Synthèse des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées, leur conjugaison avec la feroxamine de Siderophore et son évaluation pour la détection des bactéries

Résumé

Ce travail décrit des protocoles pour la préparation des nanoparticules magnétiques, son revêtement avec SiO₂, suivi de sa fonctionnalisation d’amine avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) et sa conjugaison avec la dferoxamine utilisant une moiety succinyl comme lieneur. Une description structurelle profonde de caractérisation et un test de bactéries de capture utilisant Y. enteropolitica pour toutes les nanoparticules intermédiaires et le conjugué final sont également décrits en détail.

Résumé

Dans le présent travail, la synthèse des nanoparticules magnétiques, son revêtement avec SiO₂, suivi de sa fonctionnalisation amine avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) et sa conjugaison avec la dferoxamine, un siderophore reconnu par Yersinia enterocolitica, en utilisant un succinyl moiety comme un linker sont décrits.

Les nanoparticules magnétiques (MNP) de la magnétite (Fe₃O₄) ont été préparées par méthode solcothermale et enduites de SiO₂ (MNP@SiO₂) à l’aide du procédé Stöber suivi d’une fonctionnalisation avec APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Puis, la feroxamine a été conjuguée avec le MNP@SiO₂@NH₂ par couplage carbodiimide pour donner MNP@SiO₂@NH₂@Fa. La morphologie et les propriétés du conjugué et des intermédiaires ont été examinées par huit méthodes différentes, y compris la diffraction des rayons X (XRD), la spectroscopie infrarouge à transformation Fourier (FT-IR), la spectroscopie Raman, la spectroscopie photoélectron à rayons X (XPS), la microscopie électronique de transmission (TEM) et la cartographie des rayons X dispersifs d’énergie (EDX). Cette caractérisation exhaustive a confirmé la formation du conjugué. Enfin, afin d’évaluer la capacité et la spécificité des nanoparticules, ils ont été testés dans un test de capture de bactéries à l’aide de Yersinia enterocolitica.

Introduction

Les méthodes de détection des bactéries utilisant MNP sont basées sur la reconnaissance moléculaire des anticorps, des aptamères, de la bioprotéine, des hydrates de carbone conjugués au MNP par la bactérie pathogène¹. Compte tenu du fait que les siderophores sont reconnus par des récepteurs spécifiques sur la membrane externe des bactéries, ils pourraient également être liés au MNP pour augmenter leur spécificité². Les siderophores sont de petites molécules organiques impliquées dans l’absorption de Fe³⁺ par les bactéries^3,4. La préparation des conjugués entre les siderophores et le MNP ainsi que leur évaluation pour la capture et l’isolement des bactéries n’a pas encore été rapportée.

L’une des étapes cruciales de la synthèse des conjugués de nanoparticules magnétiques avec de petites molécules est la sélection du type de lien ou d’interaction entre elles pour s’assurer que la petite molécule est attachée à la surface du MNP. Pour cette raison, la procédure de préparation du conjugué entre les nanoparticules magnétiques et la feroxamine — le siderophore reconnu par Yersinia enterocolitica— a été axée sur la génération d’une surface modifiable du MNP pour permettre de la relier covalent au siderophore par la chimie carbodiimide. Afin d’obtenir une nanoparticule de magnétite uniforme (MNP) et d’améliorer la nucléation et le contrôle de la taille, une réaction de solvolyse avec de l’alcool benzyle a été effectuée dans un bloc thermique sans secouer⁵. Ensuite, un revêtement de silice a été généré par la méthode Stöber pour conférer la protection et améliorer la stabilité de la suspension des nanoparticules dans les milieux aqueux⁶. Compte tenu de la structure de la feroxamine, l’introduction de groupes d’amines est nécessaire pour produire des nanoparticules appropriées (MNP@SiO₂@NH₂) à conjuguer avec le siderophore. Ceci a été réalisé par condensation de (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) avec les groupes d’alcool présents à la surface des nanoparticules modifiées de silice (MNP@SiO₂) utilisant une méthode de sol-gel⁷.

