Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Résumé

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Résumé

Les xénogreffes d’origine patiente (PDX), générées lors de la résécation du tissu tumoral du patient, sont greffées directement en souris immunocompromisées, demeurent biologiquement stables, préservant ainsi les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques, ainsi que l’hétérogénéité de la tumeur originale. Toutefois, l’utilisation de ces modèles pour effectuer une multitude d’expériences, y compris le dépistage des drogues, est prohibitif tant en termes de coût que de temps. Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) sont largement considérés comme des plates-formes dans lesquelles les cellules cancéreuses conservent leur intégrité biologique grâce aux interactions biochimiques, à la morphologie et à l’architecture. Notre équipe a une vaste expérience de la culture des cellules PDX in vitro à l’aide de matrices 3D composées d’acide hyaluronique (HA). Afin de séparer les cellules stromal fibroblastes de souris associées aux PDX, nous utilisons la culture de rotation, où les cellules stromal adhèrent à la surface des plaques traitées par culture tissulaire tandis que les cellules tumorales DISSOCIées pdx flottent et s’associent en grappes multicellulaires. Les cellules simples, souvent mortes, qui présentent un défi dans la collecte de clusters PDX viables pour l’encapsulation en aval dans les hydrogels pour la culture cellulaire 3D, flottent également dans le surnatant. Afin de séparer ces cellules simples des grappes cellulaires vivantes, nous avons utilisé la centrifugation de gradient d’étape de densité. Le protocole décrit ici permet l’épuisement des cellules célibataires non viables de la population saine des grappes cellulaires qui seront utilisées pour d’autres expérimentations in vitro. Dans nos études, nous intégrons les cultures 3D dans des plaques microfluidiques qui permettent la perfusion des médias pendant la culture. Après avoir évalué les cultures qui en résultent à l’aide d’un test de viabilité basé sur l’image fluorescente des cellules purifiées par rapport aux cellules non purifiées, nos résultats montrent que cette étape de séparation supplémentaire a considérablement réduit le nombre de cellules non viables de nos cultures.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, le domaine de la recherche sur le cancer a démontré un regain d’enthousiasme pour les xénogreffes dérivées du patient (PDX) comme outil d’évaluation de la dépendance aux voies cancéreuses et de la susceptibilité^{aux médicaments 1}. Les modèles PDX les plus courants sont établis par implantation sous-cutanée ou orthotopique de cellules tumorales humaines — un fragment tumoral, un groupe de cellules dérivées de tumeurs dissociées ou un échantillon de cellules tumorales circulantes isolées (CTC) — dans un hôte de rongeurs. Si la tumeur « prendre » est un succès, les cellules xénogreffe proliférera, vasculariser, et autrement interagir avec le tissu hôte pour créer une tumeur, qui peut être récolté à une taille optimale, subdivisé, et ré-implanté dans d’autres hôtes. Parmi leurs nombreux avantages en tant que système modèle, les PDX conservent généralement une partie substantielle de l’hétérogénéité de la population de cellules tumorales indigènes et permettent l’évaluation des voies et des réponses cellulaires spécifiques à^{l’homme 2,3}. Le contexte in vivo permet l’interaction de tumeur avec la vascularisation et d’autres stroma adjacents et récapitule des caractéristiques de tissu telles que la dynamique de diffusion de drogue, la tension d’oxygène, et l’influence extracellulaire de matrice qui influencent biologiquement et mécaniquement la progression de tumeur. Un aspect négatif des PDXs est leur dépendance sur un hôte de rongeur, à la fois pour l’expansion de tumeur et finalement pour l’essai d’hypothèse. Étant donné que de nombreux PDX ne peuvent pas s’adapter à la culture bidimensionnelle traditionnelle (2D) sur le polystyrène de culture tissulaire sans perdre bon nombre de leurs caractéristiques souhaitables, il y a eu un juste milieu minimal pour les chercheurs entre cette méthode in vitro relativement contrôlée et l’augmentation significative des dépenses, des installations et des besoins en temps pour l’utilisation in vivo PDX.

