Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

Résumé

Ce protocole décrit un processus expérimental pour produire des particules virales pseudotyped infectieuses à haut titre (pp) avec des glycoprotéines d'enveloppe de deux souches de grippe A et comment déterminer leur infectiosité. Ce protocole est très adaptable pour développer des pps de n'importe quel autre type de virus enveloppés avec différentes glycoprotéines d'enveloppe.

Résumé

La transmission directe occasionnelle du virus hautement pathogène de la grippe aviaire A H5N1 (HPAI H5N1) et du H7N9 aux humains et leur létalité sont de graves problèmes de santé publique et suggèrent la possibilité d'une épidémie. Cependant, notre compréhension moléculaire du virus est rudimentaire, et il est nécessaire d'étudier les propriétés biologiques de ses protéines enveloppe comme cibles thérapeutiques et de développer des stratégies pour contrôler l'infection. Nous avons développé une plate-forme solide de particules pseudotypées virales (pp) pour étudier le virus de la grippe aviaire, y compris l'analyse fonctionnelle de son enveloppe d'hémagglutinine (HA) et de neuraminidase (NA) glycoprotéines, les caractéristiques de réassortiment des HA et des NA, récepteurs, les tropismes, neutralisant les anticorps, le diagnostic, l'infectiosité, aux fins du développement de médicaments et de la conception de vaccins. Ici, nous décrivons une procédure expérimentale pour établir des pps avec les glycoprotéines d'enveloppe (HA, NA) de deux souches de grippe A (HAPI H5N1 et 2013 H7N9 aviaire). Leur génération est basée sur la capacité de certains virus, tels que le virus de la leucémie murine (MLV), d'incorporer des glycoprotéines enveloppe dans un pp. En outre, nous détaillons également comment ces pps sont quantifiés avec RT-qPCR, et la détection d'infectiosité des pps indigènes et inadaptés de virus selon l'origine des HAs et des NAs. Ce système est très flexible et adaptable et peut être utilisé pour établir des pps viraux avec des glycoprotéines enveloppe qui peuvent être incorporés dans n'importe quel autre type de virus enveloppé. Ainsi, cette plate-forme de particules virales peut être utilisée pour étudier les virus sauvages dans de nombreuses recherches.

Introduction

La mission d'une particule virale est de transporter son génome d'une cellule hôte infectée à une cellule hôte non infectée et de le livrer dans le cytoplasme ou le noyau sous une forme de réplication-compétente¹. Ce processus est d'abord déclenché par la liaison aux récepteurs cellulaires hôtes, suivie par la fusion de virion et de membranes cellulaires. Pour les virus enveloppés, comme les virus grippaux, les glycoprotéines à pointe sont responsables de la liaison des récepteurs et de la fusion^1,2. Les glycoprotéines d'enveloppe virale (par exemple, pyrogènes, antigènes), sont impliquées dans beaucoup de propriétés et d'événements importants, tels que l'initiation de cycle de vie de virus (liaison et fusion), la pathogénie virale, l'immunogénicité, l'apoptose de cellules d'hôte et le tropisme cellulaire, la voie endocytique cellulaire, aussi bien que la transmission et le reassortiment interspécifiques^1,3,4,5,6,7. La recherche sur les glycoprotéines d'enveloppe virale nous aidera à comprendre beaucoup d'aspects du processus d'infection virale. Les particules virales pseudotypées (pp), aussi appelées pseudovirions ou pseudoparticules, peuvent être générées par une technique de pseudotypage^8,9,10. Cette technologie a été utilisée pour développer des particules pseudotypées de nombreux virus, y compris l'hépatite C^11,12, l'hépatite B¹³, virus de la stomatérite vésiculaire (VSV)^14,15, et le virus de la grippe^16,17,18,19. Cette technologie est basée sur la protéine Gag-Pol des lentivirus ou d'autres rétrovirus.

