Une méthode révisée pour induire le lymphœdème secondaire dans le Hindlimb des souris

Résumé

Ce modèle animal permet aux chercheurs d'induire un lymphœdème secondaire statistiquement significatif dans le membre postérieur des souris, d'une durée d'au moins 8 semaines. Le modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie du lymphœdème et pour étudier de nouvelles options de traitement.

Résumé

Les modèles animaux sont d'une importance primordiale dans la recherche sur le lymphœdème afin de comprendre la physiopathologie de la maladie, mais aussi d'explorer les options de traitement potentielles. Ce modèle de souris permet aux chercheurs d'induire un lymphœdème significatif d'une durée d'au moins 8 semaines. Le lymphœdème est induit à l'aide d'une combinaison de radiothérapie fractionnée et d'ablation chirurgicale des lymphatiques. Ce modèle exige que les souris reçoivent une dose de 10 rayonnements gris (Gy) avant et après la chirurgie. La partie chirurgicale du modèle implique la ligature de trois vaisseaux lymphatiques et l'extraction de deux ganglions lymphatiques de l'arrière-pays de la souris. Avoir accès à des outils microchirurgicaux et un microscope est essentiel, en raison des petites structures anatomiques des souris. L'avantage de ce modèle est qu'il se traduit par un lymphœdème statistiquement significatif, qui fournit une bonne base pour évaluer différentes options de traitement. C'est également une option grande et facilement disponible pour la formation microchirurgicale. La limitation de ce modèle est que la procédure peut prendre du temps, surtout si elle n'est pas pratiquée à l'avance. Le modèle donne lieu à un lymphœdème quantifiable objectif chez la souris, sans causer de morbidité sévère et a été testé dans trois projets distincts.

Introduction

Le lymphœdème est caractérisé par une accumulation de liquide lymphatique qui conduit à un gonflement des tissus localisés, qui se produit principalement en raison d'une altération ou perturbé le flux lymphatique dans les vaisseaux lymphatiques¹. Le flux lymphatique peut être altéré ou perturbé par une infection, une obstruction, une blessure ou des malformations congénitales dans le système lymphatique². Ces étiologies ont comme conséquence l'accumulation du fluide lymphatique, qui mène à un état chronique d'inflammation, ayant pour résultat la fibrose suivante, aussi bien que le dépôt du tissu adipeux^3. Le lymphœdème peut être classé comme lymphoedème primaire ou secondaire. Le lymphœdème primaire est causé par des anomalies du développement ou une mutation génétique^2,4. Le lymphœdème secondaire se produit en raison d'une maladie systémique sous-jacente, d'une chirurgie ou^d'untraumatisme²,⁴. Le lymphœdème secondaire est la forme la plus commune de lymphœdème dans le monde². Dans les pays développés, la cause la plus fréquente de lymphœdème secondaire est la thérapie oncologique comme la radiothérapie adjuvante et la dissection des ganglions lymphatiques⁵. Le lymphœdème est plus fréquent chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, mais peut également se développer chez les patients atteints de cancer gynécologique, mélanome, génito-urinaire ou cervical⁶. Il a été suggéré que de toutes les femmes diagnostiquées avec le cancer du sein, 21% développeront le lymphœdème^7.

Le lymphœdème peut être stressant pour le patient à la fois physiquement et psychologiquement. Les patients atteints de lymphœdème ont un risque accru d'infection^5,8,9, mauvaise qualité de vie et peut développer une anxiété sociale et des symptômes de dépression¹⁰. Les complications du lymphœdème chronique conduisent au coût élevé des soins et à une charge accrue de la maladie^9,11. Les résultats ont également suggéré que le lymphœdème pourrait être associé à un risque accru de décès après le traitement du cancer du sein¹². La gestion conservatrice telle que la compression de la zone affectée, le drainage lymphatique manuel et les soins de la peau généraux demeurent l'approche de première ligne. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif⁶. Bien que des progrès aient été réalisés dans le domaine de la thérapie chirurgicale et médicale, il y a encore place à l'amélioration. Plus de recherche, fournissant la perspicacité dans la pathophysiologie et la progression de la maladie, est nécessaire pour permettre aux cliniciens de fournir de meilleures options de traitement pour les patients^5.

