Essai combiné de formation conditionnelle et de formation de sphère adapté pour étudier un gène associé à la stemness des cellules souches du cancer gastrique dérivés par le patient

Résumé

Dans ce protocole, nous présentons une conception expérimentale utilisant un système conditionnel d’effondrement et un essai adapté de formation de sphère pour étudier l’effet de la clusterine sur la tige des GCSE dérivés du patient. Le protocole peut être facilement adapté pour étudier la fonction in vitro et in vivo des gènes associés à la stemness dans différents types de CSC.

Résumé

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont impliquées dans l’initiation, le développement et la récurrence des tumeurs après le traitement, et sont devenues le centre d’attention de nombreuses études au cours des dernières décennies. Par conséquent, il est important de développer des méthodes pour étudier le rôle des gènes clés impliqués dans la tige des cellules cancéreuses. Le cancer gastrique (GC) est l’un des types de cancers les plus courants et mortels. Les cellules souches du cancer gastrique (GCSC) sont considérées comme la racine de la rechute du cancer gastrique, des métastases et de la résistance aux médicaments. Comprendre la biologie des CSG est nécessaire pour faire progresser le développement de thérapies ciblées et éventuellement pour réduire la mortalité chez les patients. Dans ce protocole, nous présentons une conception expérimentale utilisant un système conditionnel d’effondrement et un essai adapté de formation de sphère pour étudier l’effet de la clusterine sur la tige des GCSE dérivés du patient. Le protocole peut être facilement adapté pour étudier la fonction in vitro et in vivo des gènes associés à la stemness dans différents types de CSC.

Introduction

Le cancer gastrique (GC) est l’un des types les plus communs et mortels de cancers¹. Malgré les progrès de la chirurgie combinée, la chimiothérapie et la radiothérapie dans la thérapie GC, le pronostic reste faible et le taux de survie à cinq ans est encore très faible². La récurrence et la métastase sont les principales raisons qui causent les décès post-traitement.

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont un sous-ensemble de cellules cancéreuses qui possèdent la capacité de se renouveler et de générer les différentes lignées cellulaires qui reconstituent la tumeur³. On croit que les CSC sont responsables de la rechute et des métastases cancéreuses en raison de leurs capacités d’auto-renouvellement et d’ensemencement de nouvelles tumeurs, ainsi que leur résistance aux chimio et radiothérapies traditionnelles⁴. Par conséquent, le ciblage des CSC et l’élimination des CSC offrent un potentiel intéressant pour améliorer le traitement et réduire la mortalité des patients atteints de cancer.

Les CSC ont été isolés de nombreux types de tumeurs solides⁵. En 2009, les cellules souches du cancer gastrique (GCSC) isolées des lignées cellulaires du cancer gastrique humain ont été décrites à l’origine par Takaishi et coll.⁶. Chen et ses collègues ont d’abord identifié et purifié les GCSC à partir des tissus tumoraux gastriques humains (GAC)⁷. Ces résultats offrent non seulement l’occasion d’étudier la biologie des CSGC, mais ils confèrent également une grande importance clinique.

Une caractéristique particulière des CSC est leur capacité à former une sphère⁸. Les cellules simples sont plaquées dans des conditions nonadherentes à faible densité, et seules les cellules possédées avec l’auto-renouvellement peuvent se développer en un solide, cluster sphérique appelé une sphère. Ainsi, l’essai de formation de sphère a été considéré comme l’essai d’étalon-or et largement utilisé pour évaluer le potentiel d’auto-renouvellement des cellules souches in vitro.

