JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour tester l’efficacité des thérapies ciblées sélectionnées basées sur la composition génomique d’une tumeur. Le protocole décrit l’identification et la validation des réarrangements structurels d’ADN, l’engraftment des tumeurs des patients dans les souris et les réponses d’essai aux drogues correspondantes.

Résumé

Nous présentons ici une approche intégrative pour tester l’efficacité des thérapies ciblées qui combine la prochaine génération de séquençage technolo-gies, des analyses thérapeutiques de cible et la surveillance de la réponse médicamenteuse à l’aide de xénogreffes dérivées par le patient (PDX). Cette stratégie a été validée en utilisant des tumeurs ovariennes comme exemple. Le protocole de séquençage de la prochaine génération (MPseq) de la paire de partenaires a été utilisé pour identifier les altérations structurelles et suivi d’une analyse des altérations potentiellement ciblées. Les tumeurs humaines cultivées chez des souris immunocompromisées ont été traitées avec des médicaments sélectionnés sur la base des analyses génomiques. Les résultats ont démontré une bonne corrélation entre les réponses prévues et les réponses observées dans le modèle PDX. L’approche présentée peut être utilisée pour tester l’efficacité des traitements combinés et faciliter le traitement personnalisé pour les patients atteints d’un cancer récurrent, en particulier dans les cas où la thérapie standard échoue et il est nécessaire d’utiliser des médicaments hors étiquette.

Introduction

Les xénogreffes dérivées par le patient (PDX), qui sont générées par l’implantation de morceaux de tumeur de patient dans des souris immunodéficientes, ont émergé comme modèle préclinique puissant pour aider les soins anticancéreux personnalisés. Les modèles de PDX ont été développés avec succès pour une variété de malignités humaines. Il s’agit notamment des cancers du sein et de l’ovaire, du mélanome malin, du cancer colorectal, de l’adénocarcinome pancréatique et du cancer du poumon non à petites cellules1,,2,3,,4,5. Le tissu tumoral peut être implanté orthotopiquement ou hétérotopiquement. Le premier, considéré comme plus précis mais techniquement difficile, implique la transplantation directement dans l’organe d’origine tumorale. Ces types de modèles sont censés imiter précisément l’histologie de la tumeur d’origine en raison de la microenvironnement « ature » pour la tumeur6,7. Par exemple, la transplantation orthotopique dans la bourse de l’ovaire de souris a eu comme conséquence la diffusion de tumeur dans la cavité péritonéale et la production d’ascites, typique du cancer ovarien8. De même, l’injection de tumeurs mammaires dans le thoracique au lieu de la glande mammaire abdominale a affecté le taux de succès pdx et le comportement9. Cependant, les modèles orthotopiques nécessitent des systèmes d’imagerie sophistiqués pour surveiller la croissance tumorale. L’implantation hétérotopique de la tumeur solide est généralement effectuée en implantant le tissu dans le flanc sous-cutané d’une souris qui permet une surveillance plus facile de la croissance tumorale et est moins coûteux et chronophage7. Cependant, les tumeurs se sont développées sous-cutanéement rarement métastaser contrairement à ce qu’on observe dans le cas de l’implantation orthotopique10.

Le taux de réussite de l’engraftment a été montré pour varier et dépendent considérablement du type de tumeur. Des tumeurs plus agressives et des spécimens de tissus contenant un pourcentage plus élevé de cellules tumorales ont été signalés pour avoir de meilleurs taux de succès12,13. Compatible avec cela, les tumeurs dérivées de sites métastatiques ont été montrés à l’engraft à des fréquences de 50-80%, tandis que ceux des sites primaires engraft à des fréquences aussi basses que 14%12. En revanche, le tissu contenant des cellules nécrotiques et moins de cellules tumorales viables engraft mal. La croissance tumorale peut également être favorisée par l’ajout de protéines de matrice de membrane de sous-sol dans le mélange de tissu au moment de l’injection dans les souris14 sans compromettre les propriétés de la tumeur originale. La taille et le nombre de morceaux de tissu destinés à l’implantation se sont également avérés pour affecter le taux de succès de l’engraftment. Des taux de prise de tumeur plus élevés ont été rapportés pour l’implantation dans la capsule sub-rénale comparée à l’implantation sous-cutanée due à la capacité de la capsule sub-rénale de maintenir le stroma de tumeur original et de fournir les cellules stromales d’hôte aussi bien15.

