Microarrays de bioparticules pour l’analyse chimiotaxique et moléculaire de l’ésaimage humaine de neutrophile in vitro

Résumé

Ce protocole génère des microréseaux de bioparticules qui fournissent un essaim de neutrophile contrôlé spatialement. Il permet un accès facile aux médiateurs qui neutrophiles libèrent pendant la migration et permet une analyse d’imagerie quantitative.

Résumé

L’essaimage de neutrophile est un processus coopératif par lequel les neutrophiles scellent un site d’infection et favorisent la réorganisation des tissus. L’essaimage a été classiquement étudiée in vivo dans des modèles animaux montrant des modèles caractéristiques de migration cellulaire. Cependant, les modèles in vivo ont plusieurs limites, y compris les médiateurs intercellulaires qui sont difficiles d’accès et d’analyse, ainsi que l’incapacité d’analyser directement les neutrophiles humains. En raison de ces limitations, il est nécessaire d’avoir une plate-forme in vitro qui étudie le grouillage de neutrophiles humains et facilite l’accès aux signaux moléculaires générés pendant l’essaimage. Ici, un processus de micro-amactinage en plusieurs étapes est utilisé pour générer un microréseau de bioparticules qui stimule l’essaimage en imitant une infection in vivo. Le microarray de bioparticules induit des neutrophiles à essaimer d’une manière contrôlée et stable. Sur le microarray, les neutrophiles augmentent en vitesse et forment des essaims stables autour des grappes de bioparticules. En outre, le supernatant généré par les neutrophiles a été analysé et 16 protéines ont été découvertes pour avoir été exprimées différemment au cours de l’essaimage. Cette plate-forme d’essaimage in vitro facilite l’analyse directe de la migration des neutrophiles et de la libération de protéines d’une manière reproductible et contrôlée spatialement.

Introduction

Neutrophiles, le globule blanc le plus abondant dans la circulation sanguine¹, attirent l’attention en tant que cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles^2,3 parce qu’ils peuvent être impliqués dans une variété de conditions médicales, y compris la goutte⁴, sepsis³, traumatisme^5,6, cancer^1,7,8, et diverses maladies auto-immunes^5,9. Neutrophil essaimage est un processus en plusieurs étapes, étroitement réglementé avec une complexité qui en fait un centre particulièrement intéressant de l’étude^5,10,11. Pendant l’essaimage, les neutrophiles isolent un site d’inflammation du tissu sain environnant^5,10,11. Une réglementation appropriée de l’essaimage neutrophile est essentielle pour promouvoir la cicatrisation des plaies et, finalement, la résolution de l’inflammation^5,12. Neutrophil essaimage a principalement été étudié in vivo chez les rongeurs^12,13,14,15 et le poisson zèbre^10,11,12,15 modèles. Cependant, la nature de ces modèles animaux in vivo donne lieu à des limitations⁵. Par exemple, les médiateurs libérés par les neutrophiles pendant l’essaimage ne sont pas facilement accessibles pour l’analyse⁵. En outre, il existe de nombreuses sources potentielles pour un médiateur donné in vivo, de sorte qu’une expérience in vivo doit introduire une déficience génétique pour inhiber la production cellulaire et / ou l’interaction afin d’étudier le rôle de ce médiateur dans un processus donné¹³. Une expérience in vitro contourne cette complication en permettant l’observation des neutrophiles sans le contexte de cellules supplémentaires. En outre, la recherche décrivant la migration coordonnée des neutrophiles humains est limitée¹⁶. Sur une plate-forme d’essaimage in vitro, les neutrophiles humains peuvent être analysés directement. Une plate-forme d’essaimage in vitro pourrait élargir les connaissances acquises à partir d’études in vivo en offrant des possibilités de combler les lacunes laissées par les limites des études in vivo.

