Cellules de progéniture coronaire et biomarqueurs solubles dans le pronostic cardio-vasculaire après angioplastie coronaire

Résumé

Le développement des événements cardio-vasculaires défavorables principaux, qui affectent le pronostic cardio-vasculaire après l'angioplastie coronaire, sont influencés par l'ampleur des dommages coronaires et de la réparation vasculaire. L'utilisation de nouveaux biomarqueurs cellulaires et solubles coronaires, réactifs aux dommages et à la réparation vasculaires, sont utiles pour prévoir le développement des MACE et du pronostic.

Résumé

Les événements cardio-vasculaires défavorables principaux (MACEs) ont un impact négatif le pronostic cardio-vasculaire des patients subissant l'angioplastie coronaire due aux dommages ischémiques coronaires. L'étendue des dommages coronaires et les mécanismes de réparation vasculaire sont des facteurs influençant le développement futur des MACE. Les dispositifs vasculaires intrinsèques comme les caractéristiques de plaque et la complexité d'artère coronaire ont démontré l'information pronostique pour DESMAC. Cependant, l'utilisation des biomarqueurs circulants intracoronary a été postulée comme méthode commode pour l'identification tôt et le pronostic des MACEs, car ils reflètent plus étroitement les mécanismes dynamiques impliquant des dommages et la réparation coronaires. La détermination des biomarqueurs circulants coronaires pendant l'angioplastie, comme le nombre de sous-populations de cellules progénitrices mononucléaires (MPC) ainsi que la concentration de molécules solubles reflétant l'inflammation, l'adhérence cellulaire et la réparation, permet évaluation des développements futurs et du pronostic des MACEs 6 mois après angioplastie coronaire. Cette méthode est mise en évidence par sa nature translationnelle et de meilleures performances que les biomarqueurs périphériques circulant dans le sang en ce qui concerne la prédiction des MACE et son effet sur le pronostic cardio-vasculaire, qui peut être appliqué pour la stratification du risque des patients avec la maladie coronarienne subissant l'angioplastie.

Introduction

L'angioplastie coronaire et l'endoprothèse représentent une procédure de sauvetage pour les patients atteints de maladie coronarienne (CAD). Cependant, les événements cardio-vasculaires défavorables principaux (MACEs), y compris la mort cardio-vasculaire, l'infarctus du myocarde, la reposnose coronaire, et les épisodes d'angine ou décompensent l'insuffisance cardiaque, peuvent se produire des mois après l'intervention coronaire, incitant des visites imprévues à l'hôpital. Les MACE sont courants dans le monde entier et leur morbi-mortalité est élevée¹.

Les dommages ischémiques coronaires induitlas la réponse vasculaire tôt et les mécanismes réparateurs impliquant la mobilisation des MPCs dus à leur capacité de différenciation et/ou potentiel angio-réparateur, aussi bien que la production des molécules solubles comme les molécules intercellulaires d'adhérence (ICAMs), les métalloproteinases de matrice (MMP), et les espèces réactives d'oxygène, reflétant l'adhérence de cellules, le remodelage de tissu, et le stress oxydatif. Bien que des dispositifs vasculaires intrinsèques comme des caractéristiques de plaque et la complexité d'artère coronaire aient été employés pour prévoir des MACEs, quelques études ont suggéré que les biomarqueurs liés aux mécanismes des dommages et de la réparation se produisant dans l'endothélium coronaire pourraient être très utiles pour l'identification tôt et le pronostic des événements cardio-vasculaires dans les patients présentant la CAO soumis à l'angioplastie coronaire^2,3,4,5.

