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Résumé

Cet article décrit les protocoles d’évaluation de la réponse de Tfh et de GC B dans le modèle murin de l’infection par le virus de la grippe.

Résumé

Les cellules T Follicular Helper (Tfh) sont un sous-ensemble indépendant de cellules CD4+ T spécialisé dans le développement du centre germinal (GC) et la génération d’anticorps à haute affinité. Dans l’infection par le virus de la grippe, des réponses robustes des cellules Tfh et GC B sont induites pour faciliter l’éradication efficace du virus, ce qui confère un modèle de souris qualifié pour l’étude associée à Tfh. Dans cet article, nous avons décrit des protocoles dans la détection de la réponse immunitaire tfh-associée de base pendant l’infection de virus de grippe chez les souris. Ces protocoles comprennent : l’inoculation intranasale du virus grippal; coloration et analyse de cytométrie d’écoulement des cellules polyclonales et antigène-spécifiques de Tfh, des cellules de GC B et des cellules de plasma ; détection de l’immunofluorescence des PG; test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) de l’anticorps spécifique au virus de la grippe dans le sérum. Ces analyses quantifient essentiellement la différenciation et la fonction des cellules tfh dans l’infection par le virus de la grippe, fournissant ainsi une aide pour des études dans l’élucidation du mécanisme de différenciation et de la stratégie de manipulation.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études ont été axées sur le sous-ensemble de cellules CD4+ T nouvellement identifié, sous-ensemble de cellules Tfh, pour ses rôles essentiels dans le développement du centre germinal (GC) B. Le lymphome à cellules B 6 (Bcl6), qui est principalement considéré comme un répresseur génétique, est le facteur déterminant de la lignée des cellules tfh pour la preuve que l’expression ectopique de Bcl6 est suffisante pour conduire la différenciation de Tfh tandis que l’insuffisance de Bcl6 entraîne la disparition de la différenciation tfh1,2,3. Contrairement à d’autres sous-ensembles CD4+ T helper effectuant leur fonction effectrice par migration vers les sites de l’inflammation, les cellules Tfh fournissent l’aide de la cellule B principalement dans la zone folliculaire de la cellule B de la rate et du ganglion lymphatique. Les molécules co-stimulantes ICOS et CD40L jouent un rôle important dans l’interaction entre les cellules Tfh et GC B. Au cours de la différenciation tfh, l’ICOS transmet les signaux nécessaires des cellules B cognées et agit également comme un récepteur recevant des signaux de migration des cellules B du spectateur pour la localisation de la zone cellulaire B4,5. CD40L est un médiateur des signaux des cellules tfh pour la prolifération des cellules B et la survie6. Un autre facteur jouant le même rôle que CD40L est la cytokine IL21, qui est principalement sécrété par les cellules tfh. IL21 régule directement le développement et la production d’anticorps à haute affinité par les cellules GC B, mais son rôle dans la différenciation de Tfhest encore controversé 7,8. Pd-1 et CXCR5, qui sont maintenant les plus fréquemment utilisés dans l’identification des cellules tfh dans l’analyse de cytométrie de flux, jouent également un rôle important dans la différenciation et la fonction de ce sous-ensemble. CXCR5 est le récepteur de la chimiokine folliculaire à cellules B et médie la localisation des cellules tfh dans les follicules cellulaires B9. PD-1 est maintenant identifié non seulement pour avoir la fonction de guidage folliculaire, mais aussi transmettre des signaux critiques dans le processus de maturation d’affinité des cellules GC B10. Sur la base de ces résultats, l’évaluation de l’expression de ces molécules pourrait essentiellement refléter la maturation et la fonction des cellules tfh.