Des modèles animaux sont utilisés dans la recherche préclinique pour comprendre la physiopathologie des maladies et développer des options de traitement potentielles. Plusieurs modèles animaux de lymphœdème différents ont été établis chez les canines^13,14, lapins¹⁵, moutons¹⁶, porcs^17,18 et les rongeurs^{19,20, 21,22,23,24}. Le modèle de rongeur semble être le modèle le plus rentable, lors de l'étude de la reconstruction de la fonction lymphatique, en raison des rongeurs étant facilement accessibles et relativement peu coûteux²⁵. La majorité des modèles de souris se sont concentrés sur induire le lymphœdème dans la queue des souris^21,22,23. Le modèle de queue est très fiable mais la technique chirurgicale exacte pour induire le lymphœdème varie considérablement dans le matériel publié précédemment. Ceci a comme conséquence des fluctuations dans la durée et la robustesse du lymphœdème développé présenté dans la litière connue^25. Différentes techniques sont également utilisées pour induire le lymphœdème dans le modèle de l'arrière-pays et elles donnent également des résultats variables, mais le modèle de membre postérieur pourrait être plus facile à comprendre d'un point de vue translationnel. Les modèles précédents de lymphœdème ont été entravés par la résolution spontanée de lymphœdème et donc un modèle reproductible et permanent de lymphœdème est nécessaire^25. Les chercheurs ont déjà essayé d'augmenter la dose de rayonnement, pour empêcher la résolution spontanée de lymphœdème, mais ceci a souvent mené à la morbidité grave suivante^25.

Ce modèle a comme conséquence le lymphœdème statistiquement significatif, sans causer la morbidité grave, en combinant la microchirurgie avec la radiothérapie. Le modèle a été révisé à partir d'un modèle chirurgical précédent en ajoutant une dose d'irradiation qui induit le lymphœdème, sans causer de morbidité sévère²⁶. Il offre également une excellente occasion pour la formation en microchirurgie. L'accès à l'équipement microchirurgical et au microscope est nécessaire, en raison des petites structures anatomiques des souris. L'intervention chirurgicale peut être effectuée lorsque l'utilisateur a appris des techniques microchirurgicales de base, telles que la suture avec des instruments microchirurgicaux. Les opérateurs qui ont effectué cette procédure ont tous regardé des vidéos didacticiels d'Acland sur les conditions préalables des compétences microchirurgicales (1981) et de la technique de base de la microsuture (1985). Nous recommandons de pratiquer l'intervention chirurgicale 8 à 10 fois avant de l'utiliser dans la recherche. La pratique de la procédure garantit que moins d'erreurs sont commises et que la procédure peut être effectuée plus efficacement. Une fois maîtrisée, l'intervention chirurgicale peut être effectuée en 45 minutes.

Protocole

Les animaux étaient hébergés dans l'établissement de soins aux animaux de l'Université du Danemark méridional, conformément aux lignes directrices de l'établissement. Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l'Inspection des expériences animales, ministère de l'Environnement et de l'Alimentation du Danemark.

1. Irradiation pré-chirurgicale

REMARQUE : L'irradiation préchirurgicale a lieu 7 jours avant la chirurgie.

1. Induire l'anesthésie.
   1. Placez la souris dans une boîte à induction et placez le vaporisateur à 3 % d'isoflurane avec un débit d'oxygène de 0,8 à 1,2 L/min pour induire l'anesthésie par inhalation.
      REMARQUE : Alternativement, les anesthésiques injectables peuvent être employés mais pour la courte durée de l'anesthésie inhalante induisant l'irradiation était suffisant. Pour obtenir les résultats présentés dans cet article, des souris c57BL6 femelles de 9 semaines ont été employées.
   2. Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée par le test de pincement de la queue ou de la patte.
2. Placez la souris pour l'irradiation.
   1. S'il est entièrement sous sédatif, déplacez la souris de la boîte d'induction et placez-la sous la source de rayonnement en position de supine et fixez doucement les membres postérieurs avec du ruban adhésif.
      REMARQUE : La souris restera sous sédation pendant la courte durée du rayonnement.
   2. Placez un coussin de plomb de 1,5 mm d'épaisseur pour s'assurer que seule la zone qui subit une intervention chirurgicale (c.-à-d. la zone circulaire d'un diamètre de 25 mm autour du genou) est irradiée.
3. Administrer une dose de 10 rayonnementgy à un taux de dose de 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
   CAUTION : Des précautions de sécurité doivent être prises lorsque vous travaillez avec des radiations. Au cours de cette expérience, toute l'irradiation a été effectuée dans une pièce isolée par rayonnement, et la source de rayonnement n'a été activée que lorsque tout le personnel est parti et scellé la pièce.
4. Placez la souris dans sa cage.

2. Configuration de l'équipement

REMARQUE : La chirurgie doit être effectuée dans une pièce dédiée aux interventions chirurgicales. La surface opératoire doit être stérile.

1. Nettoyez soigneusement toutes les surfaces opératoires avec 70% d'éthanol. Portez un filet à cheveux et une combinaison. Utilisez des instruments chirurgicaux stériles et des gants stériles.
2. Préparer l'anesthésie.
   1. Rédiger 1 ml de fentanyl (0,315 mg/ml), 1 ml de midazolam (5 mg/ml) et 2 ml d'eau stérile. Utilisez différentes seringues et aiguilles pour les différents composants.
   2. Mélanger le fentanyl et l'eau stérile en vidant lentement les seringues dans un tube de verre stérile. Lorsqu'il est mélangé, ajouter du midazolam pour compléter la solution de travail.
3. Préparer l'analgésie.
   1. Rédiger 0,2 ml de buprénorphine (0,3 mg/ml) et 2 ml de salin.
   2. Mélanger les volumes en vidant lentement les seringues dans un tube de verre stérile pour compléter la solution de travail.
4. Allumez le microscope et assurez-vous que l'éclairage est suffisant, et que le microscope est bien ajusté pour les yeux de l'opérateur.
   REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées au microscope opératoire. Une plage de grossissement de 4x à 25x est suffisante.

3. Préparation

1. Peser la souris pré-chirurgie en plaçant la souris dans un récipient vide sur une balance dégagée.
2. Administrer l'anesthésique.
   1. Rédiger 0,1 ml d'anesthésique pour 10 g de poids corporel de souris. Injecter l'anesthésique sous-cutanée sous forme d'injection de bolus.
   2. Laissez la souris reposer dans une cage avec beaucoup de literie et d'abri pendant environ 10 min jusqu'à ce qu'elle soit entièrement sous sédatif. Examiner la profondeur anesthésique en évaluant la relaxation musculaire et effectuer le test de pincement des pattes ou de la queue.
3. Lorsqu'il est entièrement sous sédatif, raser le membre postérieur choisi pour la procédure à l'aide de tondeuses électriques. Assurez-vous d'essuyer l'excès de cheveux.
4. Allumez le dispositif de chauffage, comme un coussin chauffant et recouvrez-le d'un chiffon chirurgical.
5. Fixez le flux d'oxygène à 0,8 L/min et connectez-le avec un cône de nez. Utilisez 100% d'oxygène.
   REMARQUE: Le cône nasal est uniquement pour la livraison d'oxygène et non l'anesthésie.
6. Appliquer l'onmonténégrmonmique et injecter 0,5 mL de saline sous-cutanée, de préférence dans les éraflures de la souris, pour prévenir l'hypovolémie pendant la chirurgie.
7. Placez la souris pour la chirurgie.
   1. Placez la souris sur le tissu chirurgical en position de supine. Placer le cône de nez sur le museau.
   2. Fixer doucement l'extrémité des membres postérieurs avec du ruban adhésif pour empêcher la souris de se déplacer pendant la chirurgie.
   3. Stériliser la peau à l'aide d'alcool/chlorhexidine ou d'iode d'alcool/povidone.

4. Chirurgie

REMARQUE : Dans cet exemple, le membre arrière gauche (lorsque la souris est vue en position de supine) a été choisi pour la procédure.

1. Faire une incision circulaire.
   1. Soulevez la peau avec des forceps lisses et clip une petite ouverture d'environ 5 mm proximale à la fossa popliteal.
   2. Glissez des ciseaux pointus dans l'ouverture et clip vers le genou de sorte que l'incision se termine juste au-dessus du genou. Assurez-vous de ne pas percer les vaisseaux sous-jacents en soulevant la peau avec des forceps pendant la coupure.
   3. Déplacez la souris en position couchée et continuez à couper du genou vers la fossa popliteal jusqu'à ce que l'incision circonférence soit terminée.
2. Disséquer la peau sous le genou.
   1. Disséquer doucement la zone sous le genou à quelques millimètres au-dessus de la cheville, en ouvrant lentement et en fermant les microscissors tout en soulevant la peau avec des forceps.
   2. Couper soigneusement les adhérences visibles restantes à l'aide de microcise. Utilisez saline stérile régulièrement pour garder le tissu humide pendant toute la procédure.
3. Disséquer la peau au bord proximal de l'incision circonférence afin qu'elle puisse être rétractée avec un rétracteur élastique.
   REMARQUE : Le rétracteur permet à l'opérateur une meilleure vue du vaisseau lymphatique proximal et empêche la jante proximale de se déplacer pendant la chirurgie.
4. Bien qu'il soit encore en position couchée, faites pivoter doucement l'arrière et fixez-le avec du ruban adhésif, de sorte que la veine ischiatique soit visible du point le plus proximal de la zone exposée au point le plus distal.
5. Injecter environ 0,01 ml de brevet Bleu V sous-cutané entre le deuxième et le troisième orteil à l'aide d'une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de 30 G. Appuyez doucement sur la patte une couple de fois pour distribuer le brevet Bleu V. Visualisez les vaisseaux lymphatiques et les ganglions lymphatiques à travers le microscope pendant que le brevet Bleu V remplit les vaisseaux lymphatiques.
   REMARQUE : Si la couleur bleue des vaisseaux lymphatiques s'estompe au cours de la procédure, massez doucement la patte pour favoriser l'utilisation, plutôt que d'injecter plus de brevet Bleu V. L'utilisation excessive du brevet Blue V peut mener à la fuite et à la coloration du tissu entourant les vaisseaux lymphatiques qui peuvent compromettre la procédure.
6. Localiser les structures importantes: le ganglion lymphatique popliteal (PLN), les deux vaisseaux lymphatiques distal au ganglion lymphatique (DLV1 et DLV2), et le seul vaisseau lymphatique proximal au ganglion lymphatique (PLV).
   REMARQUE : Tous les vaisseaux lymphatiques peuvent être trouvés à côté de la veine ischiatique. Le vaisseau lymphatique proximal est habituellement trouvé médial à la veine, les deux vaisseaux lymphatiques distal sont trouvés médial et latéral à la veine. Les abréviations des structures sont utilisées dans la vidéo d'accompagnement.
7. Magnifiez pour visualiser clairement le PLV et le ligate avec une suture en nylon 10-0 utilisant le support de micro-aiguille et les microforceps. Appuyez sur la patte une couple de fois pour s'assurer qu'aucun brevet Bleu V passe proximal à la suture.
   REMARQUE : Il peut être nécessaire de couper la graisse entourant le vaisseau lymphatique.
8. Répétez l'étape 4.7 pour liguer les deux vaisseaux lymphatiques distal. Appuyez plusieurs fois sur la patte pour s'assurer qu'aucun brevet Bleu V ne passe proximal à la ligature. Si les vaisseaux lymphatiques se trouvent à proximité de la veine ischiatique, essayez de disséquer encore plus disder.
   REMARQUE: Dans cet exemple, on peut voir que l'un des vaisseaux lymphatiques éclate en raison de la ligature entraver le flux lymphatique. Les vaisseaux lymphatiques se fendront souvent de la veine plus bas.
9. Enlever le ganglion lymphatique popliteal.
   1. Localisez le ganglion lymphatique popliteal et clip un petit trou avec des microscissors pour y accéder et retirez-le avec des microforceps et des microscissors.
      REMARQUE : Le ganglion lymphatique a une surface douce de perle-comme en contraste avec le tissu adipeux environnant.
   2. Pour vérifier si le tissu enlevé est un ganglion lymphatique, placez-le dans un tube à essai rempli d'eau.
      REMARQUE : Si le tissu est composé de graisse, le tissu flottera. Si le tissu est un ganglion lymphatique, il coulera au fond.
10. Enlever le tampon de graisse inguinal et le ganglion lymphatique.
    1. Avant d'enlever le coussinet de graisse inguinal, utilisez un coagulateur bipolaire pour cautériser les vaisseaux qui traversent la graisse.
    2. Reséquez le tampon de graisse inguinal à l'aide de microforceps et de microscissors. Couper doucement les vaisseaux cautérisés qui traversent la graisse. Puis reséquez doucement le tissu adipeux dans la zone inguinale.
       REMARQUE: Le ganglion lymphatique situé dans la graisse est rarement coloré par Patent Blue V et peut être difficile à différencier de la graisse. L'élimination du tampon adipeux en une seule pièce est la meilleure façon de s'assurer que le ganglion lymphatique a été enlevé.
11. Rincer soigneusement la jambe avec saline stérile et confirmer au microscope que les petits poils et particules ont été complètement retirés de la zone chirurgicale pour éviter la contamination des plaies et l'infection. Assurez-vous qu'il n'y a pas de saignement actif.
12. Suturer les bords de la peau vers le bas à la facia musculaire avec une suture en nylon 6-0 à l'aide de forceps et porte-aiguilles, laissant un espace de 2 à 3 mm pour limiter le flux lymphatique superficiel.
    REMARQUE : La vidéo d'accompagnement montre un exemple de sutures finies.
13. Administrer l'analgésie. Rédiger 0,1 ml d'analgésie par 30 g de poids corporel de souris. Injecter l'analgésie sous-cutanée comme une injection de bolus.
14. Peser la souris pour la post-chirurgie pour la comparaison.
15. Placer la souris dans une cage dans une armoire chauffée pour la récupération.

5. Soins postopératoires

1. Donnez aux souris des cages individuelles pour récupérer après la chirurgie avec de l'eau et de la nourriture ad libitum.
2. Administrer une dose sous-cutanée bolus de 0,02 ml de buprénorphine 3x par jour pendant 3 jours pour l'analgésie.
3. Surveillez l'animal tous les jours pour la cicatrisation appropriée des plaies, les signes de douleur et d'infection. Si des signes d'infection sont présents, utilisez de l'onguent antibiotique.

6. Irradiation post-chirurgicale

1. Trois jours après la chirurgie, répétez la procédure d'irradiation pré-chirurgicale (étapes 1.1-1.4).

Résultats

Cette procédure a déjà été utilisée dans trois expériences distinctes. Toutes les expériences ont été faites par différents chercheurs principaux qui sont tous co-auteurs de cet article. Dans les trois expériences, un grand soin a été pris pour adhérer à la même procédure que décrite dans ce protocole. Dans chacun des trois expériences, le lymphœdème secondaire a été induit dans un membre postérieur tandis que l'autre membre postérieur a servi de contrôle. Les v...

Discussion

Il y a quelques étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, il est important que les chercheurs prennent des précautions de sécurité lorsqu'ils travaillent avec la radioactivité. Deuxièmement, pendant la partie chirurgicale de ce protocole, il est important de commencer la procédure une fois que la souris a été anesthésié et le terminer sans pauses inutiles. Ceci est important pour éviter une période chirurgicale excessivement longue pour l'animal et pour éviter que l'anesthésie perde l'effet pendant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture - Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator - ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer - PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder - Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 mg/ml	Guerbet
Scissors - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation - D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment - viscotears	Bausch & Lomb