L’interférence de l’ARN (RNAi) est un outil de recherche puissant pour étudier la fonction génique par l’effondrement d’un gène spécifique⁹. Cependant, les technologies stables à long terme de knockdown de gène ont certaines limitations, telles que le défi d’explorer la fonction d’un gène qui est essentiel pour la survie cellulaire. Les systèmes RNAi conditionnels peuvent être utiles pour la régulation des gènes désirés d’une manière temporelle et/ou spéciale contrôlée par l’administration d’un agent inducteur. Les systèmes inducibles de tétracycline (Tet) sont l’un des systèmes RNAi conditionnels les plus largement utilisés¹⁰. Les systèmes inducibles de Tet peuvent induire le silençage de gène cible en contrôlant l’expression de shRNA sur addition d’un inducteur exogène (préférentiellement doxycycline, Dox). Les systèmes tet-inductibles peuvent être divisés en deux types : les systèmes Tet-On ou Tet-Off. L’expression de shRNA peut être activée (Tet-On) ou désactivée (Tet-Off) en présence de l’inducteur. Dans le système Tet-ON sans inducteur, le répresseur tet (TetR) exprimé de façon constitutive se lie à la séquence de l’élément tet-responsible (TRE) contenant un promoteur dépendant du Tet-responsive Pol III pour l’expression shRNA, réprimant ainsi l’expression du shRNA. Tandis qu’à l’ajout de Dox, le TetR est séquestré loin du promoteur Tet-responsive Pol III-dépendant. Cela facilite l’expression de l’ARSh et conduit à l’effondrement des gènes.

Le protocole décrit ici utilise un système de shRNA fonctionnel tétracycline-inductible et un essai de formation de sphère adapté pour étudier la fonction de clusterine dans les GCSC dérivés du patient. Clusterin a été identifié comme une nouvelle molécule clé pour maintenir la stemness et la survie des GCSCs dans une étude précédente¹¹. Nous utilisons le protocole décrit pour étudier les effets de la clusterine dans l’auto-renouvellement des GCSE. Cette méthodologie s’applique également à d’autres types de cellules souches cancéreuses.

Protocole

Toutes les expérimentations utilisant des cellules souches cancéreuses gastriques dérivées du patient décrites ici ont été approuvées par le comité éthique local⁷.