Gc est une structure microanatomique transitoire induite dans les organes lymphoïdes secondaires et fortement dépendante des cellules de Tfh, étant ainsi une lecture parfaite pour évaluer la réponse de Tfh. Dans GC, après réception des signaux 2010 par des cytokines et des molécules co-stimulantes, les cellules B sont soumises à la commutation de classe et à l’hypermutation somatique pour générer des anticorps à haute affinité11. La commutation différentielle de classe d’anticorps se produit dans le créneau différentiel de cytokine, dans lequel IL4 et IL21 induisent le commutation de classe IgG1 tandis que IFNγ induit le commutation de classe IgG212. Les cellules plasmatiques sont les producteurs d’anticorps sécrétés et sont des cellules différenciées en phase terminale. Comme les cellules Tfh, le développement de cellules B dans GC est associé à l’expression dynamique de nombreuses molécules significatives. Selon l’étude actuelle, les cellules GC B peuvent être identifiées comme B220+PNA+Fas+ ou B220+GL7 + Fas+celluleset cellules plasmatiques, par rapport à leurs précurseurs, l’expression downregulate de B220 et upregulate CD138 expression13. Qui plus est, ces deux caractéristiques peuvent être détectées dans l’analyse de cytométrie de flux et d’immunofluorescence, étant ainsi l’évaluation appropriée de la réponse de GC.

Des réponses cellulaires et humoristiques robustes sont induites dans l’infection par le virus de la grippe, les cellules Tfh et Th1 dominant la réponse des cellules CD4+ T14,ce qui en fait un modèle parfait pour l’étude de différenciation des cellules Tfh. La grippe A/Porto Rico/8/34 H1N1(PR8), qui est une souche couramment utilisée adaptée à la souris, est fréquemment utilisée dans cetteétude 14,15,16. Ici, nous décrivons quelques protocoles de base de l’essai tfh étude pertinente dans l’infection par le virus de la grippe: 1) l’inoculation intranasale du virus PR8; 2) cellules tfh spécifiques aux antigènes, cellules GC B et plasma et détection IL21 avec cytométrie d’écoulement; 3) visualisation histologique de GC ; 4) détection du titer d’anticorps antigène-spécifique dans le sérum avec ELISA. Ces protocoles fournissent les techniques nécessaires aux nouveaux chercheurs dans l’étude associée à Tfh.

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Protocole

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut Pasteur de Shanghai, en Chine. Toutes les expériences ont été réalisées sur la base des protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.

REMARQUE : L’infection virale des souris et l’isolement des organes doivent être effectués dans un état ABSL2.

1. Inoculation du virus de la grippe PR8 et enregistrement du poids des souris

  1. Préparez des souris C57BL/6 mâles de 8 semaines pour l’infection à la salle ABSL2.
    REMARQUE : Ce protocole convient également aux expériences avec des souris femelles.
  2. Dilution du virus PR8: sortir le virus du congélateur -80 °C et l’incuber sur la glace jusqu’à ce qu’il fonde dans le liquide. Vortex le virus stock à fond et diluer le virus à 2 PFU / μL avec stérile phosphate tamponné saline (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) dans un tube pré-réfrigéré de 1,5 mL.
  3. Anesthésie souris : peser chaque souris et calculer le volume (4 fois (μL) du poids de la souris (g)) du pentobarbital de sodium (2 mg/mL) à utiliser. Injecter le volume calculé de pentobarbital de sodium intraperitoneally.
    REMARQUE : Cette étape consiste à faire respirer les souris de façon constante et pacifique, afin que le titer précis du virus puisse être inoculé intranasally. Des battements cardiaques trop rapides ou lents indiquent une anesthésie inappropriée. En outre, l’utilisation de pommade vétérinaire est recommandée pour éviter la sécheresse oculaire.
  4. Inoculation intranasale: vortex du virus PR8 dilué à fond. Pipet 10 μL et effectuer soigneusement l’inoculation intranasale sur un côté goutte par goutte. Après avoir terminé l’inoculation de toutes les souris dans une cage (maximum 5 souris) de ce côté, répéter l’inoculation de l’autre côté (garder la respiration de la souris paisible et stable tout au long de l’inoculation). Chaque souris est infectée par 40 PFU du virus PR8 au total.
  5. Placez les souris dans la récumbence sternale dans des cages chaudes pour une meilleure renaissance.
  6. Surveillez le poids de la souris tous les jours pendant 10 jours. (Le jour de l’infection est enregistré comme jour 0).

2. Isolement des lymphocytes de la rate et du ganglion lymphatique médiastinien (MLN)

  1. Euthanasie de souris :mettre les souris dans une petite chambre et euthanasier les souris en pompant pacifiquement dans le CO2 à partir du fond de la chambre. Sortez les souris lorsqu’elles ne bougent pas et n’effectuez pas de dislocation cervicale pour s’assurer que les souris meurent complètement. Tremper les souris avec 75% d’éthanol et transférer sur le capot de biosécurité.
  2. Immobiliser les souris avec des aiguilles de dissection sur la plaque absorbante en mousse de dissection recouverte de papier. Couper la peau le long de la ligne médiane abdominale et les pattes postérieures avec des ciseaux de dissection et étirer la peau avec des pinces à épiler. Immobiliser la peau tendue avec des aiguilles de dissection.
  3. Préparer deux plats de 6 cm pour chaque souris et les garder sur la glace. Mettre une passoire cellulaire de 70 μm dans chaque plat et ajouter 5 mL de DMEM complété par 1 % de sérum bovin fœtal (DMEM (1 % de FBS))
  4. Isolement de rate : coupez le péritoine pour exposer la cavité abdominale avec des ciseaux de dissection. Prendre la rate et la mettre dans le plat préparé.
  5. isolement mLN : couper le diaphragma et le fond de la nervure de la cage à proximité du thymus. Tirez la côte de côté et épinglez-la avec des aiguilles de dissection pour exposer la cavité thoracique. Tirez le poumon de côté vers le côté droit et utilisez des pinces à épiler pour prendre le mLN, sous le cœur et près du côté ventral de la trachée.
  6. Mettre le mLN dans le plat préparé.
  7. Obtenez les suspensions à cellule unique : maillez doucement la rate ou le mLN à l’aide d’un piston de seringue de 3 mL à travers la passoire cellulaire de 70 μm. Rincer la passoire cellulaire avec 1 mL de DMEM frais (1% FBS). Resuspendez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
  8. Centrifugeuse de la suspension cellulaire à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Retirer le supernatant et ajouter 1 mL de DMEM (1% FBS).
  9. Resuspendez la pastille cellulaire avec 1 mL-pipette à fond. Ajouter 4 mL de DMEM (1 % de FBS) dans les suspensions cellulaires de la rate et les garder sur la glace pour les opérations suivantes.
    REMARQUE: Il est nécessaire de résuspendre la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu d’abord, pas 5 mL, pour isoler complètement les cellules individuelles de granulés.
    À partir de cette étape, toutes les opérations peuvent être effectuées dans le laboratoire régulier.
  10. Comptage des cellules de la rate
    1. Resuspendez les cellules en tournant les tubes de haut en bas pendant plusieurs fois. Prendre 10 μL dans 90 μL de tampon de lyse des globules rouges (RBC) (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 155mM NH4Cl). Incuber à température ambiante (RT) pendant 3 min et ajouter 900 μL de PBS froid pour mettre fin à la réaction.
    2. Centrifugeuse à 400 x g pendant 6 min à 4 °C et enlever le supernatant. Resuspendez avec 100 μL de PBS froid. Prendre 10 μL de cellules dans 10 μL de 0,4% w/v trypan bleu et prendre 10 μL du mélange pour le comptage cellulaire avec l’hémomètre.
    3. Calcul : calculer les cellules comme méthode régulière. En bref, comptez les numéros de cellules dans deux carrés d’angle diagonales sur l’hémocytomètre et obtenez N1, N2 pour chaque carré d’angle. La concentration cellulaire de la suspension cellulaire de 5 mL doit être calculée comme (N1+N2)/2 x 10 4/mL.

3. Immunostaining des cellules polyclonales de Tfh avec PD-1 et CXCR5

  1. Coloration avec l’anticorps biotin-anti-CXCR5.
    1. Resuspendez les suspensions cellulaires en tournant le tube de haut en bas. Prendre 2 x 106 cellules dans le tube FACS et ajouter 2 mL de tampon de coloration (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Laver par vortex sur le dispositif d’oscillation vortex.
    2. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez le surnatant en versant le liquide et trempez la bouche du tube sur le papier absorbant deux fois.
    3. Desserrer la pastille cellulaire avec le liquide résidu en tapant le fond du tube. Mettre le tube dans le support du tube sur la glace.
      REMARQUE : Le volume de liquide résidu est d’environ 25 μL.
    4. Ajouter 0,2 μL de CD16/CD32 anti-souris (bloqueur de récepteurs Fc) pour chaque tube. Vortex en tapant doucement le fond du tube et en incuber sur la glace pendant 10 min.
      REMARQUE : Préparer le mélange d’anticorps pour plusieurs échantillons par dilution avec 5μL de tampon de coloration pour chaque tube. La recette du mélange doit être préparée en diluant (n/10+1) x 0,2 μL de bloqueur de récepteurs Fc en (n/10+1) x 5 tampon de coloration μL et ajouter 5,2 μL de mélange dans chaque tube.
    5. Ajouter 0,3 μL de biotine-anti souris CXCR5 dans le résidu de 30 μL de tampon de coloration pour chaque tube et vortex en appuyant sur le fond du tube.
      REMARQUE : Préparer le mélange tel que décrit à l’étape 3.1.4.
    6. Incuber sur la glace pendant 1 h avec des cellules doucement résuspendantes en tapant le tube à 30 min.
      REMARQUE: Vortex à 30 min est d’éviter les agrégats cellulaires pour une meilleure coloration.
    7. Ajouter 2 mL de tampon de coloration et vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C et jeter le supernatant tel que décrit à l’étape 3.1.2. Vortex en tapant sur le tube et incuber sur la glace pour la coloration ultérieure.
  2. Coloration avec d’autres marqueurs de surface.
    1. Préparer le mélange d’anticorps (tableau 1) tel que décrit à l’étape 3.1.4.
    2. Ajouter le mélange d’anticorps dans chaque tube. Vortex en tapant le fond du tube et incuber sur la glace pendant 30 min.
    3. Laver les cellules avec 2 mL de tampon de coloration. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C.
    4. Jetez le supernatant et ajoutez 400 μL de tampon de coloration. Vortex le tube sur le dispositif d’oscillation vortex et de garder le tube dans l’analyse de cytométrie du débit de till sombre.

4. Immunostaining des cellules tfh spécifiques au virus de la grippe PR8

REMARQUE : Ce protocole de coloration des cellules Tfh spécifiques à la PN est isoth des étudesprécédentes 15,17.

  1. Effectuez la coloration biotine-CXCR5 décrite à l’étape 3.1, sauf que le numéro de cellule pris pour la coloration est de 3 x 106 pour que suffisamment de cellules spécifiques aux antigènes soient enregistrées dans la cytométrie du débit.
  2. Ajouter 0,3 μL de tétramer APC-conjugué-IAbNP311-325 MHC (NP311-325)dans le tube à partir de 3,1,7. Préparer le mélange pour plusieurs échantillons comme à l’étape 3.1.4
    REMARQUE : Il est important de tacher le tétramer avant l’ajout d’anticorps anti-CD4 car la liaison entre le CD4 et l’anticorps anti-CD4 interférerait avec la coloration optimale du tétramer.
  3. Resuspendez le mélange cellulaire en tapant doucement sur le tube et incubez dans l’obscurité à RT pendant 30 min.
    REMARQUE : Couvrir un papier humide sur la bouche des tubes pour diminuer l’évaporation
  4. Ajouter le mélange d’autres marqueurs de surface (tableau 1) et poursuivre l’incubation à RT pendant 30 min.
  5. Laver et résuspendre les cellules telles que décrites dans les étapes 3.2.3 et 3.2.4.

5. Immunostaining de Bcl6 dans les cellules polyclonales de Tfh

  1. Effectuer des marqueurs de surface (Tableau 2) coloration comme décrit dans la section 3, sauf que le dernier lavage avec 2 mL de PBS, au lieu de tacher tampon.
  2. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez le supernatant et resuspendez les granulés cellulaires en appuyant doucement sur le fond du tube.
  3. Ajouter 300 μL de solution de formaldéhyde à 3,7 % (diluée à partir de 37 % de formaldéhyde avec PBS) dans le tube pour la fixation cellulaire. Vortex sur le dispositif d’oscillation vortex et incuber à RT pendant 20 min.
  4. Ajouter 2 mL de tampon de coloration pour le lavage et la centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en tapant doucement sur le tube.
  5. Ajouter 300 μL de 0,2 % de Triton-X 100 et resuspendre les cellules par vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Incuber à RT pendant 15 min.
  6. Ajouter 2 mL de tampon de coloration pour le lavage. Centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez les cellules supernatantes et résuspendantes en appuyant doucement sur le fond du tube.
  7. Ajouter 1,5 μL d’anticorps PE-anti-Bcl6 pour chaque tube. Tapoter doucement le fond du tube pour résusquer le mélange et incuber à RT pendant 2 h en tapant doucement sur le tube toutes les 30 minutes.
    REMARQUE : Couvrir un papier humide sur la bouche des tubes pour diminuer l’évaporation du mélange.
  8. Ajouter 2 mL de PBS complété par 0,01% Triton-X 100 dans le tube. Vortex et centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C.
  9. Répétez le lavage à l’étape 5.8. Resuspendez les cellules avec 400 μL de tampon de coloration. Gardez les cellules dans l’obscurité sur la glace jusqu’à l’analyse de cytométrie d’écoulement.

6. Coloration intracellulaire de l’IL21

  1. Stimulez les cellules avec pma (phorbol 12-myristate 13-acétate) et ionomycine.
    1. Prendre 2 x 106 cellules de suspension cellulaire splénique et centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez la pastille cellulaire supernatante et résuspendante avec 500 μL de milieu complet des cellules T. Transférer les cellules dans la plaque de 24 puits.
    2. Ajouter 20 nmol PMA et 2 μmol ionomycine dans 500 μL demilieu complet 18 et bien mélanger en pipetting de haut en bas.
    3. Ajouter la solution préparée à l’étape 6.2 dans la suspension cellulaire dans la plaque de 24 puits et mélanger en secouant la plaque. Configurer le contrôle non formulé en ajoutant 500 μL de milieu complet des cellules T sans ajout de PMA et d’ionomycine dans les cellules. Incuber dans un incubateur de CO2 à 37°C pendant 4 h.
    4. Ajouter 10 μmol BFA (Brefeldin A, dissous avec du méthanol) dans chaque puits pour bloquer le transport des protéines golgi. Remettre la plaque à l’incubateur cellulaire et incuber pendant 2 h.
  2. Effectuez la coloration des marqueurs de surface cellulaire.
    1. Resuspendez les cellules en pipetting doucement de haut en bas et transférez les cellules dans un tube FACS. Ajouter 1 mL de tampon de coloration dans le tube et la centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C.
    2. Effectuez la coloration du bloqueur de récepteurs Fc comme étape 3.1.4.
    3. Effectuer des marqueurs de surface cellulaire souiller (Tableau 3) tel que décrit dans les étapes 3.2.1 à 3.2.3 sauf les cellules de lavage avec 2 mL de PBS.
    4. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez les cellules supernatantes et résuspendantes en tapant sur le fond du tube.
  3. Ajouter 0,2 μL de réagençant du kit de coloration Fixeur Vivant/Mort Aqua Dead Cell et incuber le tube dans l’obscurité à RT pendant 10 min pour effectuer la coloration des cellules mortes.
  4. Ajouter 2 mL de PBS dans le tube et vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C et jeter le supernatant.
  5. Effectuez la fixation cellulaire décrite dans les étapes 5.3 et 5.4.
  6. Ajouter 300 μL de tampon de coloration pour resuspendre les cellules et conserver les tubes dans le réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit. Centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C pour enlever le supernatant.
    REMARQUE : Cette étape pourrait être omise et continuer à marcher 6,7 directement après l’étape 6.5.
  7. Ajouter 1 mL de tampon saponine (tampon de coloration complété par 0,2%(w/v) saponine) dans le tube et vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Incuber sur la glace pendant 20 min pour effectuer la perméabilisation cellulaire.
  8. Centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C et jeter le supernatant.
  9. Ajouter 0,5 μL de récepteur fc-IL21 humain dans chaque tube. Préparer le mélange d’anticorps pour plusieurs comme étape 3.1.4 sauf que diluer l’anticorps avec tampon de saponine au lieu de colorer tampon.
  10. Incuber à RT pendant 1 h en appuyant doucement sur le fond du tube pour réutiliser les cellules à 30 min.
  11. Ajouter 2 mL de tampon de saponine pour laver les cellules et la centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min. Jeter le surnatant et répéter le lavage une fois.
  12. Ajouter 0,1 μL d’Ig (H+L) anti-humain APC dans chaque tube. Préparer le mélange pour plusieurs échantillons comme étape 3.1.4 sauf que diluer l’anticorps avec tampon de saponine au lieu de souinage tampon.
  13. Incuber les échantillons sur la glace pendant 30 minutes et laver à l’étape 6.11.
  14. Resuspendez les cellules avec 400 μL de tampon de coloration. Gardez l’échantillon dans l’obscurité sur la glace jusqu’à l’analyse de cytométrie d’écoulement.