Pour répondre à la nécessité d’une plate-forme in vitro qui imite l’essaimage in vivo neutrophile, nous avons développé une plate-forme de micro-estampillage qui nous permet de modeler des microréseaux de bioparticules qui stimulent l’essaimage de neutrophiles d’une manière contrôlée spatialement. Nous produisons des microréseaux de bioparticules sur des lames de verre en deux étapes. Tout d’abord, nous utilisons le micro-estampage pour générer un microarray de taches de polyélectrolyte cationique (CP). Deuxièmement, nous ajoutons une solution de bioparticules qui adhèrent aux taches de CP par l’interaction électrostatique. En modelant d’abord la couche de CP, nous pouvons modeler sélectivement les bioparticules chargées négativement pour produire le modèle d’essaimage désiré de neutrophile. La couche chargée positivement retient les bioparticules chargées négativement par l’étape de lavage vigoureuse qui enlève les bioparticules des secteurs sur la glissière de verre qui n’ont pas le CP. En outre, le CP utilisé ici, un copolymère d’acrylamide et de monomère cationique quatertisée, est biocompatible, de sorte qu’il n’induit pas une réponse des neutrophiles. Il a une charge de surface très élevée qui immobilise les bioparticules de la taille d’un micron à la glissière de verre, empêchant ainsi les neutrophiles d’enlever les particules de la position modelée sur la glissière de verre. Il en résulte des grappes de bioparticules disposées en microarray. Lorsque nous avons ajouté des neutrophiles au microréseau, ils ont formé des essaims stables autour des grappes de bioparticules. En suivant la migration des neutrophiles, nous avons constaté que les neutrophiles grouillants migrent activement vers les grappes de bioparticules. En outre, nous avons utilisé cette plate-forme pour analyser certains médiateurs qui neutrophiles libèrent pendant l’essaimage. Nous avons trouvé 16 médiateurs qui sont exprimés différemment pendant l’essaimage. Leurs concentrations suivent trois tendances générales au fil du temps : augmentation, diminution ou pic. Notre plate-forme d’essaimage in vitro neutrophile facilite l’analyse de l’essaimage de neutrophiles humains contrôlés spatialement, ainsi que la collecte et l’analyse des médiateurs libérés par l’essaimage neutrophile. Dans une publication précédente, nous avons démontré que les patients présentant certaines conditions médicales (traumatisme, maladie auto-immune, et sepsis), ont eu des neutrophiles qui ont fonctionné différemment de ceux des donateurs en bonne santé^5. Dans de futures études de recherche, notre plate-forme pourrait être utilisée pour analyser la fonction neutrophile parmi une variété de populations de patients. Cette plate-forme peut analyser quantitativement la coordination complexe impliquée dans l’essaimage de neutrophiles. D’autres études peuvent être faites pour fournir un aperçu sur la fonction neutrophile d’une population spécifique de patients ou la réponse de neutrophile à un agent pathogène d’intérêt.

Protocole

Les auteurs reconnaissent les volontaires en bonne santé qui ont gentiment donné leur sang. Des échantillons de sang ont été obtenus après le consentement éclairé du volontaire selon le protocole de la commission d’examen institutionnel (CISR) #2018H0268 examiné par le Comité des sciences biomédicales de l’Université d’État de l’Ohio.

1. Microfabrication de microréseau de bioparticules

1. À l’aide de procédures photolithographie standard, générer la plaquette de silicium maître.
   1. Générez une preuve de la conception souhaitée à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD), puis envoyez à un fabricant de photomasques pour produire un photomask chromé. La conception utilisée ici est de 4 mm x 4 mm de tableaux rectangulaires de 30 m de diamètre remplis en cercles avec un espacement centre-centre de 150 m. Cette conception peut être modifiée comme souhaité pour différentes applications.
   2. Spincoat une couche de 40 m d’épaisseur d’un photoresist négatif sur une plaquette de silicium. Cuire la plaquette à 65 oC pendant 5 min et 95 oC pendant 10 min.
   3. Exposer la plaquette à la lumière UV à l’égard d’un photomasque chromé avec un masque photo de 150 à 160 mJ/cm² (Figure 1A).
   4. Cuire la plaquette à 65 oC pendant 5 min et 95 oC pendant 10 min. Submergez la plaquette dans le développeur photorésistant pendant 10 min et rincez-la à l’alcool isopropyl. À ce stade, le motif doit être visible sur la plaquette (figure 1B).
2. Mélanger soigneusement un rapport de 10:1 de polydiméthylsiloxane prépolymère et son agent de durcissement (c.-à-d., 20 g de prépolymère et 2 g d’agent de durcissement) et verser le mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS) non durci sur la plaquette principale dans un plat Petri (Figure 1C).
3. L’aspirateur traiter le mélange non durci de PDMS jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air ne soit présente au-dessus de la plaquette principale. Cure à 65 oC pendant la nuit.
4. Utilisez un scalpel pour couper autour de l’extérieur de la section à motifs de la plaquette, et enlever lentement la dalle PDMS durcie. Placez la dalle PDMS sur une planche à découper propre avec le côté à motifs orienté vers le haut (Figure 1D).
5. Frappez les timbres individuels de la dalle PDMS avec un poinçon de biopsie de 8 mm (Figure 1E). Pour un toboggan en verre, huit timbres seront nécessaires.
6. Placez chaque timbre face vers le bas sur le ruban adhésif pour enlever les débris.
7. À l’avance, préparer une solution de CP de 1,6 mg/ml dans l’eau.
   1. Ajouter la bonne quantité de poudre de CP à l’eau (p. ex., 0,8 g à 500 ml).
   2. Mélanger sur une plaque à remuer à température ambiante pendant la nuit, ou jusqu’à ce que tout le solide soit dissous dans l’eau. La solution CP peut être stockée à température ambiante pendant 6 mois.
   3. Si désiré, rendre la solution CP fluorescente en ajoutant de la polylysine étiquetée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (PLL-FITC).
      1. Aliquot environ 10 ml de la solution CP. Ajoutez une petite quantité de PLL-FITC (0,05 mg) au volume aliquoted. La quantité peut être modifiée pour ajuster la luminosité de la fluorescence comme désiré.
      2. Vortex la solution CP étiqueté avec FITC pour 20 s, ou jusqu’à ce que la solution est d’un uniforme, couleur jaune pâle. Protégez-vous de la lumière et conservez-les à 4 oC jusqu’à 1 mois.
8. Avec les timbres face haute, amorcez chaque timbre avec une solution de 1,6 mg/mL de CP, assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air entre la solution CP et le timbre (Figure 1F).
9. Inverser les timbres sur une couche de solution CP (Figure 1G).
10. Retirez les timbres de la solution CP après 1 h.
11. Tamponnez chaque tampon humide face vers le bas sur une glissière en verre propre 6-8x pour enlever l’excès de liquide.
12. Traiter les timbres à l’aspirateur pendant 1 h à 2 min.
13. Adhérez un espaceur d’imagerie de huit puits de 9 mm de diamètre sur le dessus d’une glissière en verre propre comme guide pour le placement des timbres. Avec cet espaceur, chaque lame de verre peut avoir huit microarrays.
14. Placez un timbre face vers le bas sur la glissière de verre au centre de chaque puits de l’espaceur d’imagerie (c.-à-d., utilisez huit timbres au total).
15. Placer un poids équilibré de 5,6 à 0,1 g sur chaque timbre et laisser 10 min pour l’estampage (figure 1H). Un poids équilibré est nécessaire pour s’assurer que le timbre est pressé uniformément sur la glissière de verre et favoriser le transfert même du CP à la glissière de verre.
16. Retirez les poids et les timbres de la glissière en verre (Figure 1I). Laisser sécher la couche de CP à température ambiante pendant 24 h avant d’ajouter les bioparticules, telles que décrites à l’étape 1.17. Si le CP est étiqueté avec le FITC, l’efficacité de l’estampillage peut être vérifiée à ce stade avec un microscope fluorescent à 488 nm avant de passer à l’étape 1.17 (figure 1M).
17. Couper une dalle Vierge PDMS à la taille de l’espaceur d’imagerie et utiliser le poinçon de biopsie de 8 mm pour créer des puits dans le PDMS qui s’alignent avec les puits d’un espaceur d’imagerie. Adhérer à la dalle PDMS à la glissière de verre avec l’espaceur d’imagerie (Figure 1J).
18. Décongeler une solution de bioparticules (p. ex. E. coli ou zymosan) et diluer à 500 g/mL dans de l’eau pour injection (WFI).
    REMARQUE : Les bioparticules n’ont pas besoin d’être opsonisées. Les récepteurs de surface de Neutrophile reconnaissent directement des molécules sur ces bioparticules^19,20,21.
19. Ajouter 100 l de solution de bioparticules à chaque Puits de PDMS sur la glissière de verre (Figure 1K).
20. Basculer la glissière en verre pendant 30 min.
21. Rincer soigneusement les puits à l’eau. Le microréseau de bioparticules peut être stocké dans un environnement sans poussière à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu’à 3 mois. À ce stade, le modèle doit être vérifié avec un microscope fluorescent à 594 nm avant de passer à l’étape 2.1 (Figure 1N).

2. Préparation de l’échantillon

1. Recueillir au moins 2 ml de sang frais dans les tubes K2-EDTA du donneur désiré. Le rendement prévu des neutrophiles est de 1/2 x 10⁶ cellules/1 mL de sang entier. L’analyse d’imagerie nécessite environ 1,5 x 10⁵ neutrophiles, et l’analyse du supernatant nécessite 1 x 10⁶ neutrophiles. Utilisez le sang dans les 4 h.
2. Séparer les globules rouges (RBC) en ajoutant un agent d’agrégation d’érythrocytes dans un rapport de 1:5 au sang entier. Attendez 45 min pour qu’une couche translucide (manteau de buffy) se sépare de la couche de RBCs.
3. Retirer le pelage poli et laver avec du phosphate tamponné salin (PBS) à l’aide d’une couche bouffie de 1 ml : 9 mL de PBS.
4. Centrifugeuse de 5 min à 190 x g et 20 oC.
5. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille à 5 x 10⁷ cellules/mL.
6. Utilisez un kit de sélection immunomagnétique négatif pour isoler les neutrophiles.
   1. Ajouter 50 ll de cocktail anticorps/1 mL de suspension cellulaire. Attendez 10 min.
   2. Ajouter 100 l de perles magnétiques/1 mL de suspension cellulaire. Attendez 10 min.
   3. Ajouter la suspension cellulaire à un tube à fond rond et placer dans un aimant cylindrique. Attendez 10 min.
7. Verser le supernatant dans un tube de centrifugeuse. Ajouter jusqu’à 10 ml de PBS. Centrifugeuse de 5 min à 190 x g et 20 oC.
8. Aspirate supernatant. Resuspendre la pastille blanche dans IMDM avec 0.4% d’albumine humaine de sérum.
9. Tôle noyaux avec 20 g/mL Hoechst 33342 pendant 10 min à 37 oC.
10. Ajouter 5 mL d’IMDM avec 0,4% d’albumine de sérum humain pour rincer. Centrifugeuse de 5 min à 190 x g et 20 oC.
11. Resuspendre les cellules à 7,5 x 10⁵ cellules/mL dans IMDM avec 0,4% d’albumine de sérum humain.
12. Ajouter 100 l de la suspension cellulaire à un puits PDMS contenant un microréseau de bioparticules. Assurez-vous que la suspension cellulaire est convexe sur le dessus du PDMS bien et ne contient pas de bulles.
13. Scellez avec un bordereau de 12 mm de diamètre. Couvrez bien l’ouverture du PDMS d’un bordereau de 12 mm de diamètre. Appuyez doucement sur la glissière de couverture avec une pince à épiler afin que l’excédent de suspension cellulaire s’échappe au bord du puits. Utilisez un tissu pour enlever l’excédent de suspension cellulaire.

