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Résumé

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Résumé

La métastase est la principale cause de décès liés au cancer et il existe peu d'options thérapeutiques pour les patients atteints de maladie métastatique. L'identification et l'essai de nouvelles cibles thérapeutiques qui faciliteront le développement de meilleurs traitements pour la maladie métastatique exigent des modèles précliniques in vivo. Démontré ici est un modèle de souris syngénéique pour assainer la colonisation métastatique de cancer du sein et la croissance suivante. Les cellules cancéreuses métastatiques sont traitées de façon stable avec des vecteurs viraux codant la luciferase firefly et les protéines ZsGreen. Les gènes candidats sont ensuite manipulés de façon stable dans les cellules cancéreuses exprimant la luciferase/ZsGreen, puis les cellules sont injectées chez la souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue pour mettre en évidence la colonisation et la croissance métastatiques. Un dispositif d'imagerie in vivo est ensuite utilisé pour mesurer la bioluminescence ou la fluorescence des cellules tumorales chez les animaux vivants afin de quantifier les changements dans la charge métastatique au fil du temps. L'expression de la protéine fluorescente permet de quantifier le nombre et la taille des métastases dans les poumons à la fin de l'expérience sans avoir besoin de sectionnement ou de coloration histologique. Cette approche offre un moyen relativement rapide et facile de tester le rôle des gènes candidats dans la colonisation et la croissance métastatiques, et fournit beaucoup plus d'informations que les tests traditionnels de métastase de veine de queue. En utilisant cette approche, nous montrons que le renversement simultané de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif liant PDZ (TAZ) dans les cellules cancéreuses du sein conduit à une réduction de la charge métastatique dans les poumons et que cette charge réduite est le résultat d'une colonisation métastatique considérablement altérée et d'une croissance réduite des métastases.

Introduction

Le cancer reste la deuxième cause de décès dans le monde1 et la métastes est responsable de la majorité de ces décès2,3. Cependant, une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui régissent la colonisation métastatique et la croissance subséquente a entravé le développement de traitements efficaces pour la maladie métastatique. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques nécessite un essai pour tester comment l'expression ou la fonction perturbée d'un gène candidat influence la formation et la croissance de métastes. Bien que les modèles de souris autochthonous aient leurs avantages, ils sont longs et coûteux à générer, ce qui les rend plus adaptés à la validation des cibles plutôt qu'à la découverte de cibles. Les systèmes de modèle de transplantation dans lesquels le gène candidat est perturbé dans les cellules cancéreuses in vitro et puis les effets sur le potentiel métastatique sont évalués in vivo, sont moins chers et plus élevés que les modèles autochthonous. En outre, les vecteurs viraux pour l'administration stable de l'ARNi, du CRISPR/CAS9 et des transgènes sont largement disponibles, ce qui rend relativement facile de perturber pratiquement n'importe quel gène ou gène d'intérêt dans une lignée de cellules cancéreuses. Cette approche peut également être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats dans la colonisation métastatique et la croissance des lignées cellulaires cancéreuses humaines en transplantant les cellules chez des souris immunodéprimées ou humanisées.

Les deux types d'essais utilisés pour tester la formation de métastes par les cellules cancéreuses transplantées in vivo sont les tests spontanés de métastes et les essais expérimentaux de métastes. Dans les essais spontanés de métastes4,5, les cellules cancéreuses sont injectées chez les souris, permis de former une tumeur primaire, puis la formation spontanée de métastes et la croissance ultérieure sont astorées. La force de ce modèle est que les cellules doivent compléter toutes les étapes du processus métastatique afin de former des tumeurs métastatiques. Cependant, beaucoup de lignes de cellules cancéreuses ne métastasent pas efficacement dans les modèles spontanés de métastase, et n'importe quelle manipulation des cellules qui influence la croissance primaire de tumeur peut confondre les résultats de l'analyse de métastase. Des tests expérimentaux de métastes, dans lesquels les cellules cancéreuses sont injectées directement dans la circulation, sont utilisés pour éviter ces pièges. Les essais expérimentaux communs de métastes incluent l'injection de veine de queue6,7,8 (et démontrée ici), l'injection intracardiaque9,et l'injection de veine de portail10.