La plupart des études utilisent des souris immunodéficientes NOD/SCID, qui manquent de cellules tueuses naturelles16 et ont été montrés pour augmenter l’engreftment de tumeur, la croissance et la métastase par rapport à d’autres souches14. Cependant, une surveillance supplémentaire est nécessaire car ils peuvent développer des lymphomes thymiques dès 3-4 mois del’âge 13. Dans les greffes de tumeur ovarienne cultivées chez les souris SCID, l’excroissance des cellules B a été avec succès inhibée par le rituximab, empêchant le développement des lymphomes mais sans impact sur l’engreffement des tumeurs ovariennes17.

Plus récemment, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) souris, portant une mutation nulle dans le gène codant la chaîne gamma récepteur interleukine 218, est devenu une souche fréquemment utilisée pour la génération de modèles PDX. Les tumeurs des modèles PDX établis passés aux générations futures de souris sont rapportées pour maintenir des propriétés histologiques et moléculaires pour 3 à 6 générations19,20. De nombreuses études ont montré que les résultats du traitement dans les modèles PDX imitent ceux de leurs patients correspondants2,3,4,21,22,23. Le taux de réponse à la chimiothérapie dans les modèles PDX pour le cancer du poumon non-petit et les carcinomes colorectal était similaire à celui des essais cliniques pour les mêmes médicaments24,25. Des études menées dans des modèles PDX, développés pour les patients inscrits dans des essais cliniques, ont démontré des réponses à des médicaments testés similaires à ceux observés cliniquement chez les patientscorrespondants 2,3,4.

Les analyses génomiques à haut débit d’une tumeur patiente en conjonction avec des modèles PDX fournissent un outil puissant pour étudier les corrélations entre des altérations génomiques spécifiques et une réponse thérapeutique. Ceux-ci ont été décrits dans quelques publications26,27. Par exemple, les réponses thérapeutiques à l’inhibiteur egfr cétuximab dans un ensemble de modèles de PDX colorectal portant l’amplification EGFR, les réponses cliniques parallèles au cétuximab dans les patients28.

Il y a quelques défis associés au développement et à l’application des modèles PDX. Parmi ceux-ci est l’hétérogénéité de tumeur29,30 qui peut compromettre l’exactitude de l’interprétation de réponse de traitement comme un clone de cellule simple avec une capacité proliférative plus élevée dans un PDX peut dépasser les autres31, ayant ainsi pour résultat une perte d’hétérogénéité. En outre, lorsque des biopsies de tumeur simple sont employées pour développer PDX, certaines des populations de cellules peuvent être manquées et ne seront pas représentées dans la greffe finale. Plusieurs échantillons de la même tumeur sont recommandés pour l’implantation pour résoudre ce problème. Bien que les tumeurs PDX tendent à contenir tous les types cellulaires de la tumeur originale du donneur, ces cellules sont progressivement substituées par ceux d’origine murine3. L’interaction entre le stroma murine et les cellules tumorales humaines dans les modèles PDX n’est pas bien comprise. Néanmoins, les cellules stromales ont été montrées pour récapituler le microenvironnement de tumeur33.

Malgré ces limitations, les modèles PDX demeurent parmi les outils les plus précieux pour la recherche translationnelle ainsi que la médecine personnalisée pour la sélection des thérapies pour les patients. Les principales applications des PDX comprennent la découverte de biomarqueurs et le dépistage des drogues. Les modèles PDX sont également utilisés avec succès pour étudier les mécanismes de résistance aux médicaments et identifier des stratégies pour surmonter la résistance aux médicaments34,35. L’approche décrite dans le présent manuscrit permet au chercheur d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans les tumeurs humaines et d’évaluer l’efficacité des médicaments correspondants in vivo, chez les souris hébergeant des tumeurs engraftées qui ont été initialement caractérisées par la génomique. Le protocole utilise des tumeurs ovariennes engraftées intrapéritoneally mais s’applique à n’importe quel type de tumeur suffisamment agressive pour se développer chez les souris2,3,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Les tissus frais des patients consentants présentant le cancer de l’ovaire ont été recueillis au moment de la chirurgie de débulking selon un protocole approuvé par Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Toutes les procédures et traitements animaux utilisés dans ce protocole ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Clinique Mayo (IACUC) et ont suivi les lignes directrices sur les soins aux animaux.

