, GENT offre des données d'expression génique à travers divers tissus, qui sont encore divisés en tumeurs et tissus normaux.

1. Cliquez sur l'onglet Recherche en haut de l'écran.
2. Dans la section étiquetée 1. Mot-clé, sélectionnez le symbole gène pour les Termes à partir du menu déroulant, entrez le symbole génétique du gène d'intérêt dans la zone vierge de la section Mot-clé, et sélectionnez Tissu pour l'option Type.
3. Cliquez sur le bouton Recherche en bas de la 1. Section mot-clé. Il montre les graphiques sommaires de l'expression génique dans les tissus normaux et tumoraux de différents types de cancer basés sur les plates-formes U133A et U122Plus2.
   REMARQUE : Il est facultatif de sélectionner l'option de filtrage des données en haut du graphique récapitulatif pour sélectionner une base de données particulière à étudier.
4. Cliquez sur le lien à côté de Result Data Download pour accéder aux informations détaillées sur les valeurs d'expression des gènes, les types de tissus et les sources de données.

4. Encyclopédie de ligne de cellules cancéreuses de l'Institut large (CCLE)

REMARQUE: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) a été créé par le Broad Institute et fournit des profils génomiques et des mutations de 947 lignées cellulaires cancéreuses humaines²⁰.

1. Entrez les gènes désirés dans la barre de recherche, puis cliquez sur le bouton Recherche.
2. Dans la section étiquetée Select Dataset, cliquez sur l'option expression ARNm (RNAseq) du menu déroulant.
   REMARQUE: D'autres options incluent l'expression de l'ARNm (Affy), Achilles shRNA knockdown, et le numérode copie .
3. Cliquez sur le bouton Toggle All Traces. Sélectionnez le type de tissu d'intérêt de la boîte grise sur la droite. Faites défiler vers le bas de l'écran et cliquez sur le bouton d'expression de l'ARNm Télécharger.
4. Ouvrez le document texte téléchargé. Copier et coller tout le texte dans la feuille 1. Copiez tout le texte dans la feuille 1.
5. Cliquez sur la feuille dans le logiciel de tableur Feuille 2 onglet sur le bas de la feuille de calcul. Cliquez à droite sur la colonne A, sélectionnez Paste Special, puis sélectionnez l'option Transpose dans la feuille 2.
6. Une fois que le texte est transposé en deux colonnes sur la feuille 2,cliquez sur la flèche de déclassement pour le titre d'option De tri et de filtre, puis sélectionnez l'option Filtre. Une flèche apparaîtra dans la zone de cap étiquetée Gène. Cliquez sur la flèche et tapez dans le type de tissu d'intérêt.
   REMARQUE : Cette étape filtrera toutes les données et affichera uniquement les niveaux d'expression des gènes pour le type d'intérêt tissulaire.

5. cBioPortal

REMARQUE : cBioPortal (www.cioportal.org) a été développé au Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), et accède, analyse et visualise les données génomiques sur le cancer à grande échelle^21,22. Plus précisément, ce portail permet aux chercheurs de rechercher des altérations génétiques et des réseaux de signalisation.

1. À l'aide de la requête sur la page de destination, cliquez sur les organes/tissus d'intérêt sous la section intitulée Select Studies. Sélectionnez l'étude d'intérêt particulière, puis appuyez sur le bouton Query By Gene.
2. Dans la section étiquetée Select Genomic Profiles, sélectionnez parmi les trois options : Mutations, modifications putatives du numéro de copie de GISTIC, ou arnarité. Sélectionnez d'autres données correspondantes à partir du menu déroulant pour Sélectionner le patient/l'ensemble de cas.
3. Entrez le symbole du gène cible dans la boîte de requête de Enter Genes. Cliquez sur le bouton Soumettre la requête.
4. Cliquez sur l'onglet Réseau en haut de la page pour récupérer le réseau génétique souhaité.
   REMARQUE : Le réseau de signalisation est codé en couleur. Les gènes intrants sont indiqués par des nœuds de graines avec une bordure épaisse. Chaque gène est représenté par un cercle rouge, et l'intensité de couleur du cercle rouge reflète sa fréquence de mutation. Des gènes sont reliés par des lignes de couleur différente. Les lignées brunes signifient « Dans la même composante », indiquant la participation à la même composante biologique. Les lignes bleues signifient « Réagit avec », indiquant des réactions de gène. Les lignes vertes signifient « changement d'état », suggérant qu'un gène pourrait causer un changement d'état d'un autre gène.
5. Cliquez sur l'onglet Fichier en haut de l'image pour choisir Enregistrer comme Image (PNG) pour le téléchargement d'images réseau.

6. Dissection de Drosophila avec génotypes désirés et coloration DAPI

REMARQUE: Recueillir la Drosophila femelle avec les génotypes désirés, puis disséquer les ovaires mouche pour subir les procédures de coloration DAPI pour la formation image.