Les particules virales pseudotypées peuvent être obtenues à l'aide d'un système à trois plasmides en cotransfectant une enveloppe virale d'expression de glycoprotéine plasmide, un plasmide d'emballage rétroviral manquant le gène env d'enveloppe, et un plasmide de journaliste séparé dans les cellules de producteur pp. Le rétrovirus est assemblé par sa protéine Gag, et il bourgeonne à partir d'une membrane cellulaire infectée qui exprime la protéine enveloppe virale¹. Par conséquent, il est possible d'obtenir des pps de grippe de haute titer utilisant la protéine de Gag rétrovirus pour produire des bourgeons sur une membrane cellulaire exprimant l'influenza HA et NA. Dans nos études précédentes, les H/NA dans toutes les combinaisons étaient fonctionnels et capables d'exécuter leurs fonctions correspondantes dans le cycle de vie viral^{16,17,18,20,21}. Ces pps sont employés pour étudier des caractéristiques biologiques de grippe, y compris l'hémagglutination, l'activité de neuraminidase, le tropisme liant de HA-récepteur, et l'infectiosité. Étant donné que l'HA et l'AN sont deux protéines fonctionnelles de surface importantes dans le cycle de vie viral, les H et les NA dépareillés dérivés de différentes souches de la grippe peuvent en partie démontrer le réassortiment entre eux. Ici, nous produisons huit types de pps de grippe en combinant deux HAs et deux NA (dérivé de la souche H5N1 de HPAI et de la tache H7N9), utilisant un système de pseudotypage à trois plasmides. Ces huit types de pps comprennent deux pps indigènes, H5N1pp, H7N9pp; deux pps dépareillés, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; et quatre pps hébergeant seulement une seule glycoprotéine (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Les études sur le virus de l'influenza, telles que H5N1 et H7N9, sont limitées par des exigences de biosécurité. Toutes les études sur les souches du virus de l'influenza sauvage doivent être effectuées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL-3). La technologie des particules virales pseudotypées peut être utilisée pour emballer une virion artificielle dans un cadre de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Par conséquent, les pps représentent un outil plus sûr et utile pour étudier les processus de virus de l'influenza en fonction de ses deux glycoprotéines principales : l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA).

Ce protocole décrit la génération de ces pps avec une stratégie de cotransfection à trois plasmides (survu la figure 1),comment quantifier les pps, et la détection de l'infectiosité. La production pp implique trois types de plasmides (Figure 1). Le gène gag-pol, qui code la protéine rétrovirus Gag-Pol, a été cloné à partir d'un kit d'emballage rétrovirus et inséré dans le plasmide pcDNA 3.1 et nommé pcDNA-Gag-Pol. Le gène amélioré de protéine fluorescente verte (eGFP), qui code la protéine fluorescente verte, a été cloné du vecteur de pTRE-EGFP, inséré dans le plasmide de PCDNA 3.1, et appelé pcDNA-GFP. Pendant le clonage, une séquence de signal d'emballage a été ajoutée par l'intermédiaire d'une amorce. Les gènes HA et NA ont été clonés dans un plasmide pVRC, nommé pVRC-HA et pVRC-NA, respectivement. Le dernier plasmide code la protéine de fusion et peut être remplacé par n'importe quelle autre protéine de fusion d'intérêt. Notre plate-forme de pseudotypage comprend deux plasmides d'expression de glycoprotéine : pVRC-HA et pVRC-NA. Cela peut simplifier la recherche sur le réassortiment entre les différentes souches virales dans un cadre BSL-2.

Protocole

1. Jour 1 : Culture cellulaire et ensemencement

1. Cultiver le rein embryonnaire humain (HEK) 293T/17 cellules dans des plats de 60 mm avec le milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U/mL pénicilline-streptomycine (DMEM Complete Medium, DCM) dans un 37 c, 5% de dioxyde de carbone (CO 2) (CO₂₎
   REMARQUE : Les cellules à faible passage HEK 293T/17 sont recommandées.
2. Lavez soigneusement les cellules avec 5 ml de phosphate tamponné salin (PBS) 1x.
   REMARQUE : La manipulation manuelle des cellules HEK 293T/17 doit être très douce, car elles se détachent facilement.
3. Retirez pbS et dissoisez les cellules avec 1 ml de 0,25% trypsin-éthylène diamine tétraacetic acid (EDTA) solution. Placer le plat dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 % pendant 5 min jusqu'à ce que les cellules soient dissociées.
4. Désactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de DCM. Dispersez les cellules dans une suspension à une seule cellule en faisant monter et descendre plusieurs fois.
5. Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de centrifugeuse préréfrigéré de 15 ml. Recueillir les cellules par centrifugation à 250 x g pendant 5 min à 4 oC.
6. Décante autant que possible du supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire avec 6 ml de milieu DCM et compter les cellules. Diluer les cellules à 1 x 10⁶ cellules/mL avec le milieu DCM.
7. Ensemencer les cellules dans une plaque de 6 puits avec 1 ml de suspension cellulaire par puits. Tapotez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules. Incuber la plaque toute la nuit (14 à 16 h) dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 %.