1. Séquençage et analyses de paires de mates

REMARQUE : Les tissus congelés frais ou flash doivent être utilisés pour le séquençage de la paire de mates (MPseq). Le matériau incorporé de paraffine n’est pas approprié parce qu’il contient de l’ADN fragmenté.

  1. Isoler l’ADN du tissu tumoral congelé. Utiliser un spécimen humain original obtenu à partir de matériel chirurgical ou biopsie36.
  2. Utilisez 1000 ng d’ADN pour faire des bibliothèques MPseq et séquencer comme 2 échantillons par voie sur le séquenceur de prochaine génération (voir tableau des matériaux)36.
  3. Analyser les données à l’aide d’un ensemble d’algorithmes pour détecter les grandes aberrations chromosomiques (suppressions, insertions, amplifications, inversions et translocations) comme décrit précédemment36,37.

2. Sélection de cibles thérapeutiques

  1. Utilisez l’outil Panda en libre accès (Pathway et Annotation) ou un outil analogue pour identifier les modifications cibles (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
    1. Dressez une liste des gènes identifiés par MSeq comme modifiés, comme un simple fichier délimité par onglet, à l’aide de symboles génétiques acceptés standard.
      REMARQUE : L’exemple inclus comporte l’analyse des amplifications et des gains.
    2. Ajoutez un signe « » à la ligne d’en-tête de la liste pour vous assurer que l’en-tête de la table est transféré à la vue niveau de la voie du logiciel.
    3. Téléchargez le fichier en cliquant sur l’onglet De navigation Télécharger le jeu d’annotation.
    4. Affectez une seule icône dans le menu pour représenter les données sous-jacentes en cliquant sur l’icône de choix, puis en cliquant sur l’onglet Finaliser.
    5. Une fois les fichiers d’annotation téléchargés, identifiez une colonne qui affiche le nombre de gènes annotés par voie. C’est la dernière colonne à droite.
    6. Utilisez pathway filter sur la partie supérieure gauche de la fenêtre principale pour afficher des voies contenant des gènes d’intérêt.
    7. Identifier les voies qui ont plus de gènes annotés que ce à quoi on s’attend par hasard. Utilisez la fonction située sous l’onglet Enrichissement.
    8. Sélectionnez une base de données pour afficher des gènes potentiellement druggables à partir de l’annotation prédéfinie en vérifiant une icône appropriée à gauche de la fenêtre principale (p. ex., DGIdb, PharmGKB).
    9. Sélectionnez la voie de visualisation en cliquant sur son nom affiché dans la page Observateur de sentiers.
      REMARQUE : Les icônes représentant chaque ensemble d’annotation s’affichent à côté du gène associé. Cliquez sur le gène d’intérêt pour ouvrir la page Web GeneCards correspondante.
    10. Sélectionnez les voies qui ont montré les gènes annotés d’intérêt (c.-à-d. modifiés dans une tumeur donnée) et « a » pour les médicaments potentiels pour une analyse plus approfondie.
  2. Utiliser une base de données contenant des médicaments approuvés pour l’application clinique (https://clinicaltrials.gov/) pour recouper les cibles identifiées.
  3. Prioriser les altérations ciblées pour d’autres tests dans les modèles PDX en effectuant une revue de littérature (par exemple, PubMed) pour confirmer la pertinence à la biologie d’un type particulier de tumeur.

3. Validation des réarrangements génomiques par le séquençage PCR et Sanger

  1. Concevoir des amorces à l’aide de lectures de séquençage obtenues à partir des données MPseq.
    1. Choisissez une jonction d’intérêt pour la validation (c.-à-d. la cible thérapeutique potentielle) basée sur les analyses MPseq.
    2. Concevoir des amorces directionnellement de telle sorte que l’amplicon contient la jonction. Concevoir 2 amorces de chaque côté de la jonction, pour un total de 4, pour augmenter les chances d’amplifier la jonction.
      REMARQUE : Amorces de nom selon l’emplacement du cas et du chromosome.
    3. Utilisez des paramètres PCR standard pour la conception de l’amorce et un logiciel de choix. Sélectionnez la température de fusion (60-62 °C) et la teneur en GC (40-60%). Assurez-vous que la séquence d’amorce ne forme pas de dimers, de palindromes ou de boucles d’épingle à cheveux.
    4. Confirmez que la séquence d’amorce manque d’homologie à d’autres zones du génome humain en la vérifiant à l’aide de BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
  2. Exécutez un PCR pour amplifier la jonction d’intérêt.
    1. Diluer les amorces avec de l’eau à 10 mM et combiner 10 mL de chaque amorce de sorte que chaque amorce avant soit jumelée à chaque amorce inversée dans un mélange d’amorce.
      REMARQUE : Les séquences des amorces de l’exemple sélectionné sont affichées dans le tableau 1.
    2. Étiqueter les tubes à bande de 0,2 mL comme : C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 et T4 où c=contrôle l’ADN génomique humain (commercial), l’ADN tumoral, isolé de la tumeur du patient ou de PDX, et le nombre indique le mélange d’amorce.
    3. Ajouter 1 mL de chaque mélange d’amorces dans ses tubes étiquetés.
    4. Préparer le mastermix Taq en combinant les réactifs énumérés au tableau 2, en laissant l’enzyme dans le congélateur jusqu’à ce que nécessaire, en l’ajoutant au mélange à la toute fin.
    5. Faire 2 mélanges principaux, un pour chaque modèle d’ADN, contrôler l’ADN humain et l’ADN tumoral. Ajouter 24 ml de chaque mélange maître Taq à son tube à bande respectif. Le volume total de réaction est de 25 mL. Vortex très brièvement, puis faire tourner le tube de bande vers le bas.
    6. Exécutez un PCR dans un thermocycleur. Utilisez les paramètres indiqués dans le tableau 3. Ajuster la température d’anneaux de sorte qu’elle soit au moins 1 °C plus froide que la température de fusion des amorces.
    7. Conserver le produit PCR terminé à -20 °C (à long terme) ou réfrigéré à 4 °C (à court terme) jusqu’à ce que nécessaire.
    8. Effectuez une électrophorèse à 1-5 V/cm pour visualiser le produit PCR à l’aide d’un gel agarose de 1,5 %. Laissez 2 mL aliquot du produit à utiliser pour le séquençage Sanger.
  3. Effectuez le séquençage sanger pour confirmer la jonction et identifier le point d’arrêt exact38.
    1. Utilisez le produit PCR si le PCR a généré un seul produit (bande). Sinon, couper la bande de gel, purifier et soumettre pour le séquençage Sanger avec l’amorce utilisée pour l’amplification.
      NOTE : Les tumeurs pour lesquelles des analyses génomiques ont été exécutées alors sont employées pour l’implantation chez la souris.

4. Engreffement et entretien des tumeurs

  1. Mettre en place des préparations pour engrafer les tumeurs dans les modèles de souris PDX. Sélectionnez pour les tumeurs d’engraftment pour lesquelles des analyses génomiques seront ou ont été effectuées.
    1. Assurez-vous qu’une infrastructure de soutien est en place au moment du début de l’élaboration de tous les modèles PDX, y compris des laboratoires et des installations pour animaux dédiés, du personnel technique qualifié et des procédures d’exploitation normalisées détaillées.
    2. Assurer le transport rapide et le traitement des spécimens car la vitesse est cruciale pour la viabilité cellulaire et l’engreffement réussi.
    3. Utilisez un environnement stérile pour réduire la contamination bactérienne et fongique des spécimens de traitement et d’engrafting.
    4. Manipuler les spécimens humains avec prudence, conformément aux politiques institutionnelles concernant les matériaux potentiellement biorisqueux, car ils peuvent abriter des agents pathogènes transmis par le sang.
    5. Préparer le tissu (0,5-0,7 cm3 en taille) pour l’engraftment en mettant le spécimen chirurgical dans un tube pré-réfrigéré de 50 ml avec 20 ml de milieux de culture tissulaire.
      NOTE : Le tissu de tumeur peut être frais ou récupéré du matériel précédemment cryopreserved5.
    6. Confirmer le contenu de la tumeur dans le spécimen en consultant un pathologiste.
    7. Placez le tissu tumoral dans un plat contenant 10-15 mL de PBS froid, ou des milieux de culture tissulaire tels que RPMI 1640 ou DMEM contenant des antibiotiques (1% de pénicilline et de streptomycine).
    8. Identifier et isoler le matériel de tumeur viable du tissu normal et nécrotique adjacent avec l’aide d’un pathologiste. Utilisez des forceps stériles et du scalpel pour enlever le matériel nécrotique souligné par un pathologiste.
      NOTE : La tumeur peut être implantée intraperitoneally ou sous-cutanéement dans les souris. Suivez l’étape 4.2 pour effectuer une implantation intrapéritonéale ou passez à l’étape 4.3 pour effectuer une engreffement sous-cutanée. Dans cette étude, des thérapies ciblées sélectionnées sur la base d’analyses génomiques ont été testées dans une série de modèles PDX pour le cancer de l’ovaire sérous de haut grade avec l’implantation intrapéritonéale.
  2. Préparer le tissu pour l’implantation intrapéritoneal (IP) hacher le tissu avec des forceps stériles et un scalpel sur la glace pour faire des morceaux d’environ 1-1,5 mm3 en taille et le mélange avec milieu de culture froide. Injecter 0,3 à 0,5 mL de lisier tumoral à l’aide d’une aiguille de calibre 16-17.
    REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales sont effectuées en utilisant des techniques aseptiques. Des gants stériles, des instruments stériles, des fournitures et des matériaux implantés ont été utilisés pour réduire la probabilité d’infection.
    1. Mélanger les morceaux 1:1 avec le milieu de culture de glace-froid et injecter 100 mL intrapéritoneally dans au moins trois souris femelles SCID.
  3. Couper le tissu tumoral pour l’engrafage sous-cutané à l’aide de forceps stériles, de scalpel ou de ciseaux chirurgicaux en petits fragments, d’environ 2 x 2 mm de taille, et transférer les tissus fragmentés dans une boîte de Pétri pré-réfrigérée sur la glace.
    1. Ajouter la matrice de membrane froide du sous-sol dans le plat avec le tissu fragmenté (environ 200 mL pour 10 morceaux de tissu), bien mélanger, et laisser les fragments de tissu tremper dans la matrice de membrane du sous-sol froid pendant 10 min.
    2. Anesthétiser 5 souris femelles NOD/SCID pour les préparer à l’engreffement.
    3. Injectez chaque souris intrapéritoneally avec la kétamine (150 mg/kg) et la xylazine (10 mg/kg) combinaison.
    4. Confirmez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant la pointe de la queue avec des forceps atraumatiques.
    5. Retirez doucement entièrement la souris anesthésiée de la chambre et mettez sur la souris un cône de nez qui a l’entrée du vaporisateur et de la sortie du système de récupération de gaz de déchets.
    6. Mettez l’onguent vétérinaire sur les yeux de souris pour empêcher la sécheresse pendant que sous anesthésie. Préparer la zone où la chirurgie sera effectuée. Utilisez la technique aseptique pour effectuer la chirurgie.
    7. Assurez-vous que la surface sur laquelle la chirurgie va prendre est non poreuse, scellée et désinfectée avant la chirurgie.
    8. Commencez la chirurgie avec des instruments stériles (par autoclave, gaz ou stérilisation chimique).
    9. Utilisez des gants pour manipuler les instruments et maintenir la stérilité des pointes de l’instrument tout au long de la procédure en les submergeant dans l’éthanol entre les étapes de la chirurgie.
  4. Stériliser le site chirurgical en appliquant 3 gommages alternatifs d’iode et d’alcool. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles et des forceps pour faire une incision verticale de 5-10 mm sur les deux flancs d’une souris.
    1. Insérez doucement des forceps droits dans l’espace sous-cutanous pour créer une poche suffisamment grande pour qu’un fragment de tumeur soit placé sous le tampon de graisse.
    2. Utilisez les forceps droits stériles pour insérer des fragments de tumeur dans la poche préalablement préparée dans chacune des 5 souris.
      REMARQUE : Placez 3-4 morceaux de tissu tumoral dans une poche.
    3. Fermez les incisions cutanées à l’aide de colle tissulaire.
    4. Intraperitone injecter chaque souris avec 100 mL de Rituximab après l’implantation pour inhiber la prolifération des lymphocytes.
  5. Placez la souris dans une cage sous une lampe thermique pendant environ 20 min jusqu’à ce qu’elle soit récupérée de l’anesthésie. Surveillez les signes vitaux de la souris et assurez-vous d’une hydratation suffisante.
  6. Retournez la souris à la compagnie d’autres souris après qu’elle ait récupéré de l’anesthésie et ait commencé à avoir de la nourriture et de l’eau. Fournir des soins postopératoires et un suivi conformément aux lignes directrices institutionnelles. Vérifiez les signes de douleur et de détresse tous les jours pendant 3 jours consécutifs après la chirurgie.
    REMARQUE : Les critères de douleur ou de détresse comprennent la nécrose ou l’ulcération, la perte de poids/notation de l’état du corps, les signes comportementaux tels que le niveau d’activité, la fonction motrice et la posture.
  7. Vérifiez régulièrement les souris pour la formation de tumeur bi-hebdomadaire jusqu’à ce que les tumeurs atteignent la taille de 0.5 cm de diamètre tel que mesuré par un étrier.
  8. Évaluer le score de santé de chaque souris comme dérivé de l’apparence, le comportement et l’état du corps39. Utilisez des scores de ≤6 comme critères pour les souris moribondes à sacrifier par inhalation de dioxyde de carbone.

5. Tester les réponses aux cibles identifiées génomiquement dans les modèles PDX

  1. Commencez les traitements ciblés sélectionnés lorsque les tumeurs sont palpables et atteignent 0,5 cm3 selon une échographie.
    1. Avant d’effectuer une échographie de l’abdomen enlever la fourrure abdominale de la souris et d’appliquer lubrifiant stérile gelée.
    2. Utilisez une machine à ultrasons avec un transducteur pour obtenir des images avec la tumeur placée en coupe transversale. Faire 3 mesures par session pour chaque animal et la valeur moyenne pour une évaluation plus précise de la taille de la tumeur.
    3. Analyser les images à l’aide du logiciel disponible40.
  2. Administrer la chimiothérapie composée d’un mélange de carboplatine à 51 mg/kg et de paclitaxel à 15 mg/kg intrapéritoneally (IP) une fois par semaine pour une durée totale de traitement de 4-6 semaines. Assurez-vous que le volume total pour l’injection ne dépasse pas 0,2 mL.
  3. Faire une solution mk-220641 stock dans 30% cyclodextrine (par exemple, Captisol) et livrer par gavage oral à 120 mg/kg par jour pendant 4 semaines consécutives.
  4. Préparer la souris pour le gavage oral en la tenez en pinçant la peau du dos et en la mettant en arrière, de sorte que la tête et les membres de la souris sont immobilisés.
    1. Insérez la sonde de gavage à l’arrière de la gorge de la souris jusqu’à ce que la sonde atteigne l’œsophage. Assurez-vous que la sonde n’est pas insérée trop loin, car les poumons de la souris peuvent perforer, causant la mort.
  5. Faire une solution mk-866942 stock dans l’éthanol à 25 mg/mL. Diluer dans un véhicule contenant 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 dans de l’eau stérile pour les injections IP à 10 mg/kg pendant 5 jours toutes les deux semaines, avec une durée totale du traitement de 4 semaines.
    REMARQUE : Le volume injecté chez les souris doit être de 50 à 120 mL, selon le poids de l’animal.
  6. Utilisez 7-8 souris par groupe de traitement pour avoir assez de puissance statistique pour détecter les différences43,44.
  7. Évaluer le poids corporel et l’état général des souris en thérapie quotidienne. Retenir les médicaments si le poids d’un animal diminue de 20 % ou plus de son poids initial.
  8. Évaluez la taille de la tumeur chaque semaine en utilisant le balayage d’ultrason. Assurez-vous que l’individu effectuant la surveillance de la croissance de tumeur est aveuglé au traitement pour assurer la notation impartiale des réponses.
    REMARQUE : Les petits laboratoires peuvent employer 2 personnes différentes pour administrer le traitement et la surveillance par ultrasons.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Les tissus provenant de tumeurs ovariennes réséquées au moment des chirurgies de débulking ont été prélevés conformément aux directives de la CISR et utilisés pour 1) la caractérisation génomique et 2) l’engraftment chez les souris immunocompromisées (figure 1). Le protocole de séquençage de la paire demates 36,37 a été utilisé pour identifier les altérations structurelles de l’ADN, y compris les pertes, les ga...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Nous décrivons l’approche et les protocoles que nous avons utilisés pour mener un « essai clinique » dans des modèles PDX qui tirent parti des caractéristiques moléculaires de la tumeur obtenues par le profilage génomique pour déterminer le meilleur choix de médicaments pour le test. Plusieurs plates-formes de séquençage sont actuellement utilisées pour la caractérisation génomique des tumeurs primaires, y compris le séquençage du génome entier, RNAseq et des panneaux génétiques personnalisés. Pour...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions les membres du Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr Lin Yang et Faye R. Harris, MS, pour leur aide dans la conduite d’expériences. Ce travail a été appuyé par le don de M. et Mme Neil E. Eckles au Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3M Vetbond3M, Co.1469SB
anti-AKT antibodyCell Signaling Technologies, Inc.9272
Anti-GAPDH antibody(G-9)Santa Cruz Biotech. Inc.sc-365062
Anti-MAPK antibodyCell Signaling Technologies, Inc.9926
Anti-phospho-AKT antibodyCell Signaling Technologies, Inc.9271
Anti-mTOR antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2972
Anti-Phospho-mTOR antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2971
Anti-Phospho-S6 antibodyCell Signaling Technologies, Inc.4858
Anti-Rictor antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2114
Anti-S6 antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2217
CaptisolChemScene, Inc.cs-0731
CarboplatinNOVAPLUS, Inc.61703-360-18
DMEMMediatech, Inc.10-013-CV
Easy-A Hi-Fi PCR Cloning EnzymeAgilent, Inc.600404-51
LubricantCardinal Healthcare82-280
MatrigelCorning, Inc.356234
McCoy's mediaMediatech, Inc.10-050-CV
MK-2206ApexBio, Inc.A3010
MK-8669ARIAD Pharmaceuticals, Inc.AP23573
Nair Sensitive SkinChurch & Dwight Co.Nair Hair Remover Shower Power Sensitive
NOD/SCID miceCharles River, Inc.NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl
PaclitaxelNOVAPLUS, Inc.55390-304-05
PEG400Millipore Sigma, Inc.88440-250ML-F
PerjetaGenetech, Co.Pertuzumab
RituximabGenetech, Co.Rituxan
RPMI1640Mediatech, Inc.10-040-CV
SCID miceHarlan Laboratories, Inc.C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg
SLAx 13-6MHz linear transducerFUJIFILM SonoSite, IncHFL38xp
SonoSite S-series Ultrasound machineFUJIFILM SonoSite, IncSonoSite SII
Tween 80Millipore Sigma, Inc.P4780-100ML

Références

  1. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  2. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
  3. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
  4. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  5. Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
  6. Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
  8. Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
  9. Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
  10. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
  11. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
  12. Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
  13. Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
  14. Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
  15. Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
  16. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
  17. Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
  18. Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
  19. Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
  20. Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172(2016).
  21. Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
  22. Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
  23. Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
  24. 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
  25. Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
  26. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
  27. Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
  28. Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  29. Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125(2015).
  30. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  31. Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
  32. Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
  33. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  34. Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
  35. Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
  36. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
  37. Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
  38. Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
  39. Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
  40. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  41. Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
  42. Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
  43. Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
  44. Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14(2018).
  45. Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
  46. Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Recherche sur le cancerNum ro 161Analyse g nomiqueS quen age de la paire matex nogreffes d riv es du patientengreffement de tumeurvalidation d alt ration d ADNTh rapie cibl e

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.