En parallèle, le complexe de fer feroxamine(III) a été préparé par la complexation de la déféroxamine disponible dans le commerce avec l’acétonate d’acétonate d’acétyl de fer dans la solution aqueuse. N-succinylferoxamine, portant des groupes de succinyl qui agiront comme linkers, a été obtenu par la réaction de la feroxamine avec l’anhydride succinique.

La conjugaison entre MNP@SiO₂@NH₂ et N-succinylferoxamine pour donner MNP@SiO₂@NH_@Fa a été effectuée par la chimie carbodiimide en utilisant comme couplage réactifs benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP) et 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) dans un milieu de base doux pour activer le groupe acide terminal dans N-succinylferoxamine⁸.

Une fois que les MNP ont été caractérisés, nous avons évalué les capacités des nanoparticules magnétiques nues et fonctionnalisées pour capturer le type sauvage (WC-A) et un mutant de Y. enterocolitica manquant de récepteur de feroxamine FoxA (FoxA WC-A 12-8). Les députés ordinaires, les députés fonctionnalisés et les MNP@SiO_{conjugués 2}@NH_@Fa ont été autorisés à interagir avec chaque souche Y. enteropolitica. Les agrégats de bactéries conjuguées ont été séparés de la suspension bactérienne par l’application d’un champ magnétique. Les agrégats séparés ont été rincés deux fois avec du phosphate tamponné saline (PBS), re-suspendus dans PBS pour préparer des dilutions en série et puis, ils ont été plaqués pour le comptage des colonies. Ce protocole démontre chaque étape de la synthèse de MNP@SiO₂@NH@Fa, la caractérisation structurelle de tous les intermédiaires et du conjugué, et un test de capture de bactérie comme un moyen facile d’évaluer la spécificité du conjugué par rapport aux intermédiaires. ⁹

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Protocole

REMARQUE : Pour les réactions effectuées dans des conditions d’atmosphère inertes, toute la verrerie a été préalablement séchée dans un four à 65 °C, scellée avec un septum en caoutchouc et purgée avec de l’argon trois fois.