L'intérêt continu pour comprendre les mécanismes sous-jacents aux lésions et aux réparations de LA CORONARale a incité les chercheurs à étudier les biomarqueurs circulants intracoraires, parce que l'échantillonnage coronaire reflète plus étroitement les lésions vasculaires et la réparation⁶. Cependant, la caractérisation des biomarqueurs coronaires dans les études humaines a été rare^7,8,9. Par conséquent, le but de la présente étude était de décrire une méthode pour déterminer la quantité de MPC sépariaux circulants et de molécules solubles, reflétant des dommages vasculaires et la réparation, et pour montrer si ces biomarqueurs sont associés aux MACEs et au pronostic clinique des patients de CAO qui ont subi l'angioplastie coronaire. Cette méthode est basée sur l'utilisation de MPC vasculaires et circulants et de molécules solubles obtenues en échantillonnant les endroits les plus proches des dommages du vaisseau. Il peut également être utile pour des études cliniques pour l'ischémie inférieure de membre, la course, la vasculite, la thrombose veineuse, et d'autres dommages vasculaires et la réparation.

Protocole

Ce protocole répond aux lignes directrices institutionnelles du Comité d'éthique de la recherche humaine.

1. Angiographie coronaire, échographie et prélèvement sanguin

1. Demander des renseignements cliniques et démographiques de base avant l'intervention coronaire. Recueillir les données de l'individu : l'âge, le sexe, l'état actuel du tabagisme, l'indice de masse corporelle (IMC), l'hypertension artérielle, la dyslipidémie, le diabète sucré, les médicaments et l'indication de l'angiographie coronaire actuelle.
2. Effectuer l'angiographie coronaire par cathétérisme cardiaque à l'aide d'une approche radiale. Cette procédure doit être effectuée sous un guide de fluoroscopie dans la salle d'hémodynamique par des cardiologues experts.
   REMARQUE : Identifiez les navires évaluables. Pour la présente étude, des vaisseaux évaluables ont été définis comme des artères avec des sections plus grandes que 1,5 mm et une sténose lumen de plus de 50%.
3. Avancez le cathéter intravasculaire d'ultrason à la région d'intérêt et enregistrez des images. Utilisez le logiciel approprié pour localiser et mesurer la plus petite zone lumineuse.
4. Utilisez un cathéter coronaire pour recueillir 10 ml de sang de l'endroit le plus proche de la plaque.
5. Après le congé du patient, planifiez des évaluations médicales périodiques pour suivre les critères d'évaluation de l'étude. Si le contact téléphonique n'est pas possible ou si une visite chez le médecin est retardée de plus de 2 mois, demandez à une personne autorisée (précédemment conçue) de vérifier les points de terminaison de l'étude.
   REMARQUE : Considérez l'un des MACE suivants : 1) la mort cardio-vasculaire, 2) l'infarctus du myocarde nouveau, 3) l'angine instable incitant une visite médicale imprévue dans les 24 h, 4) la reposnose d'endoprothèse comme démontré par l'angiographie coronaire, 5) des épisodes de décompensé l'insuffisance cardiaque nécessitant une attention clinique.

