Nucléofection et propagation in vivo des parasites de poulet Eimeria

Résumé

Ici, nous avons fourni une méthode pour atteindre la transfection stable des parasites de poulet Eimeria par nucléozoites nucléozoites ou merozoites de deuxième génération. Les parasites eimeriens génétiquement modifiés exprimant des gènes antigéniques hétérologues pourraient être utilisés comme vecteurs de vaccination.

Résumé

La transfection est un processus technique par lequel le matériel génétique, comme l’ADN et l’ARN à double brin, est livré dans les cellules pour modifier le gène d’intérêt. Actuellement, la technologie transgénique devient un outil indispensable pour l’étude de l’Eimeria, les agents causatifs de la coccidiose chez la volaille et le bétail. Ce protocole fournit une description détaillée de la transfection stable chez les parasites eimeriens : purification et nucléofection des sporozoites ou mériozoites de deuxième génération, et propagation in vivo des parasites transfectés. En utilisant ce protocole, nous avons réalisé la transfection dans plusieurs espèces d’Eimeria. Pris ensemble, la nucléoféction est un outil utile pour faciliter la manipulation génétique chez les parasites eimeriens.

Introduction

Eimeria spp. provoque la coccidiose, ce qui entraîne des pertes économiques importantes dans l’industrie de l’élevage et de la volaille. Bien que les médicaments anticoccidiales, et dans une certaine mesure, les vaccins anticoccidiales atténués, ont été largement utilisés pour le contrôle de la coccidiose, il ya encore des lacunes concernant leur résistance aux médicaments, les résidus de médicaments, et la diffusion potentielle des souches vaccinales qui retrouvent la virulence¹. Avec le développement de la biologie moléculaire, la transfection est devenue un outil essentiel pour étudier les fonctions génétiques, développer de nouveaux vaccins et sélectionner de nouvelles cibles médicamenteuses pour Eimeria.

Au cours des dernières décennies, la transfection a été appliquée avec succès pour les parasites apicomplexans tels que Plasmodium et Toxoplasma gondii^2,3,4,5^,6. Une étude utilisant le journaliste de la transfection dans E. tenella a piloté ce travail dans Eimeria⁷. La transfection de E. tenella^8,9, E. mitis¹⁰, et E. acervulina (Zhang et al., données non publiées) a été un succès chez les poulets. Récemment, nous avons réalisé la transfection en utilisant des merozoites de E. necatrix par nucléofection¹¹.

Des études ont montré que l’expression d’Un antigène hétérologue par Eimeria a le potentiel d’être développé comme vaccin recombinant, comme ceux qui expriment l’antigène A (CjaA) de Campylobacter jejuni ou l’interleukine de poulet 2 (chIL-2)^12,13. Par conséquent, ce protocole décrit une étude de nucléofection d’Eimeria spp. chez les poulets. La procédure décrit la purification des sporozoites ou des mériozoites, la nucléoféction avec l’ADN plasmide, l’inoculation cloaque/injection intraveineuse et la propagation in vivo pour aider les chercheurs à commencer des études sur les parasites transgéniques d’Eimeria.

Protocole

Les poulets pour toutes les expériences animales ont été logés et maintenus selon les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université agricole de Chine et ont suivi les Principes directeurs internationaux pour la recherche biomédicale impliquant des animaux. Les expériences ont été approuvées par le Comité de l’administration de Beijing des animaux de laboratoire.

1. Extraction et purification des sporozoites d’Eimeria spp. (p. ex. E. tenella)

1. Libération des sporocystes
   1. Centrifugeuse 1 x 10⁷oocystes sporulés dans la solution de dichromate de potassium (2,5%, m/v) à 2 300 x g pendant 5 min. Lavez-les trois fois avec PBS (solution tampon de phosphate).
   2. Resuspendre les granulés avec 1 ml de PBS et transférer dans un tube de 15 ml. Ajoutez un volume égal de perles de verre (1 mm x 1 mm de diamètre) et oscillez la suspension de l’oocyst à l’aide d’un mélangeur à vortex pour libérer les sporocystes.
   3. Surveillez la libération de sporocystes par microscopie chaque minute. Arrêtez de vortexer lorsque plus de 90 % des oocystes sont brisés.
      REMARQUE: La plupart des oocysts (tels que E. tenella, E. necatrix, et E. acervulina) ont été brisés après 1 min à l’aide du mélangeur vortex.
   4. Transférer la suspension sporocyste dans de nouveaux tubes de 1,5 ml et une centrifugeuse à 1 600 x g pendant 5 min.
   5. Resuspendre le précipité avec 1 ml de solution de gradient de densité de 50%, combiner dans un tube de 1,5 ml, et centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min.
      REMARQUE : Pour la composition du gradient de densité, reportez-vousau tableau 1 . Le gradient de densité est un milieu colloïdal à base de silice, composé de particules colloïdales de silice de 15-30 nm de diamètre (23% w/w dans l’eau), qui ont été enduites à l’aide de polyvinylpyrrolidone (PVP).
2. Libération des sporozoites
   1. Resuspendre le précipité avec le tampon d’excystation (tableau 1) et couver dans un bain d’eau de 42 oC pendant 40-60 min pour libérer les sporozoites. Arrêtez d’incuber lorsque plus de 90 % des sporozoites sont libérés. Puis centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min.
      REMARQUE : Secouez les tubes une fois toutes les 5 minutes pendant l’excystation.
   2. Resuspendre les précipitations avec 1 ml de solution de gradient de densité de 55 % et centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min.
   3. Resuspendre les précipitations avec 1 ml de PBS et compter les sporozoites à l’aide d’un hémocytomètre.