1. Synthèse de nanoparticules magnétiques conjuguées à la feroxamine

1. Synthèse des nanoparticules magnétiques Fe₃O₄ (MNPs)
   1. Ajouter 0,5 g de Fe(acac)₃ dans un flacon en verre de 20 mL, puis mélanger avec 10 mL d’alcool benzyle.
   2. Sonicate ce mélange pendant 2 min, puis transférer dans un bloc de chauffage et chauffer à 180 °C pendant 72 h.
   3. Une fois la réaction terminée, laisser refroidir les flacons, rincer les nanoparticules avec 96 % d’éthanol et la centrifugeuse à 4000 x g pendant 30 min. Répétez la centrifugation au moins deux fois.
   4. Séparez les nanoparticules du supernatant par attraction magnétique à l’aide d’un aimant de néodyme (NdFeB) et jetez le solvant résiduel.
   5. Rincer à 96 % d’éthanol, étape de répétition 1.1.4. et jeter le supernatant en alternance avec sonication dans un bain pendant 1 min à 40 kHz jusqu’à ce que le solvant semble clair.
2. Nanoparticules magnétiques SiO₂ revêtement (MNP@SiO₂)
   1. Préparer une suspension de 2 g de MNP dans 80 ml d’isopropanol, puis ajouter 4 ml d’ammoniac à 21 %, 7,5 ml d’eau distillée et 0,56 mL d’orthosilicate tétraéthylique (TEOS) (dans cet ordre) dans une fiole de fond ronde à l’aide d’une barre magnétique.
   2. Chauffer le mélange à 40 °C pendant 2 h avec un remuant continu, puis un sonicate pendant 1 h.
   3. Séparez le MNP d’un aimant, jetez le supernatant et dispersez-le dans 30 mL d’isopropanol.
   4. Répétez les étapes 1.2.1. et 1.2.2.
   5. Retirer et laver la barre magnétique avec 96% d’éthanol pour récupérer tout le matériel.
   6. Séparez les nanoparticules du supernatant par attraction magnétique à l’aide d’un aimant.
   7. Jeter le supernatant et rincer les nanoparticules avec 96% d’éthanol trois fois en alternance avec la sonication.
   8. Sécher les nanoparticules sous vide à température ambiante pendant 12 h.
3. Fonctionnalisation de MNP@SiO₂ avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
   1. Rincer 500 mg du MNP@SiO₂ obtenus à partir de l’étape précédente avec N,N-diméthylformamide (DMF) sous atmosphère inerte, puis sonicate pendant 1 min à 40 kHz. Ensuite, jetez le supernatant et répétez ce processus trois fois.
   2. Re-suspendre les particules dans une fiole de fond ronde, sous agitation avec une barre de remue-ménage magnétique et ajouter 9 ml d’APTES.
   3. Remuer le mélange à 60 °C pendant 12 h.
   4. Jeter le supernatant et rincer les nanoparticules avec 96% d’éthanol trois fois en alternance avec la sonication.
4. Synthèse de la feroxamine
   1. Dissoudre 100 mg (0,15 mmol) de sel de mésylate de déféroxamine et 53,0 mg (0,15 mmol) de Fe(acac)₃ dans 5 mL d’eau distillée et remuer le mélange pendant la nuit à température ambiante.
   2. Laver le produit résultant trois fois avec 20 mL d’EtOAc dans un entonnoir de séparation, puis retirer le solvant organique sous vide à l’aide d’un évaporateur rotateur.
   3. Séchez-vous la phase aqueuse pour se permettre la feroxamine comme un solide rouge.
5. Synthèse de N-succinylferoxamine
   1. Ajouter 350 mg (3,50 mmol) d’anhydride succinique à une solution de 100 mg (0,17 mmol) de feroxamine dans 5 ml de pyridine dans une fiole à fond rond de 50 ml sous atmosphère inerte.
   2. Remuer le mélange résultant à température ambiante pendant 16 h. Après ce temps, retirer l’excès de pyridine sous pression réduite dans un évaporateur rotateur pour donner un solide rouge foncé.
   3. Dissoudre le brut de réaction dans 3 mL de méthanol.
   4. Transférer la solution méthanolique dans une colonne Sephadex (20 cm de Sephadex dans une colonne de 20 mm de diamètre) et elute à 0,5 mL/min.
   5. Recueillir la fraction rouge et retirer le méthanol sous vide à l’aide d’un évaporateur rotateur.
6. Synthèse du MNP@SiO conjugué₂@NH@Fa
   1. Rincer 30 mg de MNP@SiO sec₂@NH₂ deux fois avec du DMF et soniquer les nanoparticules dans une fiole Erlenmeyer de 100 ml pendant 30 min sous atmosphère inerte.
   2. Préparer une solution de N-succinylferoxamine (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(diméthyllamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) et N,N-diisopropyléthylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) dans 10 mL de DMF (Mix A) dans un flacon rond de 50 mL sous l’atmosphère inert.
   3. Suspendre le MNP@SiO 2 @NH₂@NH₂ mL de DMF sous sonication à sec dans des conditions sans oxygène à l’aide d’une atmosphère de gaz d’argon (Mix B).
   4. Ajouter le mélange A pour mélanger B dropwise.
   5. Agiter le mélange final à l’aide d’un shaker orbital à température ambiante pendant la nuit.
   6. Séparez le conjugué résultant (MNP@SiO₂@NH@Fa) de la suspension à l’aide d’un aimant.
   7. Rincez le solide résultant, puis, soniquer cinq fois avec 10 mL d’éthanol.
   8. Sécher le solide sous vide pendant 24 h.