Nous avons décrit plusieurs modèles in vitro qui mettent en œuvre la culture cellulaire 3D au sein d’une matrice de soutien, et avons récemment élargi ce travail pour démontrer la culture ex vivo des PDX dérivés du cancer de la prostate multiple (PCa), seuls et en co-culture avec des fibroblastes dérivés de la^{moelle osseuse 4,5}. Les matrices hydrogel à base d’acide hyaluronique (HA) fournissent un soutien personnalisable et biologiquement pertinent pour les deux types de cellules, avec un contrôle facile sur les caractéristiques hydrogel et la clarté optique pour l’imagerie à travers la profondeur hydrogel⁶.

Les tissus tumoraux PDX matures comprennent un mélange variable de cellules cancéreuses humaines hétérogènes et de stroma de souris (fibroblastes, cellules endothéliales, etc.). Pour étudier les contributions spécifiques de type cellulaire à la progression tumorale in vitro, il peut être avantageux de dissocier les tumeurs, de séparer les populations cellulaires et de les incorporer expérimentalement de manière organisée pour disséquer les voies de communication intercellulaire. Les populations mixtes de cellules dans les digestates tissulaires ont une compatibilité différentielle avec des conditions de culture spécifiques. Par exemple, la viabilité fibroblaste associée à la tumeur nécessite soit une adhérence de surface, soit des matrices 3D fonctionnalisées avec des ligands d’intégrine, tandis que les cellules PDX épithéliales n’ont généralement pas ces exigences, favorisant plutôt les interactions cellule-cellule. Ces différences peuvent être exploitées pour assurer une séparation efficace des cellules PDX des cellules stromales de la souris contaminantes. La culture de rotation des digestates tissulaires permet l’adhérence des cellules stromales à la surface de la culture tissulaire tandis que les adhérences cellule-cellule conduisent les cellules PDX flottant au-dessus de la surface de culture rotative pour former des grappes multicellulaires dans le supernatant à 24−48 h. Les caractéristiques spécifiques de ces grappes varient selon le PDX (p. ex., de grandes grappes serrées, hautement sphériques ou des agrégats plus petits et plus lâches ressemblant à des grappes de raisin), mais sont généralement de tailles biologiquement pertinentes (50−250 μm de diamètre), suffisantes pour évaluer les interactions cellulaires qui reposent sur des contacts intercellulaires.

La récupération et le traitement des tumeurs entraîne inévitablement un certain degré de mort collatérale des cellules, soit en raison de dommages à court terme causés par des perturbations mécaniques/enzymatiques, soit d’une incompatibilité à long terme des sous-populations avec les conditions de culture choisies. Malgré l’utilité de la culture de rotation comme séparation initiale en vrac, les cellules mortes ou mourantes sont inévitablement transférées avec les clusters PDX et peuvent influencer la culture qui en résulte. Ces cellules mortes sont souvent des cellules PDX individuelles qui n’ont pas été intégrées dans un cluster, des fibroblastes stromaux de souris qui ne peuvent survivre dans des conditions de culture sélectionnées, ou des cellules endothéliales particulièrement fragiles. Ces cellules mourantes peuvent influencer les résultats expérimentaux des « survivants » et avoir un impact important sur la quantification, par exemple par le biais d’analyses de dépistage de la viabilité basées sur l’image fluorescente. Pour améliorer la sélection des cellules PDX vivantes de cette méthode, nous avons adapté les méthodes de centrifugation avec des étapes de densité pour éliminer facilement les cellules mortes/mourantes individuelles des mélanges PDX et conserver principalement des clusters multicellulaires vivants.