2. Collecte et purification des mériozoites de E. necatrix

REMARQUE : Utilisez des poulets de chair Arbor Acre (AA) âgés de 7 à 14 d dans l’expérience. Les poulets sans coccidia (n-3) ont été inoculés avec 2 x 10⁵ oocystes de E. necatrix. À 109 h après l’infection, les oiseaux ont été sacrifiés par la dislocation cervicale. L’intestin a été enlevé pour la collecte des merozoites de 2^nd génération. Pour différentes espèces d’Eimeria, il y avait un temps différent pour la collecte des 2^nd génération merozoites : E. necatrix à 109 h, et E. tenella à 112 h post-inoculation. Pour la transfection de E. necatrix, les merozoites sont le choix optimal car les deuxièmes mériozoites sont faciles à purifier.

1. Collection des mériozoites de deuxième génération de E. necatrix
   1. Couper l’intestin de poulet longitudinalement, de la tige jaune (au milieu de l’intestin grêle) à l’orifice iléocecal, et le laver avec PBS ou HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution) doucement trois fois dans un plat Petri.
   2. Couper l’intestin en morceaux de 0,5 cm x 0,5 cm et le placer dans un flacon conique avec un tampon de digestion (tableau 1). Placer le flacon sur un batteur magnétique à 37 oC avec une barre de brassage de 30 à 60 min pour libérer les mériozoites. Après 30 min d’incubation, surveillez la libération de merozoites par examen microscopique toutes les 5 min.
2. Purifiez les merozoites par filtration et centrifugation.
   1. Filtrer la suspension contenant des mériozoites digérés à l’aide de quatre couches de gaze¹⁴et de centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min.
   2. Après centrifugation, jetez le supernatant contenant des débris intestinaux. Transférer les précipitations avec des merozoites purifiés dans des tubes de 1,5 ml.
   3. Resuspendre les précipitations avec 1 ml de PBS et compter les mériozoites à l’aide d’un hémocytomètre.

3. Nucléofection de merozoites ou sporozoites

1. Préparation avant la nucléofection des parasites
   1. Préparer environ 10⁷ mériozoites ou sporozoites dans un tube. Si transfétter les merozoites, préparer 3-4 tubes.
   2. Préparer une quantité d’ADN plasmide ou un fragment purifié de PCR qui est supérieur ou égal à 10 g.
      REMARQUE : Le plasmide utilisé dans cette étude contient 2 gènes : protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) et réductase de dihydrofolate de la synthase thymidylate dérivée de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)¹⁵.
   3. Préparer 25 U d’enzyme de restriction. Si les plasmides sont linéimiés, l’enzyme de restriction peut améliorer l’efficacité de la transfection. Si les plasmides sont circulaires, omettez l’enzyme de restriction.
   4. Préparer 85 ll de tampon de nucléofection : mélanger 20 l de tampon de nucléofection I et 1 ml de tampon de nucléofection II, et utiliser une partie de la solution. Le volume de la mémoire tampon totale est de 100 l.
2. Nucléofection
   1. Centrifugelas la suspension de sporozoite ou de merozoite à 600 x g pendant 10 min. Ensuite, jetez le supernatant.
   2. Dans l’ordre suivant, ajouter 85 l l de tampon de transfection nucléaire, 10 g de plasmide (fragment de PCR) et 25 U d’enzyme de restriction (habituellement 5 l) dans le tube de 1,5 mL contenant des sporozoites ou des mériozoites.
   3. Transférer la suspension dans une coupe de transfection nucléaire. Mettre la tasse dans une rainure de transfert nucléaire.
   4. Allumez le dispositif de nucléofection en utilisant le bouton d’alimentation et sélectionnez la procédure de transfection U-033. Si le dispositif de nucléofection démarre en mode Free Program Choice, quittez ce mode en appuyant sur le bouton X.
   5. Lorsque le programme se termine, appuyez sur le bouton X de l’appareil de nucléofection, et l’écran doit afficher OK, indiquant que la nucléofection est réussie.
   6. Ajouter 0,5-1 ml du moyen de l’aigle modifié (DMEM)⁸ de Dulbecco à la tasse de nucléofection pour arrêter la réaction et transférer la suspension à 1,5 ml tube après mélange doux.