1. Culture de cellules souches du cancer gastrique

1. Préparation des GCSCs support de culture complet
   1. Préparer le milieu de culture complet des GCSC en ajoutant un milieu frais DME/F12 avec les ingrédients essentiels suivants : 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insuline/Transferrin/Sélénite de sodium, 0,2% glucose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Acide aminé non essentiel, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO₃, 10 μM thioglycérol, 100 IU/mL pénicilline et 100 μg/M streptomycincine. Filtrer et stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
      REMARQUE : Le milieu de culture complet des GCSE est recommandé de préférence pas plus de deux semaines à 4 °C.
2. Rétablissement des CGSC et de la culture
   NOTE : Les GCSC ont été obtenus comme suit : Les échantillons de tumeur ont été soumis à la dissociation mécanique et enzymatique. Les suspensions à cellule unique ont été obtenues en filtrant avec le filet de nylon à partir d’une suspension bien dispersée. Les cellules cancéreuses qui en ont résulté ont été cultivées dans les GCSCs Complete Culture Medium, et certaines cellules se sont développées pour former des sphères. Ces sphères ont ensuite été soumises à une dissociation enzymatique, et les GCSC peuvent être obtenus par tri cytofluorométrique de la population cellulaire tachée de marqueurs CD44/CD54. Le protocole détaillé et les tests fonctionnels des CGSC ont été signalés⁷.
   1. Les GCSE préchauffés complètent le milieu de culture à 37 °C pendant au plus 30 min.
   2. Décongeler les GCSC du stockage de l’azote liquide et décongeler rapidement les cryocials dans un bain d’eau de 37 °C. Continuez à tourbillonner les flacons jusqu’à ce que l’ensemble du contenu fond totalement.
      REMARQUE : Décongeler rapidement les cellules congelées (<1 min) dans un bain d’eau de 37 °C.
   3. Transférer l’ensemble du contenu des cryocials dans un tube de centrifugeuse de 15 mL contenant 10 ml de milieu de culture complète gcscs. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à RT.
   4. Remplacer soigneusement le supernatant et suspendre le granulé cellulaire dans 10 mL de GCSE frais complètent le milieu. Plaquez la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri de 100 mm. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur de CO₂ de 5 % et ajouter 5 mL de milieu frais complet le troisième jour.
3. Sous-culture des tumeurs GCSCs
   REMARQUE : Les GCSC du centre de tumeurs n’ont que suffisamment de nutriments avant que la taille des sphères ne grandissent jusqu’à 80-100 μm de diamètre. Une fois que des sphères sombres et basses de réfraction apparaissent (environ 6 jours de culture), il est nécessaire de sous-cultures les tumeursphères.
   1. Secouez le plat doucement et transférez le milieu de culture de tumeurs GCSCs (le milieu et les tumeurs non adhérentes) dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 mL. Pour les grands volumes moyens, de plus grands tubes de centrifugeuse peuvent être nécessaires.
   2. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min et disposer soigneusement du supernatant. Après la centrifugement, une boulette blanc cassé sera visible.
   3. Ajouter 2 mL de solution de dissociation cellulaire pour resuspender le granulé pour une dissociation mécanique et enzymatique à 37 °C. Pipet doucement de haut en bas 10 fois toutes les 2-3 min dans la procédure de digestion pour briser les sphères en dehors jusqu’à ce que les tumeurs sont dispersées dans la suspension à cellule unique. Ce processus de dissociation totale est recommandé pour être inférieur à 15 min.
      REMARQUE : Effectuez une vérification visuelle au microscope pour confirmer qu’il ne reste plus de grandes sphères ou d’agrégats cellulaires.
   4. Ajouter 10 mL de gcses frais préchauffés milieu de culture complète (5x le volume de la solution de détachement cellulaire) pour mettre fin à la procédure de digestion et la centrifugeuse à 800 x g à RT pendant 5 min.
   5. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules avec 1 mL de GCSE frais préchauffés milieu de culture complète. Ensemencez un nombre approprié de cellules dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm avec 10 mL de GCSE frais préchauffés milieu de culture complète et incuber à 37 °C, 5% CO₂.
   6. Refeed tumeursphères cultures après 3 jours en ajoutant 5 mL de frais pré-réchauffé moyen complet. Après 6 jours, les cellules de passage lorsque les tumeurs augmentent jusqu’à 80-100 μm de diamètre.
4. Cryoconservation des GCSC
   REMARQUE : Ne cryoconservez pas les cellules des GCSE en ajoutant directement des cellules moyennes aux tumeurs. Les tumeurs des GCSE doivent être digérées en cellules individuelles afin que l’agent protecteur cellulaire puisse entrer dans chaque cellule pour assurer le stockage stable à long terme des cellules. Assurez-vous que les cellules sont en bonne santé et sans contamination.
   1. Récolte GCSCs tumeursphères. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min.
   2. Jetez le supernatant et ajoutez 2 mL de solution de dissociation cellulaire pour dissocier les tumeurs du GCSC à 37 °C. Terminez la procédure de digestion en ajoutant 10 mL de GCSCs milieu de culture complète.
   3. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min et collecte de GCSE unique.
   4. Suspendez doucement les GCSE à l’aide d’un milieu cryoconservateur sans sérum. La concentration finale recommandée est de 5 x 10⁵ à 5 x 10⁶ cellules/mL.
   5. Dispensez la suspension cellulaire en 1 mL aliquots en flacons cryogéniques marqués.
   6. Placez immédiatement les cryocials contenant les cellules dans une chambre isopropanol et rangez-les à -80 °C. Transférer les flacons à l’azote liquide le lendemain pour un stockage à long terme.

2. Génération de lignes incducables knockdown GCSCs

ATTENTION : Les lentivirus recombinants ont été désignés comme organismes de niveau 2 par le National Institute of Health et le Center for Disease Control. Les travaux impliquant le lentivirus nécessitent le maintien d’une installation de biosécurité de niveau 2, étant donné que les supernatants viraux produits par ces systèmes lentiviraux pourraient contenir un virus recombinant potentiellement dangereux.