Le but du protocole présenté ici est de fournir un test de métastes expérimentales in vivo qui permet à un chercheur de surveiller la formation et la croissance des métastes en temps réel, ainsi que de quantifier le nombre et la taille des métastes des points d'extrémité dans les poumons d'une même souris. Pour ce faire, les essais expérimentaux traditionnels de métastes de veine de queue6,7,8 sont combinés avec l'imagerie animale vivante, utilisant un dispositif d'imagerie in vivo9,11,12,13,14. Les cellules tumorales exprimant de façon stable à la fois la luciferase et une protéine fluorescente sont injectées chez les souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue, puis le dispositif d'imagerie in vivo est utilisé pour mesurer les changements de la charge métastatique dans les poumons au fil du temps (Figure 1). Cependant, le dispositif d'imagerie animale vivante in vivo ne peut pas distinguer ou mesurer la taille des métastases individuelles. Ainsi, à la fin de l'expérience, un stéréomicroscope fluorescent est utilisé pour compter le nombre et mesurer la taille des métastases fluorescentes dans les poumons sans avoir besoin de sectionnement et d'histologie ou d'immunohistochimie (Figure 1). Ce protocole peut être utilisé pour tester comment la modification de l'expression ou de la fonction d'un gène candidat influence la formation et la croissance des métastes. Des composés thérapeutiques potentiels tels que de petites molécules ou des anticorps bloquant la fonction peuvent également être testés.

Pour démontrer cette approche, nous avons d'abord effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle le facteur essentiel de réplication, la protéine de réplication A3 (RPA3) est renversé dans les cellules métastatiques de cancer du sein de souris. Nous montrons que les souris injectées avec rpA3 knockdown cellules ont beaucoup moins de charge métastatique à chaque moment par rapport aux souris injectées avec des cellules témoins. L'analyse des poumons métastases-contenants montre que ce fardeau métastatique réduit est le résultat de la colonisation métastatique sensiblement réduite et de la croissance altérée des métastases qui se forment. Pour démontrer davantage cette technique, nous avons examiné si l'élimination simultanée de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif de liaison PDZ (TAZ) altère la colonisation métastatique ou la croissance ultérieure. YAP et TAZ sont deux co-activateurs transcriptionnels connexes qui sont les effecteurs critiques en aval de la voie hippopotame. Nous15,16 et d'autres ont impliqué YAP et TAZ dans la métastasie (revue en17,18,19), suggérant que ces protéines sont de bonnes cibles thérapeutiques. Constamment, nous avons constaté que les souris injectées avec des cellules knockdown YAP/TAZ avaient considérablement réduit la charge métastatique. L'analyse des poumons a montré que les cellules de renversement de YAP/TAZ ont formé beaucoup moins de métastases et que les métastases qui se sont formées étaient plus petites. Ces expériences démontrent comment les essais expérimentaux de métastes permettent à un chercheur de tester rapidement et à peu de frais le rôle d'un gène candidat dans la formation et la croissance de métastes. Ils montrent en outre comment l'utilisation combinée de l'imagerie animale vivante et de la quantification fluorescente des métastases dans des poumons entiers permet au chercheur de mieux comprendre les étapes de la colonisation métastatique.

Protocole

Ce protocole implique l'utilisation de souris et de matériaux biodangereux et nécessite l'approbation des comités de sécurité institutionnels appropriés. Tous les travaux in vivo décrits ici sont approuvés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Collège médical d'Albany.

REMARQUE : Pour une vue d'ensemble du protocole, voir schéma à la figure 1.

1. Emballage de tous les rétrovirus et lentivirus requis

REMARQUE : Le protocole décrit utilise des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux pour exprimer de façon stable une enzyme de la luciferase et une protéine fluorescente ainsi que pour manipuler l'expression d'un gène candidat. Ces virus sont emballés dans les cellules HEK-293FT comme décrit ci-dessous.

