Une approche à base de microscopie intravitale pour évaluer la perméabilité intestinale et la performance épithéliale de l’excrétion cellulaire

Résumé

Profitant de la microscopie intravitale, la méthode présentée ici permet la visualisation en temps réel de l’excrétion cellulaire épithéliale intestinale chez les animaux vivants. Par conséquent, la muqueuse intestinale topiquement tachée (acriflavine et rhodamineB-dextran) des souris anesthésiées est image jusqu’à la résolution d’une seule cellule utilisant la microscopie confoccale.

Résumé

La microscopie intravitale de l’intestin à l’aide de l’imagerie confocale permet l’observation en temps réel de l’excrétion épithéliale des cellules et des fuites de barrière chez les animaux vivants. Par conséquent, la muqueuse intestinale des souris anesthésiées est topiquement tachée de taches non spécifiques (acriflavine) et d’un traceur fluorescent (rhodamine-B dextran), monté sur une plaque saline rincée par solution et directement imité à l’aide d’un microscope confocal. Cette technique peut compléter d’autres techniques non invasives pour identifier les fuites de perméabilité intestinale, telles que le passage transmucosal des traceurs administrés par voie orale. En outre, l’approche présentée ici permet l’observation directe des événements d’excrétion cellulaire en temps réel. En combinaison avec les souris fluorescentes appropriées de reporter, cette approche convient pour verser la lumière dans les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant l’extrusion épithéliale intestinale de cellules, aussi bien qu’à d’autres processus biologiques. Au cours des dernières décennies, des études intéressantes utilisant la microscopie intravitale ont contribué à la connaissance de la perméabilité endothéliale, de l’homing intestinal des cellules immunitaires, de la communication immunisé-épithéliale et de l’invasion de composants luminaires, entre autres. Ensemble, le protocole présenté ici aiderait non seulement à mieux comprendre les mécanismes contrôlant l’extrusion épithéliale des cellules, mais pourrait également servir de base au développement d’autres approches à utiliser comme instruments pour visualiser d’autres processus cellulaires très dynamiques, même dans d’autres tissus. Parmi les limitations techniques, les propriétés optiques du tissu spécifique, ainsi que la technologie d’imagerie sélectionnée et la configuration du microscope, détermineraient à leur tour la distance de travail de l’imagerie et la résolution des images acquises.

Introduction

L’intestin est un organe hautement spécialisé avec une fonction étroitement réglementée permettant des processus contradictoires, à savoir la nutrition et la protection contre les substances luminaires nocives. Doublure entre le corps humain et l’environnement, l’épithélium intestinal agit comme une barrière physique et immunologique et contribue au maintien de l’homéostasie muqueuse dans^{l’intestin 1,2}. La perte de l’intégrité épithéliale et la perméabilité accrue de jonction serrée sont bien connues pour être associées à la maladie intestinale inflammatoire (IBD)^3,,4,,5,,6. Les altérations épithéliales sont alors considérées comme des causes et des amplificateurs secondaires pour l’inflammation intestinale chronique dans les MII. Ainsi, une meilleure compréhension des altérations épithéliales tôt dans l’intestin des patients d’IBD serait d’une valeur immense pour le développement de nouvelles stratégies pour reconstituer l’intégrité épithéliale pour la prévision fiable et la prévention suivante des rechutes d’IBD.

L’épithélium intestinal suit un processus complexe et étroitement régulé de rotation. À partir du fond de la crypte, les cellules épithéliales intestinales différenciées en phase terminale (IECs) dérivées de cellules souches pluripotentes migrent vers le haut jusqu’à la pointe villus, où les cellules âgées/endommagées sont jetées dans le lumen⁷. L’équilibre entre la division et l’extrusion cellulaire permet le maintien des nombres de cellules épithéliales intestinales, en évitant la formation de lacunes et de fuites, ainsi que l’accumulation de cellules épithéliales conduisant potentiellement à des masses cellulaires et tumorigenesis^8,9,10. En dépit du rôle clé de l’excrétion épithéliale de cellules dans le renouvellement physiologique de l’épithélium d’intestin, les connaissances au sujet des mécanismes moléculaires conduisant l’extrusion des cellules à la pointe villus sont limitées. Ainsi, il est nécessaire que la recherche fondamentale fournisse une description précise de la séquence des événements moléculaires impliqués dans l’excrétion épithéliale des cellules.