2. Jour 2: Cotransfection à quatre plasmides médiatisé par Lipofection

1. Vérifiez la morphologie et la densité cellulaires sous un microscope à lumière inversée. Idéalement, les cellules devraient être environ 85% confluent à la transfection. Remplacer le milieu par 1 ml de milieu DMEM sans sérum par puits, puis remettre la plaque dans l'incubateur.
   REMARQUE : La manipulation manuelle des cellules HEK 293T/17 doit être très douce, car elles se détachent facilement.
2. Pour que chaque puits de cellules cultivées soit transfecté, diluer 8 'L du réactif de transfection à un volume de 150 'L avec le milieu de sérum réduit (tube 1). Mélanger délicatement et incuber 5 min à température ambiante (RT, environ 20 oC).
   REMARQUE : Pour chaque échantillon de transfection, préparez deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml, numérotés 1 et 2.
3. Dans le tube 2, diluer 2,5 g d'ADN plasmide en 150 l de sérum réduit moyen.
   REMARQUE : Dans le tube 2, diluer chaque ADN plasmide comme le montre le tableau 1. Un plasmide codant le virus de stomatérite de vésicule (VSV) Glycoprotéine de G (plasmide pLP-VSVG) a été employé comme contrôle positif, parce que VSV peut infecter un large éventail de cellules. Des particules de contrôle négatives qui n'ont pas d'enveloppe grippale glycoprotéines ont été générées à l'aide de plasmides pcDNA-Gag-Pol et pcDNA-GFP.
4. Après une incubation de 5 min, combiner l'ADN dilué avec le réactif de transfection dilué. Mélanger délicatement et incuber pendant 15 min à RT.
5. Ajoutez le complexe ADN-lipide au puits correspondant contenant les cellules et le milieu sans sérum. Mélanger délicatement en berçant la plaque d'avant en arrière.
6. Après l'incubation de 4 à 6 h dans un incubateur de CO₂ de 37 oC, 5 %, retirez le milieu et remplacez-le par 2 ml de DMEM. Incuber pendant 36 à 48 h dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 %.
   REMARQUE : Remplacez-le par un DMEM sans sérum et sans anticorps. Dans ce protocole, deux AP et deux NA peuvent être utilisés pour générer huit types de pps (indiqués dans le tableau 1).

3. Jour 3: Cellules sensibles Ensemencement

1. Pour l'assay d'infectiosité, ensemencez chaque type de cellules sensibles à 1 x 10⁴ cellules par puits dans une plaque de 96 puits.
   REMARQUE : Utilisez deux types de cellules cibles pour effectuer l'étude d'infectiosité dans cet article : une lignée cellulaire humaine dérivée de l'alvéolateur (cellules A549) et les cellules du rein canin Madin-Darby (MDCK). Les cellules MDCK sont largement utilisées dans la recherche sur l'influenza et peuvent être un bon contrôle. Cette étape est flexible. Toutes les autres lignées cellulaires cibles peuvent être utilisées en fonction des exigences de recherche.
2. Incuber la plaque toute la nuit (14 à 16 h) dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 %.