  1. Jour 1: Plaque HEK-293FT cellules sur 6-bien plaques dans 2 ml de support de croissance complète (10% FBS dans DMEM avec 1% pénicilline / streptomycine et 2 mM L-Glutamine) de sorte qu'ils sont 40-60% confluent le jour 2. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant la nuit.
  2. Jour 2 : Pour que chaque vecteur viral soit emballé, transfect un puits de confluent de 40 à 60 % des cellules HEK-293FT avec le vecteur rétroviral ou lentiviral et les vecteurs appropriés codant les protéines virales de la couche et de l'emballage.
    REMARQUE : Ce protocole utilise VSVG comme protéine de manteau, psPAX2 pour l'emballage lentiviral, et gag-pol pour l'empaquetage rétroviral (voir tableau supplémentaire 1 pour la liste de vecteur).
  3. Faire un mélange de co-transfection pour chaque puits comme suit:
    1. Combinez 4 ll de solution lipidique pour les transfections (voir Tableau des matériaux)et 96 l de tampon de transfection et incubez pendant 5 minutes.
    2. Ajouter 1 g de vecteur viral, 0,5 g de vecteur de protéines de couche (VSVG) et 0,5 g de vecteur de protéines d'emballage (psPAX2 ou gag-pol) et couver pendant 20 minutes.
    3. Ajouter délicatement le mélange de co-transfection de l'étape 1.3.2 aux cellules HEK-293FT plaquées à l'étape 1.1 et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant la nuit.
  4. Jour 3 : Retirez les supports contenant de la transfection de chaque puits et ajoutez doucement 2 ml de support de croissance complet à chaque puits. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant environ 24 heures.
  5. Jour 4 : Ramassez le supernatant viral de chaque puits à l'aide d'une seringue de 3 ml et filtrez à travers un filtre de 0,45 m dans un tube microcentrifuge de 2 ml.
  6. Facultatif : Si la collecte d'un deuxième lot de virus est souhaitée, ajouter délicatement 2 ml de support de croissance complet à chaque puits et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant environ 24 heures.
  7. Jour 5 (facultatif): Recueillir un deuxième tour de supernatant viral comme dans l'étape 1.5.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause en gelant le supernatant viral.

2. Génération de cellules cancéreuses exprimant de façon stable la luciferase et une protéine fluorescente

REMARQUE : Le protocole suivant décrit comment d'abord étiqueter de façon stable les cellules 4T1 avec de la luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase et une protéine fluorescente (ZsGreen) utilisant deux vecteurs avec des gènes uniques de sélection. Ensuite, un3e vecteur viral est utilisé pour manipuler l'expression d'un gène candidat. Cependant, les vecteurs viraux qui fournissent simultanément une protéine fluorescente et une manipulation génétique peuvent également être utilisés comme alternative (comme dans les expériences représentatives ci-dessous). D'autres cellules cancéreuses peuvent être utilisées, mais les nombres cellulaires doivent être optimisés pour les étapes 2.1 et 2.7.1.