Les interactions complexes entre les différents types de cellules au sein de la muqueuse intestinale sont essentielles pour comprendre les mécanismes moléculaires régulant le renouvellement épithélial et l’homéostasie intestinale. Ainsi, les études in vivo offrent des avantages élevés par rapport aux approches in vitro et ex vivo dans ce contexte. De plus, les techniques d’imagerie en temps réel permettent de décrire la séquence des événements contrôlant des phénomènes spécifiques. Dans ce contexte, l’étude de processus hautement dynamiques exige l’utilisation de techniques optimisées à haute résolution pour l’observation directe du tissu. Les techniques d’imagerie intravitale apparaissent comme des outils appropriés uniques pour l’étude de l’excrétion épithéliale des cellules dans l’intestin.

Le terme « microscopie intravitale » désigne les approches expérimentales utilisant des techniques d’imagerie à haute résolution (microscopie multiphoton ou confocale) pour visualiser directement les cellules et les tissus dans leurs environs indigènes au sein d’un animal vivant¹¹. Il permet l’acquisition en temps réel d’informations in vivo jusqu’à la résolution d’une seule cellule, et comporte des avantages évidents par rapport aux méthodes statiques ou à basse résolution. La microscopie intravitale fournit des informations complémentaires et surmonte certaines limitations des techniques classiques et/ou haut de gamme, telles que les artefacts dus au traitement des tissus. En revanche, la principale limitation de la microscopie intravitale est que le tissu doit être directement exposé au microscope, qui dans la plupart des cas nécessite une intervention chirurgicale. Bien que des approches sophistiquées préservent la vitalité et minimisent l’impact du tissu imageur (chambres skinfold et fenêtres d’imagerie)^12,13, dans la plupart des cas une incision simple de peau est effectuée pour l’extérialisation du tissu (volets de peau)^14. Au cours de la dernière décennie, ces approches ont fourni des preuves clés de processus hautement dynamiques, qui étaient auparavant insondables. Translationnellement, l’imagerie en temps réel a fourni de nouvelles perspectives biologiques sur les cellules souches et les leucocytes homing¹⁵, ainsi que la diffusion du cancer et la formation de métastases^13,16. Dans le contexte clinique, l’endomicoscopie est actuellement exploitée comme outil diagnostique du cancer¹⁷ et des maladies gastro-intestinales, comme les^{MII 18,19}; tandis que la microscopie confoccale de mosaïque est devenue un outil rapide de pathologie pendant la^{chirurgie 20.} Ensemble, la microscopie intravitale est récemment apparue comme un outil précieux et polyvalent pour la recherche biomédicale et l’application future dans la clinique.

La microscopie intravitale est ici mise en œuvre pour la visualisation en temps réel des fuites épithéliales intestinales et l’observation des événements épithéliales d’excrétion cellulaire. La fuite de perméabilité intestinale peut être identifiée par d’autres techniques non invasives in vivo, telles que la quantification de l’administration orale des traceurs fluorescents dans le sérum^21. Toutefois, cette technique ne permet pas l’observation directe de la performance de l’excrétion ni la ségrégation entre la perméabilité para et transcellulaire. La combinaison d’expériences de traceurs standard et de microscopie intravitale représente une approche appropriée pour : i) identifier les perturbations de la perméabilité intestinale, et ii) séparer entre la perméabilité épithéliale para et transcellulaire. Outre l’excrétion cellulaire, la microscopie intravitale en combinaison avec l’étiquetage de fluorescence in vivo permet l’étude d’autres mécanismes cellulaires et moléculaires (p. ex., redistribution des jonctions serrées pendant l’excrétion cellulaire à l’aide de souris fluorescentes^{reporter 22} ou interactions entre les CCI et d’autres cellules dans la muqueuse intestinale^23).

La méthode présentée ici représente une adaptation de la microscopie intravitale pour permettre l’observation en temps réel de la muqueuse intestinale, à l’aide de microscopie à balayage laser confocal (CLSM). Par conséquent, nous utilisons des souris conditionnelles knock-out de GGTase (Géranylgeranyltransferase) dans les cellules épithéliales intestinales (IECs) dans (Pggt1b^{souris iΔIEC),} car ils souffrent d’une maladie intestinale grave et une perméabilité épithéliale^{accrue 24}. La préparation chirurgicale de la souris et la coloration de la muqueuse intestinale, ainsi que les paramètres appropriés utilisés pour l’acquisition d’imagerie et l’analyse post-acquisition sont décrits. Ce protocole pourrait permettre de futures études contribuant aux connaissances actuelles sur la dynamique et la cinétique de l’excrétion intestinale des cellules épithéliales. En outre, le protocole pourrait servir de base à diverses adaptations pour étudier d’autres phénomènes se produisant à la surface de la muqueuse intestinale, et même à d’autres tissus.

Protocole

Le protocole suivant a été approuvé par les autorités locales compétentes d’Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Allemagne). Les souris ont été logées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes.

REMARQUE : L’inhibition de la prénylation GGTase- mediated dans les IECs cause une modification grave de la perméabilité intestinale dans les souris^{d’iΔIEC de} Pggt1b^24. Par conséquent, ce modèle de souris a été utilisé pour démontrer comment le protocole peut être utile pour étudier les défauts de la barrière intestinale. Cependant, ce protocole pourrait être utilisé pour l’étude de n’importe quelle autre ligne de souris.

1. Préparation chirurgicale et coloration intestinale de muqueuse de souris

REMARQUE : La préparation chirurgicale est basée sur les protocoles précédemment décrits^25. Gardez la souris anesthésiée sous une lampe rouge pendant la préparation chirurgicale, afin d’éviter une baisse de température corporelle.

1. Anesthésier la souris par injection intraperitoneal de kétamine/xylazine (96 mg/kg de kétamine; et 12,8 mg/kg de xylazine). Vérifiez l’anesthésie en vérifiant l’absence d’un réflexe de paupière.
2. Appliquer la crème de protection des yeux à l’aide d’un bourgeon de coton.
3. Faire une incision (1 cm) sur la zone ventrale gauche à l’aide de forceps standard et de ciseaux fins droits.
4. Extérioriser un segment de l’intestin (5-7 cm, environ).
5. Ouvrez le segment intestinal extériorisé longitudilement par électrocauterization du côté antimesentrique.
6. Exposer la muqueuse et rincer sous peu avec une solution saline pour enlever la teneur en matières fécales.
   REMARQUE : En option, appliquez la xylazine directement sur l’intestin pour éviter les artefacts de mouvement dus à la péristase.
7. Tacher la surface de la muqueuse intestinale avec de l’acriflavine et du rhodamine-B dextran (10 kDa).
   1. Appliquer la solution acriflavine de 1 mg/mL (100 μL) par pipetting goutte à goutte sur la muqueuse et incuber pendant 3 min. Lavez le reste de la solution avec PBS.
   2. Appliquer la solution rhodamine-dextran de 2 mg/mL (100 μL) par pipetting goutte à goutte sur la muqueuse et incuber pendant 3 min. Lavez le reste de la solution avec PBS.
      REMARQUE : En option, retirer le sang de la préparation à l’aide de coton aseptique.
8. Déposer la sulfpine anesthésiée de souris sur une glissière de couverture montée dans une chambre rincée avec une solution saline préchauffée (37 °C).
   REMARQUE : Le segment intestinal ouvert est ensuite placé surface luminale vers le bas, sur la glissière de couverture.
9. Placez la préparation (souris anesthésiée dans la chambre) sur l’étape du microscope inversé.
10. Couvrir l’animal d’un tampon isothermal (environ 37 °C).
11. Procéder immédiatement à la microscopie intravitale.
    REMARQUE : Gardez la préparation chirurgicale rincée avec une solution saline préchauffée pour éviter la déshydratation des tissus et la mort cellulaire.

2. Microscopie intravitale

REMARQUE : Effectuez l’étape 2.1 avant de commencer la préparation chirurgicale, afin d’éviter de longs temps d’attente entre l’anesthésie, la chirurgie et l’acquisition d’images. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’anesthésiques peuvent être administrées à des animaux préparés chirurgicalement pour les maintenir sous anesthésie pour les expériences d’imagerie.

1. Installez le microscope CLSM.
   1. Démarrez le microscope CLSM en allumer la base du microscope et la boîte du scanner. Allumez l’ordinateur en appuyant sur le bouton Démarrer.
   2. Lancez le logiciel d’acquisition d’images (par exemple, LAS X) en cliquant deux fois sur l’icône. Sélectionnez la configuration appropriée (Configuration : machine ; Microscope: DMI6000) et cliquez sur OK.
      1. Définissez la résolution appropriée. Aller à configuration | Matériel | Résolution | Peu de profondeur. Sélectionnez 12.
   3. Rendez-vous au menu Acquisition. Sélectionnez xyzt pour le mode d’acquisition d’image à partir du menu drop-down. Sélectionnez l’objectif dans le menu drop-off (20x ou 40x).
   4. Concevoir le paramètre d’acquisition séquentiel. Cliquez sur Seq. Ajouter une deuxième séquence, en cliquant sur le bouton ajouter (+). Sélectionnez Entre les images.
      1. Configurer la séquence 1 (détection de l’acriflavine; 416 nm excitation; émission de 514 nm). Allumez la boîte laser visible. Activez le PMT1 (ON). Décrivez la fenêtre de longueur d’onde d’émission (490-550 nm).
      2. Configurer la séquence 2 (détection du rhodamineB-dextran; excitation de 570 nm; 590 nm, émission). Allumez la boîte laser visible. Activez le PMT2 (ON). Décrivez la fenêtre de longueur d’onde d’émission (550-760).
   5. Activez les lasers correspondants (488 et 552). Aller à configuration | Lasers. Activer les lasers 488 et 552 nm (activer).
2. Ajustez le paramètre aux caractéristiques spécifiques de l’expérience actuelle.
   1. Activez la source lumineuse (puissance de presse). Placez la préparation (souris anesthésiée dans la chambre) au stade du microscope et modifiez la position xy jusqu’à ce que l’axe d’éclairage soit concentré sur la préparation des tissus.
   2. Sélectionnez le champ d’intérêt à l’aide de la source lumineuse standard et des oculaires.
      1. Sélectionnez le cube de filtre (I3). Ouvrez l’obturateur. Concentrez-vous sur la surface de la muqueuse intestinale en utilisant la macro- et micro-roue. Recherchez une zone où plusieurs villosités peuvent être visualisées dans le champ de vision en changeant la position XY.
   3. Vérifiez que la coloration rhodamine-dextran est également visible dans cette zone. Changer le cube de filtre (N2.1). Vérifiez l’image à travers les oculaires.
   4. Démarrez l’acquisition d’images CLSM à partir du logiciel. Optimisez les paramètres pour les deux séquences.
      1. Sélectionnez Séquence 1. Ajustez la puissance laser, le gain et le décalage pour la séquence 1.
      2. Sélectionnez Séquence 2. Ajustez la puissance laser, le gain et le décalage pour la séquence 2.
   5. Définissez la plage z stack.
      1. Ouvrez le menu de drop-off Z-stack. Concentrez-vous sur la surface de la muqueuse à l’aide du contrôle de l’axe z. Appuyez sur Commencer.
      2. Concentrez-vous sur la limite inférieure où le signal est encore détectable. Appuyez sur Fin.
      3. Décrivez les nombres de piles z (10). Évitez les laps de temps de plus de 2 min pendant deux temps consécutifs.
   6. Définissez les paramètres de temps. Allez au menu Time. Cliquez sur Minimiser. Sélectionnez Acquérir jusqu’à ce qu’il soit arrêté.
   7. Définissez la moyenne de la ligne. Sélectionnez Seq 1. Sélectionnez Ligne Moyenne 2. Sélectionnez Seq 2. Sélectionnez Ligne Moyenne 2.
3. Acquérir des images correspondantes.
   1. Sélectionnez format (1024 x 1024) et vitesse (400). Appuyez sur Démarrer.
   2. Appuyez sur Arrêtez après le temps d’acquisition d’image désiré.
4. Enregistrez le fichier. Aller au projet. Cliquez à droite sur le fichier correspondant. Appuyez sur Enregistrer comme.
   1. Nommez le fichier de façon appropriée. Sélectionnez le dossier adéquat. Appuyez sur Enregistrer.
5. Euthanasier l’animal (dislocation cervicale) et recueillir des tissus pour une analyse ultérieure, si nécessaire.

3. Analyse d’image : Déterminer le taux d’excrétion cellulaire et l’épithélium intestinal

1. Taux d’excrétion cellulaire
   1. Lancez le logiciel d’acquisition d’images.
   2. Allez à des projets ouverts. Sélectionnez le fichier approprié.
   3. Définissez le temps total d’acquisition d’images.
      1. Sélectionnez la dernière pile z complète. Sélectionnez la dernière position Z à partir du point de temps précédemment sélectionné. Lire l’heure dans le coin inférieur droit de l’écran (temps total d’acquisition d’images).
   4. Sélectionnez un villus.
      1. Sélectionnez la position appropriée de la pile Z (surface du villus, mais suffisamment profonde pour éviter l’interférence avec les cellules déjà hangar et d’autres composants présents au lumen).
      2. Mesurer la longueur de la membrane basale. Sélectionnez l’outil règle. Divisez le villus en plusieurs lignes pour couvrir ou dessiner tout le périmètre villus. Ajouter les différentes valeurs (longueur totale de la membrane basale). Supprimez les segments de l’outil Ruler.
   5. Comptez le nombre d’événements qui se produisent pendant toute la durée de l’acquisition de l’image.
      1. Divisez le villus en segments d’une taille adéquate. Analyser la séquence des événements/segment en glissant la barre à travers les différents points de temps. Annoter les événements identifiés d’excrétion cellulaire.
   6. Calculer le nombre d’événements d’excrétion/temps/longueur de la membrane basale, ce qui indique le taux d’excrétion cellulaire. Comptez jusqu’à 5 villosités/vidéo et au moins deux vidéos/souris. Calculez la moyenne de ces 10 mesures.
2. Fuite
   1. Sélectionnez un villus.
   2. Sélectionnez la position appropriée de la pile Z (surface du villus, mais suffisamment profonde pour éviter l’interférence avec les cellules déjà hangar et d’autres composants présents au lumen). Comptez le nombre total de cellules épithéliales/villus.
   3. Compter le nombre de points de fuite (présence paracellulaire de rhodamine dextran. Cet événement est transitoire, qui peut être confirmé en vérifiant les photos acquises antérieures et ultérieures).
   4. Calculer le nombre de fuites/nombre total de cellules épithéliales. Analyser 10 villus/sample/video différents et calculer le nombre moyen de fuites et de cellules perméables/villus.

Résultats

Le protocole présenté ici décrit une approche microscopie intravitale basée pour visualiser la fuite épithéliale intestinale et observer la performance d’excrétion cellulaire dans l’intestin en temps réel. En bref, les souris sont anesthésiées et soumises à la préparation chirurgicale afin d’exposer la surface de la muqueuse de l’intestin grêle. Les CCI sont ensuite tachés par application topique d’acriflavine; tandis que la rhodamine luminale B-dextran est utilis?...

Discussion

Bien que techniquement difficile, la méthodologie basée sur la microscopie intravitale représente une approche expérimentale unique pour visualiser le processus cellulaire très dynamique en temps réel, comme les performances d’excrétion cellulaire. Jusqu’à présent, il n’existe pas d’approche expérimentale alternative pour visualiser l’extrusion cellulaire in vivo. Nous croyons que ce protocole peut contribuer à la description des divers processus cellulaires jouant un rôle dans le maintien de l’ho...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422