Création in situ de la perfusion en circuit fermé des organes abdominaux inférieurs et des membres postérieurs chez les souris

Résumé

Un protocole est décrit pour la perfusion in situ du bas du corps de la souris, y compris la vessie, la prostate, les organes sexuels, les os, les muscles et la peau du pied.

Résumé

La perfusion ex vivo est un outil physiologique important pour étudier la fonction des organes isolés (p. ex. foie, reins). Dans le même temps, en raison de la petite taille des organes de souris, la perfusion ex vivo des organes d’os, de vessie, de peau, de prostate, et de reproduction est difficile ou non faisable. Ici, nous rapportons pour la première fois un circuit in situ de perfusion inférieure du corps chez les souris qui inclut les tissus ci-dessus, mais contourne les organes principaux de dégagement (rein, foie, et rate). Le circuit est établi en canniler l’aorte abdominale et le vena cava inférieur au-dessus de l’artère et de la veine iliaques et en cautérisant les vaisseaux sanguins périphériques. La perfusion est effectuée par l’intermédiaire d’une pompe péristaltique avec débit perfusate maintenu jusqu’à 2 h. La coloration in situ avec la lectine fluorescente et la solution de Hoechst a confirmé que la microvasculature a été perfusée avec succès. Ce modèle de souris peut être un outil très utile pour étudier les processus pathologiques ainsi que les mécanismes de l’administration de médicaments, la migration / métastases des cellules tumorales circulantes dans / de la tumeur, et les interactions du système immunitaire avec des organes et des tissus perfusés.

Introduction

La perfusion d’organe isolé a été développée à l’origine pour étudier la physiologie d’organe pour la transplantation^1,2,3, et a permis la compréhension des fonctions des organes sans interférence d’autres systèmes de corps. Par exemple, la perfusion rénale et cardiaque isolée était extrêmement utile pour comprendre les principes de base de l’hémodynamique et les effets des agents vasoactifs, tandis que la perfusion hépatique était importante pour comprendre la fonction métabolique, y compris le métabolisme des médicaments dans les tissus sains et malades⁴

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Colorado.

1. Préchauffer le système de perfusion

1. Préparer le système de perfusion avant la chirurgie en commençant un bain d’eau circulant à 37 °C pour tous les composants à veste d’eau (réservoir perfusé, chambre humide et couvercle) comme le montre une configuration personnalisée de la figure 1A. Assurez-vous que le tube est propre et remplacez-le si nécessaire. Pour limiter le volume perfusé, utilisez un piège à bulles dans une chambre humide comme réserv....

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Résultats

Nous avons mis en place un système de perfusion en circuit fermé par cannulation de l’aorte abdominale et le vena cava inférieur de 8-10 semaines souris tout en gardant le volume de tampon de perfusion inférieure à 10 mL. La figure 3A montre des images confocales après avoir perfusé les tissus avec la solution de Ringer contenant Hoechst 33342 et DyLight 649-lectine. Les muscles, la moelle osseuse, les testicules, la vessie, la prostate et la peau du pied montrent une coloration nuc.......

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Discussion

Le circuit décrit peut être utilisé pour sonder diverses questions de recherche, par exemple le rôle de différents composants sériques et barrières tissulaires dans l’administration de médicaments, ou le trafic de cellules immunitaires et souches. Différents systèmes d’administration de médicaments (p. ex., liposomes et nanoparticules) peuvent être ajoutés au perfusate afin de comprendre le rôle des facteurs physiologiques et biochimiques dans l’administration. La durée de la perfusion peut varier, s.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023