  1. Plaque 4T1 cellules à 1,5 x 105 cellules / bien dans une plaque de 12 puits dans le support de croissance complète (10% FBS dans DMEM avec 1% pénicilline / streptomycine et 2 mM L-Glutamine) et incuber à 37 oC, 5% CO2 nuit.
  2. Infecter les cellules 4T1 avec le supernatant viral généré à l'étape 1 comme suit.
    1. Aspirez le support de croissance des cellules et ajoutez 500 l de supernatant viral de luciferase et 500 l de supernatant viral de protéine fluorescente pour infecter simultanément les cellules avec les supernatants viraux de luciferase et fluorescents de protéine.
    2. Ajouter 1 l de 8 mg/mL de bromure d'hexadimethrine (voir Tableau des matériaux).
    3. Incuber les cellules à 37 oC, 5 % jusqu'à 75-90 % de confluents (généralement de 24 à 48 heures).
  3. Trypsiniser les cellules 4T1 avec 500 L de trypsine pendant 2-5 minutes (les cellules doivent rincer librement le fond du puits). Transférer toutes les cellules dans un plat de 6 cm dans 4 ml de média de sélection (média de croissance complet contenant les antibiotiques appropriés) étanchant ainsi la trypsine. Déposer un plat de 6 cm de cellules témoins non infectées dans le même support de sélection.
    REMARQUE : La concentration appropriée d'antibiotiques doit être déterminée à l'avance en testant plusieurs doses. En outre, le tri des cellules activées par la fluorescence peut également être utilisé pour sélectionner les cellules étiquetées fluorescentes à la place de la sélection des médicaments.
  4. Incuber les cellules à 37 oC, 5 % de CO2 dans le milieu de sélection et diviser les cellules si nécessaire jusqu'à ce que toutes les cellules témoins non infectées soient mortes (dépendantes du gène de sélection et de la lignée cellulaire).
  5. Confirmez que les cellules 4T1 infectées expriment la protéine fluorescente ZsGreen à l'aide d'un filtre vert d'excitation (450-490 nm)/émission (500-550 nm) réglé sur un microscope fluorescent inversé au grossissement 50-100x.
  6. Confirmez que les cellules 4T1 infectées expriment la luciferase à l'aide d'un kit d'activité de luciferase disponible dans le commerce comme suit.
    1. Utilisez un volume minimal de tampon de lyse passive 1x pour lyse les cellules 4T1 exprimant la luciferase et contrôlez les cellules 4T1 qui n'expriment pas la luciferase, secouant doucement pendant 30 minutes.
    2. Ajouter 20 l de lysate cellulaire dans une plaque blanche de 96 puits, puis 50 l de réagent d'extrait de luciferase du kit d'activité de la luciferase.
    3. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer la luminescence des cellules à toutes les longueurs d'onde dans le spectre en utilisant le réglage de luminescence.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause en gelant les cellules stabilisées.
  7. Manipuler l'expression du gène candidat comme suit :
    1. Plaque 6 x 105 cellules 4T1 étiquetées à partir de l'étape 2.6 sur un plat de 60 mm dans 4 ml de support de croissance complète et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant la nuit.
    2. Aspirez le support de croissance de chaque puits et ajoutez 2 ml de support de croissance complet contenant 4 oL de 8 mg/mL de bromure d'hexadimethrine.
    3. Ajouter 2 ml de supernatant viral de l'étape 1 aux cellules plaquées à partir de l'étape 2.7.2 et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant la nuit.
    4. Trypsiniser les cellules 4T1 avec 500 L de trypsine pendant 2-5 minutes (les cellules doivent rincer librement le fond du puits). Transférer toutes les cellules dans un plat de 10 cm dans 10 ml de média de sélection (média de croissance complet contenant les antibiotiques appropriés) étanchant ainsi la trypsine. Plaquer certaines cellules 4T1 non infectées dans le même média de sélection.
    5. Incuber les cellules à 37 oC, 5 % de CO2 dans le milieu de sélection et diviser les cellules si nécessaire jusqu'à ce que toutes les cellules non infectées soient mortes.
    6. Confirmer que l'expression du gène candidat est modifiée à l'aide d'une approche standard comme western blot20 ou qPCR21.
    7. Analysez la luminescence et la fluorescence comme dans les étapes 2.5-2.6 pour déterminer comment elles sont semblables dans les cellules de contrôle et de knockdown, car cela peut changer (voir Discussion).
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause en gelant les cellules stabilisées.

3. Optimisation de la conception expérimentale in vivo

  1. Optimisez le nombre de cellules approprié et la durée de l'expérience pour la charge métastatique souhaitée comme suit.
    1. Élargir les cellules 4T1 fluorescentes et bioluminescentes à partir de l'étape 2.6 dans le support de croissance complet afin que les cellules excédentaires soient disponibles le jour désiré de l'injection.
    2. Préparer les cellules pour les injections de veine de la queue comme décrit à l'étape 4.2. Pour déterminer le nombre optimal de cellules pour les injections, resuspendre les cellules à plusieurs concentrations différentes dans 100 'L de 1x PBS.
      REMARQUE : Nous recommandons de tester une gamme de numéros de cellules/souris de 25 000 à 500 000.
    3. Gardez les suspensions cellulaires sur la glace jusqu'à l'injection.
    4. Injecter chaque dilution des cellules 4T1 de l'étape 3.1.2 dans 3-4 souris via la veine latérale de queue décrite à l'étape 4.3 (voir ci-dessous).
    5. Remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète. Les souris doivent être vérifiées pour les signes de douleur ou de détresse 3x hebdomadaire.
    6. Surveiller la formation et la croissance de la métamase chez les souris pendant 3 à 6 semaines (lignée cellulaire et souche de souris dépendante) à l'aide d'un dispositif d'imagerie animale vivant in vivo (voir les étapes 5 et 6).
      1. Euthanasier les souris 3-6 semaines après l'injection de veine de queue selon les directives institutionnelles standard.
      2. Préparer les poumons et évaluer la taille et le nombre de métastes décrits à l'étape 7.
      3. Choisissez la durée appropriée pour que les métastases se développent pour le fardeau métastatique désiré (voir discussion).