Afin d’améliorer l’étude des grappes dérivées de PDX en culture 3D, nous avons utilisé une plate-forme de culture de perfusion basée sur les microfluidiques, l’OrganoPlate (Figure 1), qui est une plate-forme de culture de perfusion à haut débit qui permet une culture simultanée de jusqu’à 96 cultures individuelles perfusées et 3D sur une base de plaques de microtiter de 384 puits(figure 1A)^7,8. Dans la plaque microfluidique à deux voies, une seule puce tissulaire est reliée par deux canaux microfluidiques(figure 1B,canal gel : rouge, canal de perfusion : bleu) qui s’étendent sur quatre puits d’affilée. Les deux canaux microfluidiques sont séparés par une courte crête en plastique appelée Phaseguide qui empêche le débordement d’un canal dans son canal voisin adjacent, et permet simultanément une interface sans membrane entre le contenu du gel et le canal de perfusion⁹. Parce que le fond de la plaque microfluidique est composé de verre de qualité microscope, les cultures peuvent être visualisées dans la fenêtre d’observation à travers le fond de la plaque avec un microscope standard ou automatisé. La perfusion est établie dans la plaque microfluidique avec un rocker programmable, utilisant la gravité pour conduire les médias à travers les canaux microfluidiques, entre les puits du réservoir (figure 1C). Le flow-mimic de perfusion récapitule plus étroitement le microenvironnement de tumeur que la culture statique, permettant l’incorporation du stress de cisaillement et la distribution accrue des gaz et des éléments nutritifs. Les avantages du maintien d’une culture perfusée de cellules cancéreuses dans la plaque microfluidique ont été précédemment décrits comme cultures perfusées de cancer du sein ont montré la viabilité optimale par rapport à une culture statique de 3D des mêmes cellules^7.

Le présent rapport décrit une méthode adaptée de centrifugation du gradient de densité pour isoler les clusters PDX multicellulaires vivants et démontre son utilité dans l’établissement de cultures 3D PDX dans des plaques microfluidiques perfusables. Étant donné qu’un nombre croissant de laboratoires de recherche cherchent des méthodes pour faciliter l’utilisation du PDX, nous prévoyons que les protocoles présentés ici seront d’une utilité immédiate.

Protocole

Le tissu tumoral a été obtenu avec le consentement du patient et selon un protocole approuvé de la Commission d’examen institutionnel (CISR). Les xénogreffes ont été implantées, cultivées et récoltées selon un protocole accepté du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).

REMARQUE : Tous les travaux doivent être effectués dans un cabinet de sécurité biologique stérile pour maintenir la stérilité. Toutes les étapes doivent être effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Préparation des matériaux pour le traitement PDX

1. Forceps autoclave et poignée de scalpel ou lames de rasoir.
2. Décongeler la solution enzymatique de dissociation à 4 °C pendant la nuit ou à température ambiante le même jour que la dissociation des tissus.
   REMARQUE : La décongélation à 37 °C n’est pas conseillée, car cela peut inactiver certaines enzymes de dissociation.
3. Préparer au moins 100 mL de milieu de culture PDX (mélange moyen-nutriment Eagle modifié F-12 [DMEM-F12] avec 100 U/mL de pénicilline et de streptocotomycine et 30% sérum bovin fœtal [FBS]), et au moins 25 mL de milieu de traitement PDX (DMEM-F12 avec 100 U/mL de pénicilline et streptocotomycine et pas de FBS). Conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.