1. Génération de particules de lentivirus
   1. Synthétiser 2 vecteurs lentivirals portant un shRNA inductible ciblant le clusterin humain et un vecteur lentiviral non ciblant (GV307) de GeneChem basé sur la conception du tableau 1 (vecteur GV307 contient : TetiIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycine).
   2. Semences 4 x 10⁶ 293T cellules d’emballage lenti-virale dans un plat Petri de 100 mm avec 10 mL de DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal.
   3. Incuber les cellules 293T pendant la nuit à 37 °C, 5% CO₂. Assurez-vous que la densité cellulaire 293T est d’environ 50-80% confluent le jour de la transfection.
   4. Apportez le milieu de sérum réduit à la température ambiante et préparez le tube A et le tube B comme décrit au tableau 2.
   5. Transférer le tube A dans le tube B, bien mélanger et incuber les complexes pendant 20 min à température ambiante pour préparer des complexes lipidiques-ADN.
   6. Retirez 5 mL de milieu, avant d’ajouter le complexe lipidique-ADN, laissant un total de 5 mL.
   7. Ajouter 5 mL de complexe lipidique-ADN dans le plat de culture dropwise et doucement tourbillonner le plat pour distribuer le complexe.
      REMARQUE : Distribuez soigneusement du liquide contre le mur du plat pour éviter de déranger les cellules 293T.
   8. Plat de culture incuber pour 24 h à 37 °C, 5% CO₂.
   9. Après 24 heures après la transfection, retirez soigneusement le milieu de transfection et remplacez doucement par 10 mL de DMEM préchauffé complété par 10% FBS. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Tous les supernatants et les pointes doivent être traités avec 10% d’eau de Javel avant l’élimination.
   10. Environ après 48 heures après la transfection, récoltez 10 mL de supernatants contenant du lentivirus.
       REMARQUE : Tous les vaisseaux et bouts de culture cellulaire doivent être traités avec 10 % d’eau de Javel avant l’élimination.
   11. Filtrer le supernatant lentiviral à l’aide d’un filtre à pores de 0,45 μm pour enlever les débris cellulaires.
       REMARQUE : Tous les filtres et seringues doivent être traités avec 10 % d’eau de Javel avant l’élimination.
   12. Transférer le supernatant clarifié dans un récipient stérile, ajouter le concentrateur Lenti-X (1/3 volume de supernatant clarifié) pour mélanger par inversion douce.
   13. Incuber le mélange à 4 °C pendant la nuit.
   14. Échantillons de centrifugeuse à 1 500 x g pendant 45 min à 4 °C. Après la centrifugation, et le granulé blanc cassé sera visible. Retirez soigneusement le supernatant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
       REMARQUE : Tous les supernatants et les pointes doivent être traités avec 10% d’eau de Javel avant l’élimination.
   15. Resuspendez doucement le granulé dans 1 mL de DMEM complété par 10% FBS comme stock de virus, stocker à -80 °C.
2. Génération de lignées cellulaires transfectées stables
   1. Semences 6 x 10⁶ GCSC dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 10 mL DMEM complétées par 10% FBS pour 24 h à 37 °C, 5% CO₂ (confluence de 70-80% avant l’infection).
   2. Augmenter le milieu dans le plat, ajouter les particules lentivirales concentrées diluées avec 4 mL de milieu complet DMEM contenant du réactif polybrene (5 μg/mL) dans le plat. Incuber pendant 18 h à 37 °C, 5 % de CO₂.
      REMARQUE : La concentration optimale de polybrene dépend du type de cellules et peut devoir être mise à l’essai à différentes concentrations pour décider des concentrations efficaces. Dans le cas contraire, il peut être déterminé empiriquement, généralement dans la gamme de 2-10 μg/mL. Tous les tubes et bouts doivent être traités avec 10% d’eau de Javel avant l’élimination.
   3. Changer le milieu, remplacer par 10 mL de DMEM par 10% FBS moyen et incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% CO₂.
      REMARQUE : Tous les supports et les pointes doivent être traités avec 10% d’eau de Javel avant l’élimination.
   4. Remplacer le supernatant par des débris cellulaires, remplacer par du DMEM frais complété par un milieu FBS à 10 % contenant de la puromycine (2,5 μg/mL) et incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO₂. Remplacez ensuite le DMEM frais complété par un support FBS de 10 % contenant de la puromycine (5 μg/mL) et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pour 24 h supplémentaires.
   5. Rincer les GCSE adhérents deux fois avec 5 mL de DPBS sans calcium et magnésium.
   6. Dissocier les GCSE avec 1 mL de solution de dissociation cellulaire préchauffée et incuber 2-3 min à 37 °C.
   7. Ajouter 5 mL de GCSE frais préchauffés milieu de culture complète à la suspension cellulaire.
   8. Distribuer 3 ml dans un tube centrifuge de 15 ml (tube A) pour cryoconserver les cellules, et les 3 ml autres dans un tube centrifuge de 15 ml (tube B) pour induire par la doxycycline.
   9. Tube de centrifugeuse A et tube B à 800 x g pendant 5 min.
   10. Resuspendez le granulé du tube A avec 1 ml de milieu cryoconservateur sans sérum, transférez le flacon à -80 °C pendant la nuit et retirez-le dans le stockage d’azote liquide.
   11. Remplacer le supernatant et resuspender les cellules du tube B dans 1 mL de GCSE frais préchauffés milieu de culture complète. Ensemencez un nombre approprié de cellules dans un nouveau plat Petri de 10 mL de 10 mL frais préchauffés GCSCs milieu de culture complète avec doxycycline (Dox) (2,5 μg/mL) et incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% CO₂.
       REMARQUE : La concentration optimale de Dox peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre. Chaque lignée cellulaire doit être testée à différentes concentrations de Dox pour décider des concentrations efficaces de KD et de la toxicité sur les cellules.
   12. Confirmer la répression stable des clusterins dans les GCSC par blotting occidental.

3. Essai de formation de sphère

1. Décongeler les lignes de GCSCs inducibles congelées (voir l’étape 1.2).
2. Déterminer la densité cellulaire viable d’un échantillon de 10 μL à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.
3. Ajuster le volume avec le milieu de culture complet préchauffé des GCSE pour obtenir une concentration de 2 x 10⁴ cellules viables/mL.
4. Distribuer dans 3 nouveaux puits de plaque de culture ultra-faible fixation de 96 puits (0,1 mL/puits) par groupe.
5. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂. La formation de sphère devrait se produire dans les 3-10 jours. Surveiller et enregistrer la visualisation de la formation de tumeurs tous les 2 jours.
   REMARQUE : Le milieu n’est pas recommandé pour être changé en cas de perturbation de la formation de tumeursphères. Ces tumeurs devraient être facilement distinguées des cellules simples et agrégées.
6. Déterminer les résultats de la formation de tumeurs en évaluant les tailles des tumeurs formées à l’aide d’un logiciel d’imagerie.

Résultats

Les cellules souches de cancer gastrique de l’adénocarcinome gastrique humain primaire ont été cultivées dans le milieu de culture sérique-libre. Après 6 jours, les cellules se sont étendues du phénotype unicellulaire (figure 1A)pour former de grandes sphères (figure 1B).

Pour évaluer la fonction de clusterin dans les GCSC, ...

Discussion

GC est la troisième cause de décès lié au cancer dans le monde. Les CSGC sont essentiels dans la rechute du cancer gastrique, la métastase et la résistance aux médicaments. L’utilisation des GCSE de patients atteints de cancer gastrique nous permettra d’explorer leur point faible et de développer les médicaments de ciblage pour le traitement des patients gc.

L’essai de formation de sphère est une méthode utile pour examiner le potentiel d’auto-renouvellement des cellules sou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1