4. Injection de veine de queue des cellules cancéreuses étiquetées

REMARQUE : L'étape 4.2.4 a été optimisée pour les cellules 4T1 qui poussent chez des souris syngénétiques BALB/c. Si d'autres lignées de cellules cancéreuses et des souches de souris sont utilisées, le nombre de cellules injectées et la longueur de l'épreuve doivent d'abord être optimisés.

  1. Élargir les lignées cellulaires 4T1 générées à l'étape 2 sur deux plats de 15 cm dans un support de croissance complet afin que les cellules excédentaires soient disponibles le jour de l'injection.
  2. Préparer les cellules pour l'injection de veine de la queue comme suit:
    1. Aspirer le support et rincer les plaques cellulaires avec 1x PBS.
    2. Trypsiniser les cellules avec 5 ml de trypsine par plaque de 15 cm pendant 2-5 minutes (les cellules doivent rincer librement le fond du puits). Transférer toutes les cellules dans un tube conique. Laver les cellules restantes du plat de culture tissulaire avec suffisamment de support de croissance complet pour étancher la trypsine et ajouter le lavage au même tube conique.
    3. Comptez les cellules à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé pour déterminer le nombre total de cellules.
    4. Centrifuger les cellules à 122 x g pendant 3 minutes, aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 1x PBS à la concentration désirée. Ici, 2,5 x 104 cellules sont injectées dans chaque souris dans 100 'L de PBS, de sorte que les cellules de resuspendre à 2,5 x 105 cellules/mL. Gardez les suspensions cellulaires sur la glace jusqu'à l'injection.
      REMARQUE : il est important de limiter le temps entre la trypsinisation des cellules et l'injection de veine de queue à environ 1 heure.
  3. Injecter des cellules 4T1 de l'étape 4.2.5 chez les souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue comme suit :
    1. En travaillant dans une hotte à l'établissement animalier, mélanger doucement mais soigneusement les cellules en inversant le tube ou en utilisant une seringue de 1 ml pour s'assurer qu'elles sont uniformément remises en suspension. Assurez-vous toujours que les cellules sont remises en suspension avant de charger la seringue.
    2. Chargez une seringue de 1 ml de verrouillage Luer avec une suspension cellulaire et expulsez les bulles d'air excédentaires. Placez une aiguille de 30 calibres de 1/2 pouce sur la seringue avec le bevel et expulsez les bulles d'air.
    3. Placez délicatement la souris dans une formatrice de rongeurs.
    4. Les veines latérales de la queue doivent être visibles et dilatées. Si ce n'est pas le cas, pincez délicatement la base de la queue et trempez la queue dans l'eau chaude du robinet pour dilater les veines.
      REMARQUE : La dilatation des veines peut également être réalisée en plaçant la cage de souris sous une lampe chauffante et/ou sur un coussin chauffant.
    5. Utilisez une lingette à alcool pour nettoyer la queue. Insérez l'aiguille dans la veine de la queue, côté bevel vers le haut, et injectez 100 L de suspension cellulaire.
      REMARQUE : Si l'aiguille est insérée correctement dans la veine, elle doit facilement glisser légèrement vers l'avant et vers l'arrière, et il ne devrait pas y avoir de résistance lorsque le piston est poussé. Les injections réussies devraient également avoir comme conséquence un « flush » dans lequel la couleur bleue de la veine devient blanche pendant quelques secondes suivant l'injection.
  4. Retirez lentement l'aiguille et à l'aide d'une gaze stérile, exercez une pression sur le site d'injection pour arrêter tout saignement.
  5. Remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète. Les souris doivent être vérifiées pour les signes de douleur ou de détresse 3x hebdomadaire.
  6. Surveiller la formation et la croissance de la métamase chez les souris pendant 3 à 6 semaines (lignée cellulaire et souche de souris dépendante) à l'aide d'un dispositif d'imagerie animale vivant in vivo (voir les étapes 5 et 6).

5. Suivi de la charge métastatique par fluorescence avec un dispositif d'imagerie animale vivante in vivo

REMARQUE : N'imagez pas l'animal pour la fluorescence avec le signal luminescent actif.

  1. Si seulement la bioluminescence d'imagerie, sautez à l'étape 6.
  2. Allumez le dispositif d'imagerie animale en direct in vivo.
  3. Mettre en place le système in vivo d'anesthésie d'imagerie animale vivante selon les directives du fabricant pour livrer entre 1,5% et 2% isoflurane à la chambre d'anesthésie et à la chambre d'imagerie.
  4. Anesthésiez les souris avec des métastases étiquetées fluorescentes à partir de l'étape 4 en les plaçant dans une chambre d'anesthésie et en livrant 1,5-2,5% d'isoflurane.
  5. Ouvrez le logiciel d'image (voir Tableau des matériaux) et connectez-vous.
  6. Cliquez sur le bouton Initialize et attendez que la machine entreparle.
  7. Changer le champ de vision en D.
    REMARQUE : Le champ de vision C peut également être utilisé si une vue plus étroite d'une souris est nécessaire, mais cela limite le nombre de souris qui peuvent être représentées simultanément.
  8. Une fois que le logiciel a indiqué que la caméra a atteint la température appropriée, cliquez sur le bouton Assistant d'imagerie, choisissez Fluorescence et choisissez ensuite la paire de filtres appropriée dans le menu déroulant.
    REMARQUE : Si le fluorophore utilisé n'est pas une option, choisissez Input EX/EM et tapez l'excitation et l'émission requises.
  9. Placez la souris dans la chambre comme décrit à l'étape 3.2.4.
  10. Cliquez sur Acquire Sequence.
  11. Après l'imagerie, remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète.
  12. Répétez l'étape 5.2 et les étapes 5.7-5.9 avec au moins une souris qui ne contient pas de métastases. REMARQUE : Cette souris sera utilisée pour quantifier et soustraire le signal d'arrière-plan pendant l'analyse (étape 8).
  13. Image 2-3 fois par semaine pendant toute la durée de l'expérience.

6. Suivi de la charge métastatique par bioluminescence à l'égard d'un dispositif d'imagerie animale vivant in vivo

  1. Allumez le dispositif d'imagerie animale en direct in vivo et configurez le programme comme suit.
    1. Ouvrez le logiciel d'image (voir Tableau des matériaux) et connectez-vous. Cliquez sur le bouton Initialize et attendez que la machine entreparle. Changer le champ de vision en D.
      REMARQUE : Le champ de vision C peut être utilisé pour une vue plus proche de l'image du corps complet de la souris; cependant, cela limite le nombre de souris qui peuvent être photographiés à la fois.
    2. Pour la première utilisation, modifiez les paramètres d'exposition comme suit : cliquez sur Modifier Préférences Acquisition (acquisition) Exposition automatique et changer le temps d'exposition maximum de la par défaut 60 secondes à 300 secondes et cliquez sur OK.
      REMARQUE : Ne modifiez aucun autre paramètre dans l'onglet exposition automatique.
  2. Mettre en place le système d'anesthésie selon les directives du fabricant pour livrer entre 1,5% et 2% isoflurane à la chambre d'anesthésie et la chambre d'imagerie.
  3. Assurez-vous que la caméra a atteint la température appropriée avant de passer à l'étape 6.4.
  4. Anesthésiez les souris contenant des métastes à partir de l'étape 4 en les plaçant dans une chambre d'anesthésie et en livrant 1,5-2,5% d'isoflurane.
  5. Préparer les souris à l'imagerie par bioluminescence comme suit.
    1. Chargez une seringue de 1 ml de D-luciferin (30 mg/mL en D-PBS) puis ajoutez une aiguille de calibre 30 de 1/2 pouce à la seringue et expulsez les bulles d'air.
    2. Mesurer et enregistrer la masse de la souris anesthésiée.
    3. Retenez la souris en pinçant les éraflures de leur cou à l'aide du pouce et des doigts de pointeur et en saisissant la queue entre le doigt pinkie et la base de la main. Inverser la souris à un angle de 45 degrés, avec sa tête pointée vers le bas.
    4. Insérez l'aiguille, côté bevel vers le haut, dans l'espace intrapéritoné gauche de la souris (IP). Confirmer l'entrée dans l'espace IP en retirant un petit volume. Il ne devrait pas y avoir de couleur à la base de l'aiguille lors du retrait dans l'espace IP.
    5. Injecter le volume approprié de D-luciferin pour une dose de 150 mg/kg.
    6. Immédiatement après l'administration de D-luciferin, commencez une minuterie et placez la souris à plat sur son dos dans le dispositif d'imagerie avec son nez dans le cône de nez et assurez-vous que 1.5-2.5% isoflurane est administré. Placez les séparateurs entre chaque souris si l'imagerie de souris multiples. Assurez-vous que les souris sont placées aussi à plat que possible (c.-à-d. ne pas se pencher d'un côté).
    7. Cliquez sur les cases Luminescent et Photograph, puis cliquez sur Acquérir dans le panneau de contrôle d'acquisition.
  6. Acquérez continuellement des images bioluminescentes jusqu'à ce que le signal de pointe soit atteint et utilisez l'image avec le signal bioluminescent de pointe pour l'analyse.
  7. Après l'imagerie, remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète.
  8. Image 2-3 fois par semaine pendant toute la durée de l'expérience.