2. Dissociation pdx et purification initiale de composant stromal

1. Recueillir des ustensiles autoclavés, des passoires cellulaires de 70 μm (2−3), des plats ronds de culture tissulaire de 60 mm (2), des plaques de culture tissulaire de 6 puits, des tubes stériles de centrifugeuse conique de 50 mL et un salin stérile de 1 x tamponné au phosphate (PBS). Culture chaude moyenne à 37 °C et permettre à la solution enzymatique de dissociation d’arriver à température ambiante.
2. Lorsque le tissu PDX a atteint un diamètre de 1,0−1,5 cm chez un hôte de souris, retirez chirurgicalement la tumeur de la souris par des moyens standard (p. ex., sous anesthésie acceptée) et conservez-le sur la glace dans un tube de 50 mL avec milieu de culture PDX(figure 2A). Traiter le tissu rapidement, par les étapes ci-dessous, pour maximiser la viabilité cellulaire, de préférence dans les 1−2 h après la récolte.
3. Transférer le tissu tumoral dans un tube conique stérile pré-pesé de 50 mL. Rincer 6x avec 30 mL de PBS stérile pour éliminer le sang et les contaminants. Enlever autant de liquide que possible et peser le tissu tumoral.
4. Transférer le tissu tumoral dans un plat rond de culture tissulaire de 60 mm et hacher en ~1 mm³ morceaux à l’aide d’une lame de rasoir stérile ou d’un scalpel.
5. Ajouter 5 mL de milieu de traitement PDX pour recueillir le lisier tumoral et transférer dans un nouveau tube stérile de 50 mL. Rincer le plat de culture avec un autre 5 mL de milieu de traitement PDX, puis avec la solution enzymatique de dissociation (tumeur de 10 mL/g, au moins 5 mL), en ajoutant tous les rinçages au tube de 50 mL.
6. Incuber 20 min à 37 °C avec des secousses douces. Faites tourbillonner doucement le tube à mi-temps du temps d’incubation.
7. Pipette de haut en bas doucement avec une pipette sérologique pour briser les touffes. Filtrer les cellules avec une passoire cellulaire de 70 μm placée sur un nouveau tube stérile de 50 mL.
   REMARQUE : Plus d’une passoire peut être nécessaire.
8. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules. Retirez le supernatant et resuspendez dans 2−3 mL de milieu de culture PDX. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
9. Utilisez le tableau 1 pour estimer le nombre requis de cellules dissociées dérivées du PDX nécessaires pour atteindre la densité cellulaire souhaitée par puce.
   REMARQUE : Les valeurs du tableau 1 sont destinées à être un point de départ. Les valeurs réelles varieront en raison de la viabilité/cellularité des tissus et de la perte cellulaire due au gel ou à la récupération. Les tumeurs PDX sont des individus, même dans un type de cancer donné de sorte que ces valeurs devraient être ajustées empiriquement.
10. Sur le nombre calculé à l’étape 2.9, plaque 1−2 x 10⁶ cellules dans 5 mL de milieu de culture PDX par puits d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits. Incuber (37 °C, 5 % de CO₂, 95 % d’humidité) pendant 48 h avec des secousses douces (50−55 rpm) pour favoriser la formation des grappes (figure 2B). Après la formation de l’amas, passez à l’article 3 pour la centrifugation.
11. Cryopreserve cellules PDX inutilisées de la dissociation initiale dans 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% sulfure de diméthyle (DMSO) ou un milieu de congélation cellulaire primaire disponible dans le commerce.
    REMARQUE : Les cellules stromales de souris adhérentes peuvent également être récupérées de la surface de plaque de tissu, si désiré, en rinçant brièvement avec le milieu de culture et en élargissant par des moyens standard.
12. Pour une utilisation ultérieure des cellules tumorales cryopréservées PDX/stroma de souris, décongelez les cellules dans un bain d’eau de 37 °C pendant 2 min. Comptez et plaquez dans une plaque de culture tissulaire de 6 puits telle que décrite à l’étape 2.10 avant de passer à l’article 3. Augmentez le nombre de cellules PDX d’environ 20 % pour tenir compte des pertes de viabilité causées par la cryopréservation.

3. Séparation basée sur la centrifugation du gradient de densité des grappes dérivées du PDX des cellules individuelles

1. Préparer 20 mL de solution de gradient de densité de 100 % en mélangeant soigneusement 18 mL de solution de centrifugation de gradient de densité avec 2 mL de solution de sel équilibré stérile de 10 x Hanks (HBSS) dans un tube conique stérile de 50 mL. Faites 10 mL chacune de 20%, 30%, 40%, et 55% solutions de gradient de densité en diluant cette solution 100% avec stérile 1x HBSS et bien mélanger.
   REMARQUE : Ces volumes sont suffisants pour deux gradients de 15 mL qui peuvent être utilisés pour séparer ~15 x 10⁶ cellules chacune. Si vous séparez moins de ~15 x 10⁶ cellules, le deuxième gradient doit être utilisé comme un équilibre pour la centrifugation.
2. Ajouter 3 mL de solution de gradient de densité de 55% au fond d’un tube conique de 15 mL. Tenant le tube à un angle, superposez très doucement 3 mL de solution de gradient de densité de 40% au-dessus de la couche de 55%, distribuant lentement le liquide sur le côté incliné du tube pour éviter de mélanger les couches. Répétez avec la solution de gradient de densité de 30%.
3. Recueillir le supernatant des cultures de rotation PDX avec une pipette sérologique de 5 mL, rincer doucement la surface de la plaque. Centrifugeuse à 200 x g pendant 2 min pour pelleter les cellules.
4. Enlevez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 3 mL de solution de gradient de densité de 20% selon le nombre de gradients nécessaires pour séparer les cellules. Superposez soigneusement la solution de gradient de densité de 20 % avec des cellules sur le dessus du gradient(s). Si vous n’utilisez qu’un seul tube de gradient pour les cellules, garnir le tube de gradient d’équilibre d’une solution de gradient de densité sans cellules de 20 %.
5. Capuchon des tubes et centrifugeuses dans une centrifugeuse de rotor de godet pivotant pendant 30 min à 4 °C, 2 000 x get 0 frein.
6. Après centrifugation, des fractions seront visibles (Figure 2C). Recueillir 2−3 mL de fractions dans des tubes frais de 15 mL. Ajouter 3−4 volumes de 1x HBSS stérile à chaque fraction et inverser pour bien mélanger.
7. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 min pour pelleter les cellules. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 1−2 mL de milieu de traitement PDX.
   REMARQUE : Les clusters cellulaires PDX viables se trouvent généralement à l’interface de solution de gradient de densité de 40−55 % (figure 2D) avec des cellules mortes/mourantes individuelles s’accumulant à l’interface de solution de gradient de densité de 20−40 % pour la plupart des PDX testés.
8. Retirez un petit aliquot représentatif (50−100 μL) pour la re-dissociation avec un volume égal de solution enzymatique de dissociation pour évaluer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire groupée. Comptez les cellules à l’hémocytomètre ou au compteur cellulaire automatisé.