7. GC B et cellules plasmatiques soudant

  1. Prenez des cellules et effectuez la coloration anti-fc-récepteur d’anticorps comme étapes de 3.1.1 à 3.1.4.
  2. Effectuer des marqueurs de surface tacher (Tableau 4) comme étapes de 3,1,5 à 3,1,7, sauf que le temps d’incubation est de 30 min au lieu de 1 h.
  3. Resuspendez les cellules avec 400 μL de tampon de coloration. Gardez les échantillons dans l’obscurité sur la glace jusqu’à l’analyse de cytométrie d’écoulement.

8. Isolement du sérum du sang

  1. Le jour 14 après l’infection (d.p.i 14), recueillir le sang de la veine faciale et garder des échantillons de sang dans un réfrigérateur de 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Effectuez la collecte de sang à l’état d’ABSL2 et à partir de cette étape toutes les procédures pourraient être exécutées dans le laboratoire régulier.
  2. Centrifugeuse du sang à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Isoler soigneusement le sérum avec la pipette de 200 μL pour éviter la pollution des globules rouges. Aliquot en 3 tubes pour chaque échantillon et les stocker à -80°C.

9. Analyse du titer d’anticorps ha-spécifique avec ELISA

  1. Enrober les assiettes ELISA de 50 μL de solution protéique HA de 2 μg/mL par puits et les incuber au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
  2. Laver trois fois avec 200 μL d’interpolation diluée par PBS de 0,05 % (PBST). Ajouter 100 μL de lait écrémé dilué PBST à 5 % dans chaque puits et incuber à RT pendant 2 h pour bloquer la liaison non spécifique.
  3. Dilution et incubation du sérum : préparez 3 % de BSA dans PBS comme tampon de dilution. Diluer le sérum dans le tampon de dilution comme 1:50, 1:150, 1:450, ...... à 1:36450 (la dilution en série 3 fois est recommandée). Ajouter 50 μL de sérum dilué à chaque puits et incuber au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
  4. Jetez le sérum et lavez rapidement les puits une fois en ajoutant 200 μL de PBST dans chaque puits (secouez-le doucement, puis jetez-le). Ensuite, lavez lentement les assiettes sur shaker avec 200 μL de PBST trois fois pendant 5 min chacune.
  5. Ajouter 100 μL d’anticorps secondaires étiquetés HRP spécifiques à l’IgG total, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, dilué avec PBST) et incuber à RT pendant 1 h. Laver les assiettes par PBST tel que décrit dans 9.4.
  6. Sortez le volume égal du tampon A et du tampon B (TMB) à partir de 4 °C de stockage et réchauffez-vous pendant au moins 30 minutes à RT avant utilisation. Mélanger A et B et ajouter 100 μL de TMB dans chaque puits et les incuber pendant 10-30 minutes à RT en secouant doucement.
    REMARQUE : Il s’agit d’une brève description du manuel de l’ensemble de reagents de substrat TMB (BD,555214).
  7. Pipette 100 μL de 2M H2SO4 dans chaque puits pour mettre fin à la réaction. Lisez la valeur OD450 à l’instrument.
  8. Analyse des données : obtenez la valeur finale de l’OD450 en soustrayant le signal d’arrière-plan (valeur OD450 du puits vide). Dessinez la courbe correspondant à un isotype d’anticorps de chaque échantillon avec le facteur de dilution sur l’axe X et la valeur OD450 sur l’axe Y.

10. Histologie

  1. Isoler la rate à d.p.i 10. Fixez-les dans la solution de formaldéhyde de 3,7% pendant 1 h à RT. Jetez le tampon de fixation et lavez-les avec PBS pendant 5 min sur le shaker pendant trois fois.
  2. Déshydratez les rates en PBS (10% saccharose) à 4°C pendant 1 h, puis déshydratez-les en PBS (30% saccharose) à 4°C en secouant doucement jusqu’à ce que la rate coule au fond du tube de 15 mL.
  3. Sortez les rates déshydratées, intégriez-les dans le composé optimal de température de coupe et cryosectioned.
  4. Pré-refroidir l’acétone à -20°C. Incuber les sections tissulaires avec de l’acétone pré-réfrigérée pendant 10 min. Laver les tissus avec du PBS trois fois.
  5. Perméabiliser les sections tissulaires avec PBS contenant 0,2% Triton X-100 pendant 20 min et les laver pendant trois fois avec PBS.
  6. Bloquez la liaison non spécifique avec pbs contenant 10% sérum normal de chèvre (tampon de blocage) pendant 1 h à RT et lavez les sections de tissu avec PBS une fois.
  7. Bloquez la liaison non spécifique avec le kit de blocage STREPTAVIDIN/BIOTIN.
    REMARQUE : Ne laissez pas sécher les échantillons à partir de cette étape.
  8. Coloration avec l’anticorps primaire : ajouter le biotine-PNA dilué tampon bloquant (25 μg/mL) et l’IgD anti-souris de rat (2.5 μg/mL) sur les sections de tissu soigneusement. Incuber les sections tissulaires dans la chambre humide dans le congélateur de 4 °C pendant la nuit.
  9. Lavez rapidement les sections de tissu avec PBST une fois. Lavez rapidement les sections tissulaires du PBST en secouant lentement pendant 5 min. Répéter le lavage trois fois.
  10. Diluer Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) et Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) anticorps avec tampon de blocage et les ajouter sur les sections tissulaires soigneusement
  11. Incuber à RT pendant 1 h.
  12. Lavez les sections de tissu comme étape 10.8 et montez soigneusement avec la solution de prolongation. Couvrez soigneusement le tissu avec des coverslips et gardez-les dans l’obscurité à 4°C jusqu’à l’analyse confoccale.
  13. Analyser l’ampleur de la réaction gc en comptant les nombres de GC par taille de zone.

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Résultats

Caractérisation de la morbidité des souris dans l’infection par le virus de la grippe
Après l’infection par le virus de la grippe, les souris sont moins actives et anorexiques en raison d’une maladie, qui se reflète par une perte de poids grave, un symptôme couramment utilisé pour surveiller la morbidité dela souris 19. Comme le montre la figure 1a, les souris infectées par le virus PR8 ont commencé à perdre du poi...

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Discussion

En raison de rôles spécialisés dans la fourniture d’aide à la cellule B pour la génération d’anticorps à haute affinité, les cellules tfh ont fait l’objet d’études approfondies dans les mécanismes de différenciation et de manipulation afin de fournir de nouvelles stratégies pour la conception du vaccin. L’infection par le virus grippal induit des réponses vigoureuses des cellules Tfh et GC B, ce qui est un modèle approprié pour ce domaine de recherche. Dans cet article, nous avons décrit des pro...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le personnel de l’installation de cytométrie de débit, de l’installation ABSL2 et de l’installation animale SPF de l’Institut Pasteur de Shanghai pour leur aide technique et leurs conseils. Ces travaux ont été soutenus par les subventions suivantes : Programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des sciences (XDB29030103), Programme national de R-D de la Chine (2016YFA0502202), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31570886).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6
37% formaldehydeSigmaF1635
Anti-CD16/32 mouseThermo Fisher Scientific14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramerNIH
Bcl-6 PEBiolegend358504clone:7D1
Biotin-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82clone: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82clone:GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42clone:IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82clone:IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150clone:MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070clone:7E.17G9
PD1 PE/Cy7Biolegend135216clone:29F.1A12
Streptavidin BV421BD Pharmingen563259
Streptavidin PEBD Pharmingen554081
Intracelluar staining of IL21
37% formaldehydeSigmaF1635
anti-human IgGJackson ImmunoResearch Laboratories109-605-098
Brefeldin ASigmaB6542
human FCc IL-21 receptorR&D System
ionomycinSigmaI0634
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kitThermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
SaponinMP102855
GC B and plasma cells staining
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81clone:RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070clone:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7BD Pharmingen557653clone:Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82clone:11-26c
PNA FITCSigmaL7381
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
TMB Substrate Reagent SetBD Pharmingen555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgGLife TechnologyA21434
anti-mouse IgDBiolegend405702
biotinylated PNAVector laboratoriesB-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidinLife TechnologyS11223
normal goat serumSouthernBiotech0060-01
Pro-long gold antifade reagentThermo Fisher ScientificP3630
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kitVector laboratoriesSP-2002

Références

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  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
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