7. Quantification du nombre et de la taille des métastases

REMARQUE : La durée de croissance des métastases est déterminée pour chaque lignée cellulaire et la souche de la souris, et sera influencée par le nombre de cellules injectées.

  1. Euthanasier les souris selon les directives institutionnelles standard.
  2. Isolez et retirez les poumons de chaque souris et rincez en 1x PBS pour enlever l'excès de sang.
  3. Séparer délicatement les poumons en lobes.
  4. Acquérir des images de métastases ZsGreen dans les lobes à 10x dans un champ lumineux et la fluorescence à l'aide d'un stéréoscope fluorescent avec un filtre à large bande GFP (excitation 470/40x).
    REMARQUE : Maintenez le même grossissement et la même luminosité pour tous les échantillons. Le grossissement utilisé peut varier en fonction de la taille, du nombre et de la luminosité des métastases ainsi que du champ de vision du microscope utilisé.
  5. Utilisez un logiciel d'analyse d'images pour quantifier la taille et le nombre de métastases à partir des images.
    REMARQUE: Le protocole pour l'analyse d'image est dépendant du logiciel et pourrait être optimisé avec des tumeurs à partir de l'étape3. Vous pouvez également compter manuellement le nombre de métastases dans chaque poumon à l'aide du stéréoscope fluorescent. Protocole peut être mis en pause ici et l'étape 8 peut être fait à tout moment après toutes les images in vivo ont été recueillies.

8. Traitement et analyse des données des images acquises avec le dispositif d'imagerie animale en direct in vivo

  1. Ouvrez tous les fichiers d'image pour chaque souris dans le logiciel d'image.
    REMARQUE: Utilisez l'image avec le signal bioluminescent de pointe pour l'analyse
  2. Assurez-vous que les unités sont en radiance pour les données bioluminescentes et l'efficacité pour les données fluorescentes en cliquant sur la flèche en haut à gauche de la fenêtre d'image et en la changeant à l'unité appropriée.
  3. Utilisez l'image du dernier point de temps pour créer une région d'intérêt (ROI) comme suit.
    1. Cliquez sur Les outils DE RETOUR dans la fenêtre Tool Palette. Insérez un retour sur investissement en cliquant sur la flèche et en sélectionnant 1.
    2. Cliquez sur la bordure du ROI et déplacez-la sur la poitrine de la souris. Ajuster la taille du retour sur investissement afin qu'il couvre la poitrine de la souris et n'exclut pas le signal.
  4. Cliquez sur pour mesurer les ROI et copier ou taper le nombre brut dans une feuille Excel.
    REMARQUE : Pour les données bioluminescentes, sélectionnez le flux total (photons/seconde), qui est la somme de tout l'éclat du retour sur investissement. Étant donné que les métastases ne croissent pas nécessairement uniformément, le flux total est préféré à l'éclat moyen parce qu'il mesure la somme du fardeau métastatique. De même, pour les données fluorescentes, le pourcentage d'efficacité totale (lumière d'émission (photons/seconde) /lumière d'excitation (photons/seconde)) devrait être utilisé au lieu de l'efficacité moyenne.
  5. Cliquez à droite dans le fichier d'image pour copier le retour sur investissement utilisé à l'étape 8.3 et le coller dans chaque fichier d'image.
    REMARQUE : Lors de la quantification des images fluorescentes, quantifiez la même région sur une souris qui a été imagesans d'une métasse. Utilisez ce signal comme signal d'arrière-plan et soustrayez-le de chaque image de souris fluorescente contenant des métastes acquise.
  6. Déplacez les ROI collés sur la même région sélectionnée à l'étape 8.3.4 pour chaque image et répétez l'étape 8.4.
  7. Tracer et analyser les données brutes comme suit (voir tableau supplémentaire 2).
    1. Effectuer une transformation du journal10 des données brutes pour chaque souris à l'aide de la formule indiquée (tableau supplémentaire 2) et tracer comme dans la figure 2D et la figure 4F. La transformation du journal10 linéarise la courbe de croissance qui tend à être géométrique et minimise l'hétéroscsitié.
    2. À l'aide de la régression linéaire, calculer la pente de la ligne ajustée au journal10 données transformées pour chaque souris tracée à l'étape 8.7.1 (Tableau supplémentaire 2). Reportez-vous à la formule du tableau supplémentaire 2 pour s'adapter à la ligne et calculer la pente en une seule étape.
    3. Tracer les valeurs numériques des pentes comme dans la figure 2E et la figure 4G. Utilisez le test t d'un étudiant ou l'ANOVA à sens unique (pour plus de 2 groupes) sur les pentes pour déterminer la signification statistique.

Résultats

Pour démontrer l'approche ci-dessus, nous avons effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle un facteur critique de réplication, RPA3 a été renversé dans une lignée métastatique de cellules de carcinome mammaire de souris (4T122). Alors que le protocole décrit l'étiquetage des cellules avec des protéines à la fois luciferase et fluorescente avant la manipulation génétique, nous avons utilisé une approche modifiée parce que les vecteurs RNAi fournissent également ZsG...

Discussion

Étapes critiques de la méthode
Il est essentiel d'optimiser le nombre de cellules injectées (étape 3) pour une lignée cellulaire donnée et une souche de souris, car cela peut grandement influencer le nombre de métastases qui se forment et la durée de l'expérience. Si trop de cellules sont injectées ou si les métastases se développent trop longtemps, les métastases peuvent être difficiles à compter, ce qui rend les effets de la manipulation génétique difficiles à évaluer. Cependant, ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions Emily Norton d'avoir aidé à l'aide aux infections virales et à la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également Ryan Kanai pour son aide dans l'acquisition d'images des poumons et Kate E. Tubbesing pour l'aide à l'analyse de l'image des métastases vertes dans les poumons. Nous remercions le personnel des installations de recherche animale pour leur soutien et leur aide dans la préparation de cette vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention Susan G. Komen Catalyseur de carrière qui a été accordée à J.M.L. (#CCR17477184).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE GelFor western blot
2.5% TrypsinGibco15090-046Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipesFor sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)TaconicBALB-FFor tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regularVWR Ameresco97061-416For western blot
Cell lysis bufferCell SignalingFor collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μmCelltreat40-229749-CSFor filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamberFor euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1960For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered salineHimediaTS1006For PBS
EDTAVWR97061-406Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US originVWR97068-085Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imagerFujifilmFor western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugateThermo Scientific31460For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FTInvitrogenR70007Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure GradeVWR Ameresco97064-810For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
ImagejUsed for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF MembraneBiorad1620177For western blot
IsofluraneFor mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)PerkinElmerCLS136340For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)Leica MicrosystemsMicroscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-GlutamineGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000Life technologiesL3000008For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)PerkinElmerSoftware for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al.,1992Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0FujifilmSoftware for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)Gibco31985-062For packaging virus and transfection
Penicillin StreptomycinGibco15140-122Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23225For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32957Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32953Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)Sigma-Aldrich45-H9268For infection
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainerFor restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running bufferFor western blot
TAZ (V3886) AntibodyCell Signaling4883For western blot
TBST bufferFor western blot
TC20 automated cell counterBio-RadFor counting cells
VectorsSee Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence MicroscopeVWR89404-464For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer bufferFor western blot
XenoLight D-Luciferin K+ SaltPerkinElmer122799Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)Roche6365787001For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074For western blot

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