4. Jour 4 : Pseudotyped Viral Particle Collection, Quantification, and Infectivity Testsay

1. Collecte de particules virales pseudotypées
   1. Vérifiez la couleur du milieu. Idéalement, il devrait être rose clair ou légèrement orange. Examinez les cellules avec un microscope biologique fluorescent inversé sous 440-460 nm.
   2. À 36 à 48 h après la transtransfection, récoltez les pps en passant à travers un filtre à membrane de polyvinylide de polyvinylide de 0,45 m (PVDF) pour éliminer les débris cellulaires.
   3. Diviser les pps en petits volumes aliquots.
   4. Conserver les pps à -80 oC.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Cependant, cela n'est pas encouragé, parce que l'infectiosité des pps diminuera fortement après le gel et la décongélation.
2. Quantification des particules virales pseudotypées
   1. Transférer 20 l de pps purifiés dans un tube microcentrifuge sans ribonuclage (RNase) de 1,5 ml.
   2. Ajouter 1 oL de 0,24 U/mL de nucléase de benzonase. Incuber à 37 oC pendant 1 h pour éliminer toute contamination par l'ADN et l'ARN.
      REMARQUE : L'ARN cible, couramment régulé par cytomégalovirus (CMV)-GFP ARN, est emballé dans les pps et peut éviter d'être dégradé par la nucane de benzonase.
   3. Congeler l'échantillon à -70 oC pour inactiver la nucane de benzonase.
   4. Ajouter 2 ll de protéinase K. Incubate à 50 oC pendant 30 min pour digérer les protéines de l'enveloppe et libérer l'ARN CMV-GFP. Inactiver la protéinase K à 100 oC pendant 3 min.
   5. Quantifier les pps par la transcription inversée quantitative en temps réel (qRT)-PCR avec un kit rt-qPCR de sonde universelle, en utilisant l'amorce avant 5'-AACAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', l'amorce inverse 5'-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3', et la sonde 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', sur un thermocycler PCR en temps réel. Normaliser les pps pour le numéro de copie d'ARN avant l'infectiosité.
3. L'infection est à l'autre
   1. Diluer chaque type de pps en termes de données qRT-PCR à 4 x 10⁵ copies/mL (p normalisation).
   2. Ajouter la tosyl-Phenylalanine Chloromethyl-Ketone (TPCK)-trypsine à une concentration finale de 40 g/mL en pps qui abritent H7N9 HA. Incuber à 37 oC pendant 1 h pour former ses sous-unités fonctionnelles HA1 et HA2.
      REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de traiter les pps qui abritent H5 avec TPCK-trypsin, parce qu'ils ont plusieurs résidus d'arginine et de lysine sur le site de clivage HA1-HA2. Ce site de clivage multi-basique peut être clivé par des protéases cellulaires omniprésentes.
   3. Mélanger les pps normalisés avec le milieu DMEM (sans sérum) à un rapport 1:1 (volume/volume).
   4. Apportez la plaque contenant des cellules sensibles à l'armoire de biosécurité.
   5. Aspirer le supernatant et laver les cellules une fois avec 0,1 ml de PBS préchauffé.
   6. Ajouter 0,1 ml de mélange pps-DMEM à un puits. Tripler les tests d'infectiosité de chaque type de pps à une lignée cellulaire sensible (survu à la figure 2).
   7. Incuber la plaque de puits de 96 personnes pendant 4 à 6 h dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 %.
   8. Aspirer le supernatant et remplacer par 0,1 ml de DCM.
   9. Incuber la plaque de puits 96 pendant 24 à 36 h dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 %.

5. Jour 5 ou 6: Détection d'infectiosité

1. Apportez la plaque de puits 96 à l'armoire de biosécurité.
2. Aspirer le supernatant et laver les cellules 1x avec 0,2 ml de PBS préchauffé.
3. Retirez pbS et dissoisez les cellules avec 0,1 ml de la solution trypsin-EDTA de 0,25%.
4. Placer le plat dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 % pendant 3 min jusqu'à ce que les cellules soient dissociées.
   REMARQUE: Évitez d'incuber pendant plus de 5 min, car cela conduira à l'agglutination cellulaire.
5. Désactiver la trypsine en ajoutant 0,4 ml de DCM.
6. Dispersez les cellules en suspension monocellulaire en faisant monter et descendre plusieurs fois.
7. Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de microcentrifuge réfrigéré de 1,5 ml.
8. Déterminer les cellules positives des reporters GFP avec fluorescence active de tri cellulaire (FACS).
   REMARQUE : Pour déterminer le rapport entre les cellules cibles positives et les micro-femmes du GFP, fixez les portes cytométriques d'écoulement à l'aide des échantillons témoins (cellules A549 non traitées ou cellules MDCK), puis comptez les cellules reporteuses-positives gFP de 10 000 cellules par échantillon.

Résultats

Selon la procédure générale décrite ci-dessus, nous avons généré 10 types de pps combinant deux h/NA de groupe ou glycoprotéine vsV-G ou glycoprotéines sans enveloppe (indiquées dans le tableau 1). Sept d'entre eux sont infectieux. Les pps qui abritent de la glycoprotéine sans enveloppe ou qui n'abritent que NA n'ont montré aucune infectiosité ici. La procédure de production de la grippe pp est examinée à la figure 1. Les micrographies électroniques de trans...

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour produire des particules pseudotypées de virus de grippe (pp) dans un arrangement de BSL-2. Le plasmique du plasmique pcDNA-GFP est incorporé dans les pps et peut être utilisé pour quantifier les pps par FACS dans un test d'infectiosité. Nous avons choisi deux types de lignées cellulaires sensibles parce qu'elles sont largement utilisées dans la recherche sur l'influenza. Les cellules MDCK fourniraient un bon contrôle aux cellules humaines immortalisées variabl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Millipore	70664	Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)	Corning	3599	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)	Costar	3516	Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)	Gibco	11965092	A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum	Excell	FND500	fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)	Beckman coulter	cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells	ATCC	CRL-11268	A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope	Olympus	BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope	Olympus	CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019	Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit	NEB	E3006L	Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Axygen	MCT-150-C	33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF	Millipore	SLHV033RS	an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058021	The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	430791	a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K	Beyotime	ST532	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)	Corning	430166	Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin	Sigma	T1426	This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056