1. Préparer les stocks de mouches tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w. UAS-mam.A; et w[1118] pour créer des mouches avec NICD-surexpression (tj-Gal4, Gal80ts/ UAS-NICD-GFP/ )et NICD et mam-surexpression(tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; UAS-NICD-GFP/MD).
2. Appliquer la technique de ciblage temporel et régional de l'expression génique (TARGET) pour contrôler l'expression du gène spatiotemporal²³. Élever les mouches à 18 oC jusqu'à l'âge adulte, puis passer à 29 oC pendant 48 h avec de la levure avant la dissection.
   REMARQUE: tj-Gal4 ne peut conduire l'expression UAS sous des températures plus élevées, lorsque l'inhibition par Gal80ts est soulagé. L'ajout de levure avant la dissection agrandit les ovaires pour la récolte.
3. Placer 3 mL de saline tamponnée de phosphate 1x (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 m KH₂PO₄) dans un plat de collecte d'embryons. Utilisez un tampon CO₂ pour anesthésier les mouches.
4. Choisissez une mouche femelle, puis prenez soigneusement le thorax inférieur de la mouche à l'aide d'une paire de forceps disséquants et plongez-la dans la solution 1x PBS dans un plat de collecte d'embryons. Utilisez une deuxième paire de forceps pour pincer le bas-ventre et tirer doucement pour libérer les organes internes.
5. Identifiez et détachez la paire d'ovaires du corps de la mouche. Casser la gaine musculaire située à l'extrémité postérieure des ovaires et séparer les ovarioles.
   REMARQUE : Il faut séparer les ovarioles et briser la gaine musculaire afin d'obtenir des résultats de coloration de meilleure qualité.
6. Placer les ovaires dans un tube centrifugeuse de 1,5 ml qui contient 500 L de 1x PBS. Le tube doit rester sur la glace jusqu'à ce que tous les ovaires soient recueillis.
7. Retirez le 1x PBS et placez 0,5 ml de solution fixe (4% de formaldéhyde) dans le tube. Placer le tube sur le diteur pendant 10 min.
8. Retirez la solution de fixation du tube et jetez-la dans un contenant de déchets approprié. Utilisez 1 ml de 1x PBT (1x PBS complété avec 0,4% Triton™ X-100) pour laver les ovaires 3x pendant 15 min.
9. Jetez le lavage PBT final et ajoutez 1 mL de PBTG (0,2 % d'albumine bovine de sérum, 5 % de sérum de chèvre normal en 1x PBT) pour empêcher la liaison non spécifique.
   REMARQUE: Cette étape pourrait être ignorée pour la coloration DAPI, mais il est essentiel pour la coloration des anticorps. La coloration d'immunohistochimie détaillée peut être trouvée dans Jia et autres^24.
10. Placer 150 oL de DAPI (10 g/mL) dans le tube pendant 10 à 15 minutes de noix. Jeter le DAPI et laver les ovaires 1x pendant 10 min en utilisant 1 ml de 1x PBT. Retirer le PBT et laver 2x pendant 10 min à l'aide de 1x PBS.
11. Enlever l'excès de PBS jusqu'à ce qu'environ 300 L de PBS restent dans le tube avec les ovaires. Pipet les ovaires de haut en bas plusieurs fois à l'aide d'une pipette de 200 l, afin de libérer les chambres d'oeufs.
12. Faites tourner doucement le tube et retirez soigneusement autant de solution 1x PBS que possible sans enlever les ovaires. Placer 120 oL de solution de montage (1 g de gallate n-propyl, 5 ml de 10X PBS, 40 ml de glycérol et 5 ml de dH₂O) dans le tube.
    REMARQUE : La solution de montage est collante, il est donc difficile de transférer exactement 120 L de solution de montage dans un tube. Pour atténuer ce problème, une pointe de pipette de 1 000 l peut être utilisée pour ajouter trois gouttes de solution de montage dans le tube.
13. Retirez environ 0,33 mm d'une pointe de pipette de 200 l et utilisez la pointe de pipette nouvellement coupée pour placer la solution de montage sur une lame de verre au microscope.
14. Placez délicatement le verre de couverture sur la solution de montage et scellez les bords de la glissière de couverture avec le vernis à ongles transparent.
    REMARQUE : Sceller les bords du verre de couverture est nécessaire pour empêcher les chambres d'oeuf s'écouler à l'intérieur de la solution de montage en prenant des images confocales.
15. Acquérir des images avec un microscope confocal en utilisant les paramètres suivants: objectif de l'objectif - grossissement 10x; ouverture numérique 0,8; Longueur d'onde des émissions de DAPI 410 à 513 nm.

Résultats

L'utilisation de la procédure mentionnée à l'étape 1 à l'aide du portail PRECOG, les scores Z de NOTCH2, NOTCH3et MAML1 dans le cancer de l'ovaire ont été obtenus (1,3, 2,32, 1,62, respectivement). Les valeurs négatives de Z-u2012score indiquent la faible survie globale des patients présentant des niveaux d'expression élevés des trois gènes. À l'aide du formatage conditionnel du logiciel de tableur, les valeurs de Z-u2012score sont affichées dans un graphique à b...

Discussion

Comme il existe d'innombrables approches et méthodes pour l'utilisation de la bioinformatique, il existe de nombreuses bases de données disponibles en ligne pour le grand public. Une abondance d'informations peut être extraite de chacune de ces bases de données, mais certaines sont les mieux adaptées à des fins particulières, telles que l'évaluation de la survie des patients en fonction de certaines entrées. Des analyses systématiques des données récupérées à partir de différentes bases de données indivi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4	ThermoFisher	FLBP6651	Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum	Gibco	16210064	Serum
Embryo dish	Electron Microscopy Sciences	70543-45	Dissection Dish
Nutating mixers	Fisherbrand	88861041	Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B	Dr. Wu-Min Deng at Florida State University	N/A	Fly stock
w*; UAS-mam.A	Bloomington Drosophila Stock Center	#27743	Fly stock
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	#5905	Fly stock
The PRECOG portal	Stanford University	precog.stanford.edu	Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB	Cancer Science Institute of Singapore	csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html	Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal	Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)	medical–genome.kribb.re.kr/GENT	Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)	Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research	portals.broadinstitute.org/ccle	Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)	cioportal.org	Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope	Carl Zeiss	ID #M 210491	Examination and image collection of fluorescently labeled specimens