3. Exécution de l’analyse d’analyse et d’image

1. Chargez le réseau de microparticules avec des cellules sur la station d’imagerie cellulaire vivante avec un microscope équipé d’un incubateur de cage réglé à 37 oC, 5 % de CO₂et 90 % d’humidité relative.
2. Utilisez la microscopie fluorescente et brightfield en time-lapse pour enregistrer des images à 10x grossissement tous les 10 s à 405 nm, 594 nm, et brightfield. Dans une expérience typique, les images sont collectées jusqu’à 2 h.
3. Utilisez un logiciel automatisé de suivi cellulaire pour suivre la migration des neutrophiles individuels vers le cluster de bioparticules.
   1. Utilisez le mode d’autorégression d’un logiciel de suivi des cellules de détection ponctuelle. Définir le rayon de la tache à 5 m (la taille approximative d’un noyau de neutrophiles). Définir la longueur minimale de la voie à 120 s et une taille d’écart maximale d’un cadre.
   2. À partir des données générées par le logiciel de suivi cellulaire, extraire les fichiers qui contiennent la position et la vitesse des neutrophiles. Ces fichiers peuvent être utilisés avec un logiciel de graphique pour générer des pistes de migration neutrophiles (figure 2C) et une carte thermique de la vitesse par rapport au temps (Figure 2D), respectivement.
4. Utilisez les images fluorescentes de 405 nm pour suivre la taille des essaims au fil du temps sur un logiciel d’analyse d’images de votre choix.
   1. Définir les régions d’intérêt (ROI) autour de chaque grappe de bioparticules où les neutrophiles essaimeront. Gardez la même taille roi pour analyser chaque grappe de bioparticules.
   2. Analyser l’intensité fluorescente moyenne des images de 405 nm dans chaque retour sur investissement au fil du temps.
   3. Générez une courbe d’étalonnage d’intensité fluorescente moyenne à la taille de l’essaim en prenant des mesures manuelles à différentes tailles d’essaim s’établissant à partir de 0 m² à la taille maximale de l’essaim. Utilisez cet étalonnage pour calculer la taille de l’essaim au fil du temps.