2. Test bactérien avec souches de Y. entérocolite pour quantifier la capture de bactéries pathogènes avec des nanoparticules

1. Préparer une suspension de toutes les nanoparticules intermédiaires et le conjugué final en PBS à 1 mg/mL dans des tubes stériles de 2 mL.
2. Préparer une culture de Y. enteropolitica dans 5 mL de bouillon De Luria Bertani (LB) toute la nuit en incubation à 37 °C.
3. Préparer un bouillon de soja tryptique déficient en fer de 5 mL (TSB) en ajoutant 50 μL de 10 mM 2,2′-bipyridyl.
4. Inoculer les 5 mL de TSB déficient en fer avec 50 μL de la culture de nuit de Y. enterocolitica, puis, incuber à 37 °C avec agitation jusqu’à ce qu’un OD₆₀₀ = 0,5\u20120.8 soit atteint.
5. Prendre 100 μL de la culture obtenue à l’étape 2.4 et diluer dans un tube de 2,0 mL contenant 900 μL de PBS pour obtenir une première dilution 1/10. Ensuite, préparer une dilution de 1/100 à partir de la première dilution en utilisant la même procédure pour obtenir une concentration de cellules bactériennes à 1 x 10⁶ Unités de formation de colonies (CFU)/mL environ.
6. Ajouter 100 μL de suspension de nanoparticules à 1 mg/mL à 1 ml de la dilution de 1/100 de suspension bactérienne dans un tube de 2,0 mL, et homogénéiser avec vortex.
7. Incuber la culture à 20 °C pendant 1 h.
8. Séparez les agrégats MNP/bactéries à l’aide d’un aimant et jetez soigneusement le supernatant.
9. Rincer les nanoparticules séparées deux fois avec 1 mL PBS à l’aide d’un vortex.
10. Suspendre les nanoparticules dans 1 mL de PBS pour compter la quantité de capture bactérienne dans CFU/mL.
11. Préparer quatre dilutions successives de 1/10 de l’ancienne suspension jusqu’à ce qu’une dilution de 1 x^{10 -4} soit atteinte.
12. Plaquez 10 μL de chaque dilution sur les plaques d’agar TS et incuber à 37 °C pendant la nuit.
13. Photographiez la plaque avec un digitalizer de gel en mode épi blanc. Traitez l’image avec un logiciel approprié pour amplifier un endroit pour compter le nombre de colonies individuelles.
    REMARQUE : Chaque intermédiaire MNP a été caractérisé pour suivre l’évolution de la synthèse. Tout d’abord, les députés nus ont été étudiés par XRD pour vérifier la structure cristalline. Ensuite, le spectre FT-IR de chaque intermédiaire a été exécuté pour vérifier les changements qui se sont produits dans la réaction correspondante. L’analyse de spectroscopie de Raman de chaque intermédiaire a également été effectuée afin de confirmer les conclusions déduites des spectres FT-IR. L’analyse TGA nous a permis d’estimer le poids de perte des intermédiaires portant des matières organiques dans sa structure. La morphologie et la taille de chaque intermédiaire ont été étudiées par TEM. Enfin, l’analyse XPS a été essentielle pour déterminer les états d’oxydation de l’atome à chaque surface intermédiaire MNP et pour confirmer la formation de liaisons covalentes dans le MNP@SiO₂@NH@Fa conjugués.

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Résultats

Une caractérisation structurelle exhaustive est effectuée afin de déterminer la morphologie et les propriétés de chaque intermédiaire et le conjugué final. À cette fin, les techniques XRD, FT-IR, Spectroscopie Raman, TGA, TEM, EDX mapping et XPS sont utilisées afin de démontrer la formation du conjugué. Les états d’oxydation des atomes à la surface des nanoparticules acquises par spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) sont les données les plus pertinentes pour confirmer la formation de liaison...

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Discussion

Ce protocole décrit la synthèse d’un conjugué entre les nanoparticules magnétiques et la feroxamine de siderophore par liaison covalente. La synthèse de la magnétite a été réalisée à l’aide du protocole rapporté par Pinna et coll.⁵ suivi d’un revêtement de silice pour protéger le noyau magnétique de la corrosion dans les systèmes aqueux, pour minimiser l’agrégation et pour fournir une surface appropriée pour la fonctionnalisation⁶. Le processus de ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578