2. Détermination des CPM circulants (figure 2)

1. Traiter le sang dans un délai de 1 h à partir de la collecte. Transférer 6 ml de sang recueilli dans un tube conique de 15 ml et diluer 1:1 (v/v) avec 1x phosphate tamponné salin (PBS), pH 7,4.
2. Ajouter 2 ml de gradient de densité moyen à trois tubes à essai. Transférer soigneusement trois aliquots de volume égal de sang dilué dans chaque tube à essai contenant le milieu de gradient de densité.
   REMARQUE : Le volume total de gradient de densité moyenne et de sang dilué ne doit pas dépasser les trois quarts de la capacité maximale du tube à essai.
3. Centrifugeuse à 1 800 x g, 4 oC pendant 30 min. Transférer la bande à l'interface entre les couches dans un nouveau tube. Ajouter 2 ml de PBS et centrifugeuse à 1 800 x g,4 oC pendant 6 min. Le granule contiendra les MPC.
4. Laver la pastille plusieurs fois. Aspirer la solution précédente et resuspendre doucement le granule de cellules dans du PBS frais. Pour les lavages subséquents, centrifugeuse à 1 800 x g, 4 oC pendant 2 min. Répétez le processus 6x.
5. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de PBS. Mélanger 20 ll de la suspension cellulaire avec 0,4 % de bleu trypan, dilué 1:1 (v/v). Appliquer une goutte sur un hémocytomètre et compter les cellules non tachées au microscope léger.
6. Passez à la détermination des CPM. Étiqueter les tubes de cytométrie d'écoulement de 5 ml et aliquot 1 x 10⁶ cellules par tube. Préparer les anticorps de contrôle correspondants avec l'isotype. Centrifugeuse à 1 800 x g, 4 oC pendant 6 min et jetez le supernatant.
7. Ajouter l'anticorps primaire dilué dans 100 l d'une solution d'incubation d'anticorps composée de 1 x PBS (pH 7,4), 2 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA), et 0,05% d'albumine bovine de sérum (BSA). Resuspendre pour 10 s et incuber pendant 20 min à 4 oC, protégé par la lumière. Le protocole peut être mis en pause à cette étape en fixant les lymphocytes dans 4% de paraformaldéhyde dans PBS et en stockant des échantillons jusqu'à 24 h à 4 oC.
   REMARQUE: Les concentrations finales des anticorps primaires utilisés dans le protocole actuel étaient CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Centrifugeuse à 1 800 x g, 4 oC pendant 2 min et jetez le supernatant. Resuspendre en 500 oL de 1x PBS (pH 7,4), 2 mM EDTA.
9. Effectuer l'analyse de cytométrie du débit. Utilisez des anticorps de contrôle assortis à l'isotype pour configurer la coloration de fond. Ensuite, certains lymphocytes se propagent à la parcelle FSC/SSC, en essayant d'exclure les granulocytes résiduels, les débris cellulaires et d'autres particules, qui sont habituellement situés dans le bas, à gauche distribués dans la parcelle. Cette distribution est considérée comme 100%.
10. Utilisez une porte contenant un grand nombre de cellules avec l'immunophénotype commun CD45^et CD34^. Pour les immunophénotypes double ment positifs, utilisez une porte identifiantprécédemment CD45, CD34 , avec l'ajout de KDR (VEGFR-2)^,CD133^,ou CD184^. Identifiez les sous-populations MPC par leurs marqueurs de surface cellulaire spécifiques. Rapport comme pourcentage d'événements fermés.
11. Identifier les principales sous-populations de MPC. Dans la présente étude, les principaux immunophénotypes étaient CD45^,CD34^,CD133, CD45^,CD34^,CD184^,CD45^,CD34^,CD34CD184^,CD45^-CD34^-KDR^,CD45^-CD34^-KDR^-CD133, et CD45^-CD34^-KDR^-CD184.
    REMARQUE : Les marqueurs de surface cellulaire utilisés étaient CD45 (lymphocytes), CD34 (cellules endothéliales et/ou vasculaires), KDR (VEGFR-2, marqueur de membrane des cellules endothéliales), CD133 (cellules progénitrices endothéliales), et CD184 (cellules souches hématopoïétiques et cellules endothéliales).

3. Détermination des biomarqueurs solubles dans le plasma

1. Utilisez un essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) pour déterminer la concentration de SICAM-1 et de MMP-9(figure 3, rangée supérieure).
   1. Centrifuger les échantillons de sang à 3 000 x g,température ambiante pendant 5 min et recueillir le plasma.
   2. Étiquetez les normes, les tubes d'échantillon et les tubes de commande. Équilibrez les puits pré-enduits dans la plaque d'astodage en lavant 2x avec le tampon de lavage fourni dans le kit ELISA.
   3. Transférez les normes, les échantillons et les contrôles aux puits. Sceller et incuber à 37 oC pendant 90 min.
      REMARQUE : Ne laissez pas les puits sécher complètement.
   4. Jetez le contenu et ajoutez l'anticorps de détection de biotine. Sceller et incuber à 37 oC pendant 60 min.
   5. Jeter le contenu et laver 3x. Sceller la plaque et incuber séquentiellement avec une solution de travail streptavidine suivie d'un substrat de téramethylbenzidine à 37 oC pendant 30 min, protégé par la lumière. Laver 3x entre les incubations. Lorsque la couleur se développe, ajoutez la solution d'arrêt, et lisez l'absorption de densité optique dans un lecteur ELISA microplaque.
2. Utilisez un test de multiplexage immunomagnétique pour déterminer la concentration du facteur de nécrose tumorale alpha (TNMD) et de l'interleukine 1 bêta (IL-1)(figure 3, rangée inférieure).
   1. Étiquetez les normes, les tubes d'échantillon et les tubes de commande.
   2. Vortex les perles magnétiques flacons pour 30 s. Transférer la suspension de perles à des tubes de taille appropriée, puis aux puits dans la plaque d'essai multiplexante. Le vortexage périodique évite les précipitations des perles.
   3. Insérez solidement la laveuse à plaque magnétique à main. Attendez 2 min pour que les perles s'accumulent au fond de chaque puits et inversez rapidement à la fois la laveuse à plaque magnétique à main et l'assemblage de la plaque, au-dessus d'un évier ou d'un contenant à déchets. N'oubliez pas d'utiliser la laveuse à plaque magnétique à main pour maintenir les perles à l'intérieur des puits.
   4. Ajouter 150 lde tampon de lavage dans chaque puits et attendre 30 s pour permettre aux perles de s'accumuler sur le fond. Jetez le contenu comme à l'étape 3.2.3. Ensuite, ajoutez 25 lde de tampon d'analyse universel (fourni dans le kit) suivi de 25 L de normes préparées, d'échantillons et de contrôles.
   5. Sceller la plaque et incuber pendant au moins 60 min à température ambiante, protégée par la lumière, en secouant constamment à 500 tr/min. Sinon, incuber toute la nuit à 4 oC, protégé par la lumière, avec des secousses constantes à 500 tr/min si possible.
   6. Laver 2x en ajoutant 150 l de tampon de lavage et attendre 30 s. Jetez le contenu en insérant la laveuse à plaque magnétique à main. Attendez 2 min et inversez-le sur un évier ou un conteneur à déchets.
   7. Incuber séquentiellement avec 25 l de mélange d'anticorps de détection suivi de 25 l de solution streptavidin-PE à température ambiante pendant 30 min, scelléet sémin, avec des secousses constantes à 500 tr/min. Laver 2x entre les incubations, tel que décrit à l'étape 3.2.6.
   8. Obtenir les lectures. Ajouter 120 l de tampon de lecture. Sceller la plaque et couver 5 min à température ambiante, protégée par la lumière, en secouant constamment à 500 tr/min. Exécutez la lecture sur un lecteur d'essai multiplexant. Ajuster les paramètres de lecture en fonction de chaque analyte.

Résultats

Le sinus coronaire, veineux, et le sang périphérique ont été rassemblés de 52 patients qui ont subi l'angiographie coronaire (figure 1) et ont montré une prédominance élevée de l'hypertension et de la dyslipidémie. Au suivi clinique, 11 (21,1 %) Les MACEs se sont produits 6 mois après l'angiographie coronaire : décès (n - 1), angine nécessitant la présence à l'hôpital (n - 6), infarctus du myocarde (n - 2), et/ou évidence de l'insuffisance c...

Discussion

La collecte de sang de l'artère coronaire affectée peut être difficile. Parfois, l'artère coronaire est à peine accessible. Dans ce cas, l'échantillonnage du sinus veineux peut être une alternative. Nous avons exécuté des essais de validation comparant des biomarqueurs circulants dans l'artère coronaire contre le sinus veineux, sans différences significatives. Cependant, la performance des biomarqueurs circulants a été validée seulement pour l'échantillonnage coronaire. Par conséquent, la performance des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm