Identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'assay Split Luciferase

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour le dépistage des agents viraux anti-hépatite B qui inhibent l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'évaluation de la luciferase fractionnée. Ce système permet une détection facile des interactions protéines-protéines et convient à l'identification des inhibiteurs de ces interactions.

Résumé

Il y a un besoin urgent de nouveaux agents thérapeutiques pour l'infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Bien que les analogues nucléos(t)ide actuellement disponibles inhibent puissamment la réplication virale, ils n'ont aucun effet direct sur l'expression des protéines virales transcrites à partir d'un ADN circulaire viril covalently fermé (cccDNA). Comme une charge élevée d'antigène viral peut jouer un rôle dans cette carcinogenèse chronique et liée au VHB, l'objectif du traitement du VHB est d'éradiquer les protéines virales. La protéine régulatrice du VHB X (HBx) se lie à la protéine 1 (DDB1) qui lie les dommages à l'ADN de l'hôte pour dégrader le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), ce qui entraîne l'activation de la transcription virale de l'ADN-ccc. Ici, à l'aide d'un système d'analyse de complémentarité de la luciférase fractionnée, nous présentons un système complet de dépistage composé pour identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1. Notre protocole permet une détection facile de la dynamique d'interaction en temps réel au sein des cellules vivantes. Cette technique peut devenir un essai clé pour découvrir de nouveaux agents thérapeutiques pour le traitement de l'infection par le VHB.

Introduction

L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) est un problème majeur de santé publique dans le monde entier, avec des estimations annuelles de 240 millions de personnes infectées de façon chronique par le VHB et de 90 000 décès dus à des complications de l'infection, y compris la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (HCC)¹. Bien que les agents thérapeutiques anti-HBV actuels, analogues nucléos(t)ide, inhibent suffisamment la transcription inverse virale, ils atteignent rarement l'élimination des protéines virales, qui est l'objectif clinique à long terme. Leur mauvais effet sur l'élimination des protéines virales est dû à leur manque d'effet direct sur la transcription virale des minichromosomes d'ADN circulaires épisomiques covalentement fermés (cccDNA) dans le noyau d'hépatocyte².

La transcription du VHB est activée par la protéine HBV regulatory X (HBx)³. Des études récentes ont révélé que HBx dégrade le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), un facteur de restriction de l'hôte qui bloque la transcription du VHB de cccDNA, par le détournement d'un DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase complexe^4,5,6. Par conséquent, une étape cruciale dans la promotion de la transcription virale de cccDNA est pensé pour être l'interaction HBx-DDB1. Les composés capables d'inhiber la liaison entre HBx et DDB1 peuvent bloquer la transcription virale, et en effet le nitazoxanide a été identifié comme un inhibiteur de l'interaction HBx-DDB1 via un système de criblage développé dans notre laboratoire⁷.

Ici, nous présentons notre système de criblage commode utilisé pour identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1, qui utilise un test complémentaire de luciferase fractionnée^7,8. Les sous-unités de luciferase fendues sont fusionnées à HBx et DDB1, et l'interaction HBx-DDB1 amène les sous-unités à proximité pour former une enzyme fonctionnelle qui génère un signal luminescent lumineux. Comme l'interaction entre les sous-unités est réversible, ce système peut détecter des protéines HBx-DDB1 dissociantes rapidement dissociantes (figure 1). À l'aide de ce système, une grande bibliothèque de composés peut être facilement examinée, ce qui peut entraîner la découverte de nouveaux composés capables d'inhiber efficacement l'interaction HBx-DDB1.

Protocole

REMARQUE: Une représentation schématique de l'analyse de la luciferase fendue est indiquée à la figure 1A, et le processus d'analyse est décrit à la figure 1B. La dynamique d'interaction peut être mesurée en temps réel sans lyse cellulaire.

1. Préparation cellulaire

1. Maintenir les cellules HEK293T cultivées dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% v/v sérum bovin foetal (FBS), 1x pénicilline/streptomycine à 37 oC dans 20% O₂ et 5% CO₂.
2. Ensemencer 5 x 10⁶ cellules dans un plat de 100 mm avec 10 ml de DMEM et incuber à 37 oC pendant la nuit.
3. Transfect transitoirement 1 g de HBx et DDB1 avec des luciferases fendues dans les cellules selon la méthode suivante.
   REMARQUE: La quantité d'ADN plasmide transfectépeut peut dépendre du régent de transfection utilisé. La position optimale de la luciferase fendue fusionnée à la protéine cible doit être déterminée à l'avance. Dans ce cas, HBx fusionné à LgBit au c-terminus de HBx (HBx-LgBit) et DDB1 fusionné à SmBit au n-terminus de DDB1 (SmBit-DDB1) a fourni les meilleurs résultats (c.-à-d., les signaux de luciférase les plus brillants). Ce processus a été rapporté précédemment dans le détail⁷.
   1. Diluer 1 g de HBx-LgBit exprimant le plasmide d'ADN et 1 g de SmBit-DDB1 exprimant le plasmide d'ADN (Tableau des matériaux) dans le tampon de condensation d'ADN (tableau des matériaux) à un volume total de 300 L.
   2. Ajouter 16 l de solution d'améliorateur (Table of Materials) et mélanger par vortexing pour 1 s.
   3. Incuber l'échantillon à température ambiante pendant 3 min.
   4. Ajouter 60 l de réactif de transfection(tableau des matériaux)à l'échantillon et mélanger par vortexing pendant 10 s.
   5. Incuber l'échantillon à température ambiante pendant 8 min.
   6. Pendant l'incubation, aspirer le milieu de culture du plat (préparé à l'étape 1.2), et laver les cellules avec 5 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS). Supprimer PBS par aspiration et ajouter 7 mL de DMEM.
   7. Ajouter 3 ml de DMEM au tube contenant les complexes de transfection. Mélanger par pipetting et ajouter les complexes de transfection sur la cellule dans le plat de 10 cm.
4. Incuber les cellules à 37 oC dans un incubateur de moins de 5 % de CO₂ pendant 10 h.
5. Réensemencer les cellules dans une plaque blanche de 96 puits à 5 x 10⁴ cellules/puits dans 50 L de moyenne /puits selon la méthode suivante.
   1. Enlever le milieu de culture cellulaire usé et laver les cellules avec 5 ml de PBS.
   2. Retirez le PBS par aspiration, ajoutez 1 ml de trypsine-EDTA de 0,25 % et incubez à 37 oC pendant 5 min pour détacher les cellules.
   3. Ajouter 4 ml de DMEM et disperser le milieu en tapissant plusieurs fois la surface de la couche cellulaire. Transférer la suspension de la cellule dans un tube.
   4. Cellules centrifugeuses à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
   5. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de PBS.
   6. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le supernatant.
   7. Diluer le granule cellulaire avec le milieu de culture cellulaire tamponné (Tableau des matériaux) complété par 10% FBS à une densité d'ensemencement de 1,0 x 10⁶ cellules/mL.
   8. Pipette 50 l de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de puits de 96 et retourner les cellules à l'incubateur.
6. Incuber les cellules à 37 oC sous 5 % de CO₂ pendant 10 h.

2. Dépistage composé

1. Pendant l'incubation, diluer les composés de criblage(Tableau des matériaux) et le solvant (sulfoxide de diméthyle [DMSO]) à une concentration de 13,5x. Par exemple, si le stock est de 10 mm et que la concentration de criblage est de 10 M, ajoutez 1 l de solution de stock à 73,1 l de milieu de culture cellulaire tamponné.
2. Ajouter 12,5 l de substrat luminescent(tableau des matériaux)à chaque puits et incuber pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE: En tant que contrôles négatifs, les puits aux deux extrémités de la plaque (c.-à-d. les colonnes 1 et 12) ne doivent pas contenir de substrat luminescent.
3. Mesurer la luminescence de base à l'aide d'un luminomètre (Tableau des matériaux).
4. Immédiatement après la mesure initiale, ajouter 5 l de composés et contrôler le DMSO dilué à l'étape 2.1 à chaque puits.
   REMARQUE: La concentration finale sera de 10 M.
5. Mesurer les valeurs de luminescence toutes les 30 min pendant 2 h.
   REMARQUE: La plaque doit être incubée dans l'obscurité à température ambiante.
6. Calculer les effets inhibiteurs en comparant le traitement de contrôle DMSO après la normalisation aux signaux de base.
   REMARQUE: Le dépistage de chaque composé en double ou en triplepeut peut réduire les variations.

Résultats

Les résultats représentatifs à la suite de l'utilisation de ce protocole sont indiqués à la figure 2A,B. Le rapport signal-arrière était supérieur à 80 et le facteur^{Z 9} (l'indice de qualité de l'étalon-or pour le dépistage à haut débit) était supérieur à 0,5, ce qui indique que ce système d'analyse était acceptable pour le dépistage à haut débit. Avec le seuil fixé à l'inhibition de 40% par rapp...

Discussion

Nous avons développé une méthode de criblage pratique utilisant un test de luciferase split pour trouver des inhibiteurs de liaison HBx-DDB1. La dynamique d'interaction peut être détectée en temps réel dans les cellules vivantes sans avoir besoin de lyse cellulaire. L'inhibition de l'interaction HBx-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6, ce qui entraîne la suppression de la transcription virale, l'expression des protéines, et la production cccDNA⁷. Ce nouveau mécanisme d'action antiv...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049