4. Collecte de supernatants et détection de protéines

1. Incuber les neutrophiles dans les puits contenant le microréseau de bioparticules à 37 oC et 5 % de CO₂ pour 3 h. Prélever des échantillons aux moments souhaités. En règle générale, les échantillons seront prélevés à 0, 0,5, 1 et 3 h. Pour dépasser la limite de détection de l’analyse du tableau de protéines, le volume entier de supernatant d’un seul puits (200 L) a été utilisé pour chaque point de temps. Chaque point de temps a été analysé en triplicate.
2. À l’aide d’un microscope à champ lumineux, vérifiez que des essaims sont formés sur le microréseau.
3. Aspirez le supernatant avec une pipette de 200 l et chargez dans un tube de filtre de centrifugeuse de 0,45 m.
4. Centrifuger le supernatant à 190 x g et 20 oC pendant 5 min et recueillir le volume filtré.
5. Conserver les échantillons à -80 oC jusqu’au moment de traitement.
6. Utilisez un kit de microarray qui détecte une gamme de protéines humaines pour traiter les échantillons.
   1. Ajouter 200 l de chaque échantillon à un tube de dialyse séparé fourni avec le kit.
   2. Placer les tubes de dialyse dans un bécher contenant au moins 500 ml de PBS (pH à 8,0). Remuer délicatement sur une plaque à remuer pendant au moins 3 h à 4 oC. Changez le PBS dans le bécher et répétez cette étape.
   3. Transférer chaque échantillon dans un tube de centrifugeuse propre et une centrifugeuse à 9 000 x g pendant 5 min pour enlever les précipités. Transférer chaque supernatant dans un tube propre.
   4. Biotinylate chaque échantillon en ajoutant 36 L de réactif d’étiquetage 1x du kit par 1 mg de protéines totales dans l’échantillon dialysé à 180 l l d’échantillon dialysé. Incuber à 20 oC pendant 30 min. Mélanger délicatement toutes les 5 min.
   5. Ajouter 3 ll de solution d’arrêt fournie avec le kit dans chaque tube d’échantillon. Transférer chaque échantillon dans un tube de dialyse frais et répéter les étapes 4.6.2-4.6.3. À ce stade, l’échantillon peut être stocké à -20 oC ou -80 oC jusqu’à ce que vous soyez prêt à procéder.
   6. La lame de verre fournie avec le kit est stockée à -20 oC. Laissez-le venir à la température ambiante. Placez la glissière en verre assemblée dans un capuchon à débit laminaire pendant 1 h et 2 h à température ambiante.
   7. Ajouter 400 l l de la mémoire tampon de blocage fournie avec le kit dans chaque puits de la glissière en verre assemblée. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
   8. Centrifuger les échantillons préparés pendant 5 min à 9 000 x g pour éliminer les précipités ou les particules. Diluer 5x avec le tampon de blocage.
   9. Retirez le tampon de blocage de chaque puits. Ajouter 400 l d’échantillons dilués dans les puits appropriés. Incuber pendant 2 h à température ambiante tout en se balançant.
   10. Décant les échantillons de chaque puits. Laver 3x avec 800 l de la mémoire tampon de lavage 1x j’ai fourni avec le kit à température ambiante pendant 5 min chacun tout en berçant.
   11. Dans un récipient propre, immerger la glissière en verre assemblée dans un tampon de lavage 1x I. Laver 2x à température ambiante pendant 5 min chacun tout en berçant.
   12. Ajouter 400 L de streptavidinie conjuguée au Cy3 1x à chaque sous-array. Couvrir de bandes adhésives en plastique. Protégez-vous de la lumière pour le reste du protocole.
   13. Incuber pendant 2 h à température ambiante tout en se balançant.
   14. Décant la solution et démontez la glissière en verre des chambres d’échantillon.
   15. Dans le tube de centrifugeuse de 30 ml fourni avec le kit, ajouter soigneusement la glissière en verre et assez de tampon de lavage 1x I pour couvrir la glissière en verre. Laver 3x pendant 10 min chacun à température ambiante tout en berçant.
   16. Dans le tube de centrifugeuse de 30 ml, laver 2x avec 1x tampon de lavage II pendant 5 min chacun à température ambiante tout en se balançant.
   17. Laver la lame de verre avec 30 ml de ddH₂O pendant 5 min. Retirez la glissière en verre du tube de centrifugeuse et laissez sécher pendant 20 min dans une hotte à débit laminaire. La lame de verre préparée peut être entreposée à -20 oC jusqu’à ce qu’elle soit prête à être numérisée.
   18. Scanner la glissière en verre à l’eau à l’effet d’une émission de fluorescence de 555 nm.

Résultats

Lorsque des neutrophiles sont ajoutés au microréseau de bioparticules, les neutrophiles qui contactent les grappes de bioparticules s’activent et déclenchent la réponse de l’essaimage. Le microréseau de bioparticules a été validé à l’aide d’une microscopie fluorescente en accéléré pour suivre la migration des neutrophiles vers les grappes de bioparticules (Vidéo S1). La migration des noyaux neutrophiles individuels est suivie lorsqu’ils migrent vers le groupe de bioparticules. Lors...

Discussion

Nous avons développé une plate-forme de micro-ampillage pour générer des réseaux uniformes de bioparticules pour stimuler l’essaimage in vitro de neutrophiles. La nature in vitro de notre plate-forme nous permet de contourner les complications qui surgissent avec les expériences d’essaimage in vivo, à savoir la faible capacité d’analyser les médiateurs libérés par les neutrophiles grouillant s’agitent⁵. En outre, les modèles in vivo sont généralement effectués chez les ronge...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18001	Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator	Okolab	777057437 / 77057343	Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17957	Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch	Sigma Aldrich	Z708925	To cut PDMS stamps
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4	High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA)	Sigma Aldrich	A5843	Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053	To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask	Front Range Photomask	N/A	Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner	Perkin Elmer	ASCNGX00	Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris	Bitplane	9.3.0	Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package	Nikon Instruments	MQS31100	Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)	Sigma Aldrich	P3069-10MG	30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer	Grace Bio-Labs	654008	8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer	University Wafer	590	Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025	MicroChem	2025	Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer	MicroChem	Y020100	Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)	Dow	1673921	2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System	Kloé	UV-KUB 2	Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water	Thermo Fisher Scientific	A1287303	High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185	BASF	8185	Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	Z2843	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array