4. Inoculation cloacale ou injection intraveineuse

1. Inoculer les parasites nucléifiés en poulets de 7 jours. Inoculer les merozoites de E. necatrix ou les sporozoites de E. tenella par la voie cloacal, mais inoculer E. acervulina sporozoites par injection intraveineuse. Inoculer environ 2 x 10⁷ millions de sporozoites dans chaque poulet, et incoluate merozoites 10⁷ pour chaque oiseau.

5. Propagation et tri FACS

1. Recueillir des ovocytes des excréments 5-9 jours après l’inoculation avec des sporozoites transfectés. Recueillir les oocysts le troisième jour après avoir inoculé avec des mériozoites transfectés.
2. Utilisez le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la pyriméthamine⁸ de 150 mg/kg pour augmenter successivement le rapport de population transgénique.
   REMARQUE : Utilisez de la pyriméthamine en l’ajoutant directement dans l’alimentation. Pour une utilisation plus pratique, préparez de la pyriméthamine soluble dans l’eau. Dissoudre 1 g de pyriméthamine dans 0,2 mL pf H₂SO₄ et 9,8 mL de pyrrolidone N-méthyle (NMP), puis ajouter 1,5 ml de cette solution de stock dans 1 L d’eau potable pour les oiseaux.

6. Purification facultative de colonne

REMARQUE : Si des sporozoites ou des mériozoites plus purs sont nécessaires, il existe une méthode facultative qui les purifie à l’intermédiaire d’une colonne de cellulose diéthylaminoéthyle-52 (DE-52 cellulose).

1. Préparer la colonne de cellulose DE-52 au moins un jour à l’avance.
   1. Préparer le tampon d’élude de glycine (tableau 1). Ajuster le pH du tampon d’élude de glycine de 7,6 à 8,0 et préréchauffer à 41 oC.
   2. Ajouter 2,5 g de cellulose DE-52 à la colonne. Ajouter l’eau et faire tremper toute la nuit. Jetez le supernatant.
   3. Ajouter l’eau et faire tremper pendant 1 h. Jeter le supernatant.
   4. Ajouter 0,1 M NaOH et faire tremper pendant au moins 2 heures. Répétez cette étape.
   5. Remplacer le supernatant par de l’eau. Après que la cellulose se dépose complètement au fond (environ une demi-heure), répétez cette étape.
   6. Jeter le supernatant, ajouter 0,1 M HCl et faire tremper pendant au moins 2 heures. Répétez cette étape.
   7. Jeter le supernatant, et tremper la cellulose deux fois avec la glycine eluent tampon.
   8. Mesurer et ajuster le pH de 7,6 à 8,0 en ajoutant 0,1 M HCl ou 0,1 M NaOH.
      REMARQUE: Dans cette partie, le liquide a au moins 5 fois plus de volume que celui de la cellulose DE-52.
2. Ajuster le débit entre 40-50 r/min.
3. Lorsque la sédimentation de la cellulose est terminée, ajouter la suspension de sporozoite ou de merozoite à la colonne chromatographique. Ajuster le débit à 30-40 r/min.
   REMARQUE : Suspendez les précipitations de sporozoite ou de merozoite avec le tampon d’élude de glycine avant d’ajouter la colonne chromatographique.
4. Recueillir avec un tampon d’élude de glycine dans des tubes de 50 ml. Arrêter la collection selon les résultats de l’examen microscopique des sporozoites ou des mériozoites pendant le processus d’élution.
5. Centrifuger le tampon d’élude de glycine recueilli à 600 x g pendant 10 min. Transférer les précipitations de sporozoite ou de merozoite à de nouveaux tubes de 1,5 ml.
6. Comptez les sporozoites ou les mériozoites à l’aide d’un hémocytomètre.

Résultats

Ce protocole a été utilisé pour transfect parasites eimerian. Dans cette étude, les² meront et merozoites de la deuxième génération d’E. necatrix ont été montrés dans la figure 2A et la figure 2B, tandis que la figure 2C et la figure 2D ont montré les sporocystes et les s...

Discussion

Dans les années 1990, un système de transfection a été développé pour les parasites apicomplexans, et il a été utilisé pour des études sur les parasites eimerian. Récemment, la transfection stable a été menée dans E. tenella^8,9 et E. nieschulzi¹⁵. Nous avons atteint la transfection stable de E. necatrix en transfectant les merozoites de deuxième génération¹¹. L’inoculati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP-disodium	Sigma	A26209
Cellulose DE-52	Solarbio	C8350
Constant Flow Pump	SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.	HL-2B
DMEM	MACGENE	CM15019
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glucose	Sigma	No. V900116
Glycine	Biotopped	G6200
HBSS	MACGENE	CC016
KH2PO4	Sigma	No. V900041
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	DT5-2
Magnetic Mixer	SCILOGEX	MS-H280-Pro
MgCl2	Sigma	449164
MoFlo cell sorter	BeckMan Coulter, US	201309995
NaHCO3	Sigma	144-55-8
Nucleofection device	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
PBS	Solarbio	P1010
Percoll (DG gradient stock solution)	GE Healthcare	17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech Develop.co.	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge), Ltd.	GD120,GM0815010