4. Préparation hydrogel et ensemencement de plaques microfluidiques

1. Reconstituer les solutions HA hydrogel (HA, HA-SH; thiol-reactive polyéthylène glycol diacrylate, PEGDA) selon les instructions du fabricant.
2. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 50 μL de HBSS à tous les puits dans des colonnes de fenêtre d’observation (colonne 3, 7, 11, 15, 19, 23) d’une plaque microfluidique à 2 voies pour maintenir l’humidité de la culture et des conditions d’imagerie optimales.
3. Calculer le volume de suspension cellulaire à partir de la section 3 nécessaire pour 50 μL d’hydrogel à la densité cellulaire désirée (c.-à-d. 5 000 cellules/μL). Pour l’ensemencement d’une plaque microfluidique, aliquot le volume calculé dans chacun des 4 tubes stériles centrifugeuses de 1,5 mL.
   REMARQUE : Les hydrogels HA ont un temps fixe pour la gelation. Ajustez le volume des aliquots de solution de gel pour l’efficacité d’utilisateur à la distribution si la gelation prématurée se produit.
4. Réglez le pH de la solution HA-SH à 8,0 avec 1 N NaOH immédiatement avant l’utilisation. Effectuez une gelation d’essai en mélangeant 40 μL de HA-SH avec 10 μL de PEGDA et en surveillant la gelation au fil du temps. La gelation commence généralement 5−8 min après le mélange HA-SH avec le crosslinker PEGDA.
5. La suspension cellulaire centrifugeuse aliquots pendant 2 min (200 x g, température ambiante) aux cellules de granulés. Retirez soigneusement les cellules supernatantes et résuspendantes dans le volume approprié de HA-SH.
   REMARQUE : L’hydrogel final est une solution HA-SH:PEGDA 4:1 (en volume) de sorte que les cellules doivent être résuspendées en 40 μL de HA-SH pour un volume final de 50 μL.
6. Ajouter 10 μL de PEGDA à un aliquot de cellules dans HA. Bien mélanger et attendre 1−3 min (selon le temps de gelation à partir de l’étape 4.4) avant d’ensemencer la plaque microfluidique.
   REMARQUE : Permettre la réaction de gelation du début avant l’ensemencement aide à réduire au minimum le tassement cellulaire.
7. Apposer une pointe pour distribuer des volumes de 1,5 μL à un seul canal répétant pipette et charger avec des cellules dans la solution hydrogel HA. N’oubliez pas de garder l’hydrogel aliquot bien mélangé pour assurer une distribution uniforme des cellules.
8. Pour ensemencer la plaque microfluidique, alignez la pointe de pipette perpendiculairement à la plaque tout en plaçant doucement la pointe au centre de l’entrée de gel (colonnes 1, 5, 9, 13, 17, 21) pour assurer le contact mais aucune pression lors de la distribution de la solution hydrogel. En travaillant rapidement pour prévenir la solidification prématurée de l’hydrogel, distribuez 1,5 μL de solution gel dans chaque entrée de gel.
9. Observez l’état de remplissage des canaux microfluidiques en regardant du haut de la plaque, du bas de la plaque ou au microscope, et évaluez le chargement, en utilisant la figure 3 comme guide (chargement réussi à la figure 3A,guidage de positionnement pipet à la figure 3B,chargement manqué à la figure 3C, non rempli pour se terminer à la figure 3D, débordement à la figure 3E). Identifiez tous les ajustements nécessaires à la technique qui pourraient améliorer le succès de remplissage pour la prochaine série de jetons (voir discussion pour les conseils de dépannage).
10. Répétez les étapes 4.6−4.9 avec les 3 aliquots restants des cellules dans la solution HA. Inverser la plaque tout en préparant le prochain aliquot (~1 min).
    REMARQUE : Le temps d’attente de 1 min et l’inversion de la plaque améliorent la distribution 3D des cellules en réduisant le tassement cellulaire à mesure que la gelation se produit.
11. Une fois toutes les copeaux remplies, incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié jusqu’à ce que la gelation soit complète (~45 min).
12. À l’aide du manuel fourni, assurez-vous que le rocker de perfusion est installé dans l’incubateur de culture cellulaire avec les réglages de perfusion corrects (angle de 14°, intervalles de 4 min).
13. Ajouter 50 μL de milieu de culture PDX à toutes les entrées moyennes (colonnes 2, 6, 10, 14, 18, 22) et vérifier si les canaux se sont remplis correctement en renversant la plaque. Appuyez doucement sur la plaque contre une surface pour encourager le liquide à remplir les canaux microfluidiques.
14. Ajouter 50 μL de DMEM-F12 (10% FBS) pour tous les points de vente moyens (colonne 4, 8, 12, 16, 20, 24). Si des bulles d’air sont emprisonnées dans le canal de perfusion, retirez-les en tapant doucement la plaque contre une surface.
15. À l’aide d’un formulaire de disposition du microscope et de laplaque (figure supplémentaire 1),enregistrez le succès de remplissage des copeaux. Exclure les copeaux mal remplis de toute autre utilisation expérimentale.
16. Placez la plaque sur un rocker incliné réglé à une inclinaison de 14° et un cycle de 4 min pour commencer la perfusion. Remplacer le milieu de culture PDX tous les 2 jours (d’abord 50 μL dans l’entrée, puis 50 μL en sortie).

