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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons une méthode pour identifier les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans le formaldéhyde-fixe et paraffin-intégré thrombi cardiogénique félin utilisant la récupération d’antigène induite par la chaleur et un protocole d’immunolabeling double.

Résumé

Les pièges extracellulaires neutrophiles (NET), composés d’ADN sans cellules (CFDNA) et de protéines comme les histones et l’élastase neutrophile (NE), sont libérés par les neutrophiles en réponse à une inflammation systémique ou à des agents pathogènes. Bien qu’il ait déjà été démontré que les TTRO augmentent la formation de caillots et inhibent la fibrinolyse chez l’homme et les chiens, le rôle des NET chez les chats atteints de thromboembolisme artériel cardiogénique (CATE), une complication potentiellement mortelle secondaire à la cardiomyopathie hypertrophique , est inconnu. Une méthode normalisée pour identifier et quantifier les NET dans les thrombi artéraux cardiogéniques chez les chats fera progresser notre compréhension de leur rôle pathologique dans CATE. Ici, nous décrivons une technique pour identifier des NET dans les thrombi formaldéhyde-fixes et paraffin-incorporés dans la bifurcation aortique, extraite pendant l’autopsie. Après la deparaffinisation avec le xylène, les sections aortiques ont subi la récupération indirecte d’antigène thermique-induite. Les sections ont ensuite été bloquées, perméabilisées, et les NET ex vivo ont été identifiés par la colocalisation de l’ADN sans cellule (CFDNA), de l’histone H3 (citH3) et de l’élastase neutrophile (NE) utilisant la microscopie d’immunofluorescence. Pour optimiser l’immunodétection des NET dans thrombi, l’autofluorescence des éléments tissulaires a été limitée en utilisant un processus d’étanchéité de l’autofluorescence avant la microscopie. Cette technique pourrait être un outil utile pour étudier les TNI et la thrombose chez d’autres espèces et offre de nouvelles perspectives sur la pathophysiologie de cette condition complexe.

Introduction

Les chats atteints de cardiomyopathie hypertrophique sont à risque de complications thromboemboliques potentiellement mortelles1,2. En dépit de la morbidité et de la mortalité élevées liées au thromboembolism artériel cardiogénique félin (CATE), la pathophysiologie sous-jacente de CATE chez les chats est mal comprise. Il existe également des outils diagnostiques et thérapeutiques limités pour traiter et identifier les chats à risque de cette condition dévastatrice3.

En plus de son rôle dans l’immunité innée, il a été démontré que les neutrophiles jouent un rôle dans la thrombose en libérant des pièges extracellulaires neutrophiles (NET), qui sont des réseaux web d’ADN sans cellules (CFDNA) incrustés d’histones et de protéines granulaires comme le neutrophile elastase (NE) et le myeloperoxidase. Les neutrophiles subissent la formation de NETs en réponse à l’inflammation systémique, la rencontre directe avec des agents pathogènes, et l’interaction avec les plaquettes activées4,5,6,7. Chez les chiens, l’ADN dérivé du neutrophile a été montré pour inhiber la lyse de caillot, tandis que les protéines NET accélèrent la formation de caillots. La capacité des NET à piéger les cellules circulantes et les composants de coagulation est également la clé de leurs propriétés thrombogéniques8,9,10,11,12.

Les NET sont détectés par colocalisation des protéines neutrophiles extracellulaires, des histones, et de l’ADNC. Pour cette raison, l’identification et la quantification des NET dans les tissus fixes par immunofluorescence des tissus déparaffinisés est supérieure à l’hématoxyline traditionnelle et la tache d’éosine (H et E) utilisant la microscopie de champ lumineux4,5. Plusieurs études humaines utilisant la microscopie d’immunofluorescence ont identifié des NET comme composants structurels de thrombi coronaires, thrombi de course cérébrale, atherothrombose, et thrombi veineux13,14,15,16,17. À ce jour, aucune méthode normalisée permettant de détecter et de quantifier les TNN dans les thrombi félins n’a pas été décrite. Puisque l’identification des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins peut faciliter la recherche translationnelle future dans les NET et la thrombose, nous décrivons des techniques d’identification et d’évaluation de NET dans les thrombi artériels paraffine-embeddeds chez les chats.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Davis. Des nécropsies et des biopsies des tissus ont été effectuées avec le consentement des propriétaires.

1. Fixation des tissus, intégration et sectionnement

  1. Disséquer la bifurcation aortique, y compris l’aorte descendante, l’artère fémorale, et les artères iliaques communes(figure 1A), peu de temps après l’euthanasie ou la mort sans cruauté. Disséquer émoussé le fascia (figure 1B) avant de le submerger complètement dans 10% de formaline tamponnée neutre pour un minimum de 24 h et pas plus de 48 h.
  2. Pour déshydrater l’échantillon, d’abord immergé dans 10% de formaline tamponnée neutre chauffée à 37 oC pendant 1 h. Ensuite, submergez dans des concentrations croissantes d’éthanol chauffé à 37 oC (70%, 95%, 100%) 2x pour 1 h chacun. Enfin, sans rinçage, immerger 2x dans 100% toluene chauffé à 37 oC pour 1 h chacun.
  3. Ajouter la paraffine chauffée à 62 oC et laisser la paraffine se solidifier complètement toute la nuit.
  4. Section 2 à 3 m du tissu incorporé par la paraffine à l’aide d’une microtome et place sur des lames de verre chargées positivement. Entreposez les tissus sectionnés à -80 oC jusqu’à une analyse plus approfondie.

2. Déparaffinisation, réhydratation et récupération d’antigène induite par la chaleur

  1. Pour effectuer la déparaffinisation et la réhydratation des sections sur des toboggans en verre, placez les glissières en verre dans les grilles et procédez dans l’ordre suivant :
    1. Submergez complètement dans 100% de xylène pendant 3 min. Répétez cette étape 2x. Ne pas rincer entre les étapes.
    2. Submerger complètement dans les concentrations décroissantes d’éthanol (100%, 95%, 70%) à température ambiante (RT), 3x pendant 3 minutes chacun. Ne pas rincer entre les étapes.
    3. Submerger complètement dans de l’eau déionisée pendant 2 min. Répéter.
  2. Placez les sections dans la ligne saline tris-tamponnée avec 0,1 % d’interpolation (TBST, pH - 7,6) pour 2 à 3 min.
  3. Remplissez le réservoir d’eau déionisée chauffée à 100 oC. Laisser la chambre de vapeur s’équilibrer pendant 20 min.
    REMARQUE : La récupération d’antigène induite par la chaleur est mieux effectuée avec le chauffage indirect généré par un vapeur avec un réglage de température prédéfini, tel qu’un vapeur de nourriture.
  4. Chauffer la solution de récupération d’antigène disponible dans le commerce contenant Tris et EDTA (pH 9) à 95-97 oC sur une plaque chaude à température contrôlée avec une agitation constante. Assurez-vous qu’il ne fait pas bouillir.
    REMARQUE : La solution doit devenir trouble une fois réchauffée.
  5. Verser la solution chauffée de récupération d’antigène dans un récipient de toboggan et placer le récipient dans la chambre du vapeur. Laissez la solution de récupération d’antigènes équilibrer à la température du vapeur pendant 3 à 4 min. Assurez-vous que la température de la chambre est de 95 oC.
  6. Submergez complètement les glissières dans la solution de récupération d’antigène chauffée et continuez l’application du chauffage externe via le vapeur pendant 20 min.
  7. Retirer le récipient de la glissière du vapeur et laisser refroidir les glissières et la solution de récupération d’antigènes pour RT. Stocker la solution diluée de récupération d’antigènes à 4 oC et réutiliser jusqu’à 2x si nécessaire.
  8. Laver les diapositives 3x avec TBST pendant 5 min.

3. Immunolabeling et autofluorescence étanchéité

REMARQUE : Le tableau 1 détaille la composition des tampons de blocage utilisés dans les étapes suivantes.

  1. Sections incubantes dans Blocking Buffer 1 pour 2 h à RT sous bascule douce (30-50 tr/min). Sceller avec un film de paraffine pour éviter le séchage.
  2. Sans lavage, appliquez immédiatement 100 l d’anticorps anti-humains polyclolinés de lapin dilué d’histone H3 (citH3) (0,03 mg/mL dilués dans le tampon de blocage 1) directement sur la glissière.
  3. Placez un coverlip (24 mm x 40 mm x 0,13 à 0,17 mm) sur chaque section pour permettre une distribution uniforme du mélange d’anticorps.
  4. Incuber de 12 à 16 h à 4 oC avec bascule douce (30 à 50 tr/min). Sceller avec le film de parafilm pour éviter le séchage.
  5. Laver 3x avec TBST pendant 5 min.
  6. Appliquer 100 l d’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa Fluor 488 (dilué à une concentration finale de 0,04 mg/mL ou 1:50 dans Blocking Buffer 1) tel que décrit à l’étape 3.3. Incuber pendant 1 h à RT sous le basculement doux (30-50 tr/min). Protégez les diapositives de la lumière.
  7. Laver avec TBST 3x pendant 5 min.
  8. Sections incubées dans Blocking Buffer 2 pendant la nuit à 4 oC sous le basculement doux (30-50 tr/min). Protégez-vous de la lumière.
  9. Laver avec TBST 3x pendant 5 min.
  10. Sections de bloc dans Blocking Buffer 3 comme décrit dans l’étape 3.3 à RT pour 2 h sous le basculement doux (30-50 tr/min).
  11. Sections incubées avec anticorps ANTI-humains biotinylés de lapin polyclonal (concentration finale de 0,2 g/mL dans le tampon de blocage 3) à 4 oC pour 12-16 h comme décrit dans les étapes 3.2-3.4.
  12. Laver avec TBST 3x pendant 5 min.
  13. Incuber avec Alexa Fluor 594 streptavidin conjugué (diluer à 1:100 ou 0,02 mg/mL dans Blocking Buffer 3) tel que décrit dans les étapes 3,2-3,3 pour 1 h à RT. Protéger de la lumière et sceller avec paraffine pour empêcher le séchage.
  14. Laver avec TBST 1x pendant 5 min.
  15. Appliquer 100 L de mélange de solution d’étanchéité autofluorescence directement sur les sections pendant 1 min comme indiqué par le fabricant.
  16. Laver immédiatement les lames avec TBST 6x pendant 10 min.
  17. Couvrir chaque diapositive de 100 l de 300 nM DAPI pendant 5 minutes dans l’obscurité.
  18. Laver avec TBST pendant 3 min. Répétez-le pour un total de 5x.
  19. Appliquer une goutte (50 l) de milieu de montage d’antifade, une partie du kit d’étanchéité à l’autofluorescence, directement sur la glissière en verre entourant la section. Placer un coverlip (24 mm x 40 mm x 0,13 à 0,17 mm) doucement sur la section sans créer de bulles.
  20. Laisser les échantillons guérir toute la nuit dans l’obscurité à 4 oC jusqu’à ce que le milieu de montage soit durci pour une analyse microscopique avec des lentilles d’immersion.

4. Identification du piège extracellulaire Neutrophil

REMARQUE : Le protocole suivant utilise un microscope à épifluorescence inversé avec une caméra CCD numérique de 1 280 x 960 (voir Tableau des matériaux).

  1. Pour localiser thrombi, numériser cranially à caudally le long de la longueur de l’aorte, la bifurcation aortique, et chaque artère fémorale utilisant la microscopie de contraste de phase avec un objectif de 10x. Un thrombus est un conglomérat de tissus contenant des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes adjacents à l’endothélium sur le contraste de phase et la microscopie de champ lumineux(figure 2A, figure 2B).
  2. Examinez d’abord les sections pour les TNN à l’aide du canal DAPI (excitation 357/44 nm) avec des objectifs 10x et 20x(figure 2C). Notez que l’ADN cfDNA apparaît comme de l’ADN déconstruisé qui n’est pas dans les limites du cytoplasme d’une cellule lorsqu’il est vu sur le contraste de phase ou la microscopie de champ lumineux.
  3. Identifiez l’EN extracellulaire et le citH3 sur les canaux Texas Red (excitation de 585/29 nm, émission de 628/32 nm) et le canal de protéines fluorescentes vertes (excitation de 470/22 nm, émissions de 525/50 nm), respectivement avec des objectifs de 10, 20 et 40x.
  4. Évaluer et analyser les TNI dans un thrombus à l’aide de logiciels disponibles, tels que l’image J (NIH). La formation NET est identifiée en fonction de la colocalisation de l’ADFC, du citH3 extracellulaire et de l’EN comme indiqué précédemment18. Maintenir un temps d’exposition et des gains constants de chaque canal tout au long de l’acquisition d’images afin d’éviter la saturation de l’intensité des pixels.
  5. Cartographiez chaque thrombus en fonction de sa proximité avec l’aorte descendante en le divisant en trois zones égales, avec la zone 1 la plus proche de l’aorte, la zone 3 la plus éloignée de l’aorte et la zone 2 entre les zones 1 et 3). Avec l’opérateur aveuglé à l’état de santé de chaque sujet, prendre au moins dix champs aléatoires dans chaque zone. Caractériser la distribution des TEN dans les thrombi en faisant la moyenne du nombre de champs avec DEST dans chaque zone ou en calculant la zone moyenne d’occupation du NET par zone.

Résultats

Utilisant ce protocole pour la deparaffinisation, la récupération d’antigène induite par la chaleur, et le double immunolabeling des thrombi paraffines-incorporées, nous avons identifié des NET dans le CATE félin pour la première fois. Thrombi dans la bifurcation aortique ont été localisés par microscopie de fluorescence et microscopie de champ lumineux utilisant la coloration standard de H et E et la microscopie de contraste de phase. Sur la microscopie de champ lumineux, les thrombi artériels félins se co...

Discussion

Nous décrivons un protocole pour identifier des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins fixes utilisant un protocole d’immunolabeling double et la microscopie d’immunofluorescence. Bien que seulement les thrombi artérogènes cardiogéniques aient été tachés, en théorie ce protocole pourrait être employé pour d’autres types de thrombi et dans d’autres espèces vétérinaires. L’identification des NET dans les thrombi artériels félins suggère que les TN peuvent jouer un rôle dans la...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L’étude a été soutenue par des fonds de l’Université de Californie, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Les auteurs aimeraient remercier le Dr Kevin Woolard pour l’utilisation du microscope à fluorescence.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugateThermoFisher ScientificCatalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibodyAbcamAb5103
EVOS FL Cell Imaging SystemThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisher ScientificCatalog # A32723
Goat serumJackson Immuno Research LabsCatalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibodyBioss AntibodiesBs-6982R-BiotinRabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40PierceProduct # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slidesThomas ScientificManufacturer No. 1354W-72
Rabbit serumLife TechnologyCatalog # 10510
Target Retrieval SolutionAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400

Références

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