5. Coloration cellulaire, imagerie et quantification de l’image

1. Préparer une solution d’analyse de viabilité cellulaire contenant trois colorants fluorescents (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, acéoxyméthyle de calcéine [AM]).
   1. Préparer des solutions de stock de chaque colorant comme suit : Hoechst 33342 à 1,6 mM (1 mg/mL) dans l’eau déionisée; calcéine AM à 4 mM en DMSO anhydre; ethidium homodimer-1 à 2 mM en DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      REMARQUE : Les solutions stock calcéine AM et ethidium homodimer-1 sont fournies dans le kit noté dans le tableau des matériaux.
   2. Préparez une solution de travail unique dans le HBSS ou le phénol rouge-libre moyen, contenant chacun des trois sous-dyes. Optimiser la concentration finale de travail pour chaque type de cellule et matrice, dans les fourchettes de 1,6−8,0 μM pour Hoechst 33342, 0,1−10 μM pour la calcéine AM et 0,1−10 μM pour l’ethidium homodimer-1.
2. Retirez le milieu de culture et appliquez la solution de colorant de viabilité de travail aux puces microfluidiques désirées (75 μL dans l’entrée, 25 μL dans la prise) et placez-les de nouveau sur le rocker de perfusion dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 1 h.
3. Imagez les fenêtres d’observation des cultures tachées à l’aide d’un microscope confocal manuel ou automatisé(Tableau des matériaux)avec des filtres fluorescents (répertoriés comme longueurs d’onde excitation/émission, nm) pour observer tous les noyaux (Hoechst 33342, 350/461), les noyaux de cellules mortes (ethidium homodimer-1, 528/617) et le cytoplasme cellulaire vivant (calcéine AM, 494/517).
4. Capturez 140 piles Z de μm d’une taille d’étape de ≤1 μm à l’aide d’un objectif d’air de 20 x. Trois champs de vision sont nécessaires pour visualiser l’ensemble du microcanal avec une petite quantité de chevauchement. Pour éviter un double échantillonnage, n’imagez que deux champs de vision par puce.
   REMARQUE : Les conditions d’imagerie doivent être optimisées afin d’assurer un échantillonnage NyQuist approprié. Dans l’expérience des auteurs, un système d’imagerie rapide, basé soit sur la déconvolution d’une source conventionnelle d’épi fluorescence ou le mode de balayage de résonance sur un confocal, est nécessaire pour analyser complètement une pile Z complète, avec trois couleurs laser, à travers 96 puces sur une plaque dans un laps de temps raisonnable (environ 3,5 h avec imagerie automatisée, y compris la configuration).
5. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, analysez les images Z-stack pour les données quantifiées souhaitées, telles que la morphologie, l’état d’agrégation ou d’autres fonctionnalités. Pour quantifier la viabilité des cellules, comptez le nombre de cellules mortes (rouges) et de noyaux cellulaires totaux (bleu).

Résultats

Un rocker de perfusion programmable a été préparé dans un incubateur standard de culture cellulaire à prise d’eau, et des plaques microfluidiques à deux voies ont été préparées dans un coffret de biosécurité standard pour le chargement (figure 1). Une tumeur de PDX de MDA-PCA-118b a été agrandie in vivo, récoltée quand elle avait atteint une taille maximale, et dissociée comme décrit dans la section de protocole 2 pour créer une suspension de boue des cellules, à approx...

Discussion

Ici nous décrivons une méthode pour traiter et cultururing les cellules viables de tumeur PDX-dérivées dans un système de culture 3D perfusé à haut débit. Tandis que ce protocole utilise le tissu de PCa PDX, il est également efficace pour d’autres tumeurs épithéliales-dérivées. Les caractéristiques tumorales varient d’une lignée PDX à l’autre, même dans le même tissu d’origine (prostate, sein, etc.). Certaines lignées PCa PDX sont plus fibrotiques et difficiles à isoler les cellules viables de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable