Utilisation de Bioink Hydrogel multicouches dans la bioimpression tridimensionnelle pour la distribution homogène des cellules

Résumé

Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (gélatine méthacryloyl à faible viscosité) pour empêcher la sédimentation des cellules encapsulées.

Résumé

Pendant le processus de bioimpression tridimensionnell à base d’extrusion, les bioinks liquides à faible viscosité peuvent protéger les cellules contre les dommages membranaires induits par le stress de cisaillement et améliorer la survie des cellules encapsulées. Toutefois, la sédimentation cellulaire rapide par gravité dans le réservoir pourrait entraîner une distribution inhomogène des cellules dans les structures bioimprimées et donc entraver l’application de bioinks semblables à des liquides. Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (p. ex., le méthacryloyl gélatineux à faible viscosité) pour prévenir la sédimentation des cellules encapsulées. Plusieurs interfaces liquides ont été manipulées dans le bioink multicouches pour fournir la rétention interfaciale. Par conséquent, l’action de sédimentation cellulaire qui traverse les couches adjacentes du système à plusieurs niveaux a été retardée dans le réservoir de bioink. Il a été constaté que la rétention interfaciale était beaucoup plus élevée que l’attraction sédimentaire des cellules, démontrant un rôle critique de la rétention interfaciale dans la prévention de la sédimentation cellulaire et la promotion d’une dispersion plus homogène des cellules dans le bioink multicouches.

Introduction

La bioimpression tridimensionnelle (3D) a été une méthode prometteuse pour fabriquer des répliques architecturales et fonctionnelles complexes de tissus indigènes en biofabrication et en médecine régénérative^1,2,3. Les stratégies communes de bioimpression, y compris l’impression à jet d’encre, extrusion et stéréolithographie, ont des avantages et des inconvénients de différentes perspectives⁴. Parmi ces techniques, la procédure d’extrusion est le plus couramment utilisée en raison de son rapport coût-efficacité. Bioink joue un rôle clé dans la stabilité du processus de bioimpression de l’extrusion. Le bioink idéal chargé de cellules doit non seulement être biocompatible, mais aussi être adapté aux propriétés mécaniques⁵. Les bioinks à faible viscosité sont généralement présentés comme un état liquide. Ces bioinks peuvent être facilement et rapidement déposés et éviter les dommages à la membrane cellulaire induits par un stress de cisaillement élevé pendant l’extrusion. Cependant, dans les cas complexes nécessitant des périodes d’impression à long terme, la faible viscosité donne souvent lieu à la sédimentation inévitable des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, qui est habituellement entraîné par la gravité et conduit à une dispersion inhomogène des cellules dans le bioink^6,7. Par conséquent, un bioink avec dispersion inhomogeneous de cellules entrave la bioimpression in vitro d’une construction fonctionnelle de tissu.

Plusieurs études récentes portant sur les bioinks ont rapporté la promotion de la dispersion homogène des cellules encapsulées. Un bioink d’alginate modifié basé sur le crosslinking à deux étages a été utilisé pour la bioimpression d’extrusion⁸. Un polymère d’alginate a été modifié avec des peptides et des protéines dans cette étude. Les cellules ont présenté une distribution plus homogène dans cet alginate modifié que dans l’alginate couramment utilisé en raison des sites d’attachement fournis par les peptides et les protéines. Alternativement, les bioinks mélangés ont été utilisés pour résoudre la sédimentation des cellules dans le bioink. Un bioink mélangé contenant du polyéthylène glycol (PEG) et de la gélatine ou de la gélatine méthacryloyl (GelMA) avec une robustesse mécanique améliorée a été utilisé dans une autre étude⁹. Les cellules encapsulées ont présenté une distribution homogène principalement parce que la viscosité du bioink mélangé a été améliorée. En général, il existe plusieurs facteurs influençant la dispersion des cellules encapsulées dans le bioink, tels que la viscosité du bioink, la gravité des cellules, la densité des cellules et la durée de la période de travail. Parmi ces facteurs, la gravité des cellules joue un rôle essentiel dans la promotion de la sédimentation. La flottabilité et la friction fournies par le bioink visqueux ont été étudiées comme les principales forces contre la gravité à ce jour¹⁰.

Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie pour promouvoir la dispersion homogène des cellules encapsulées dans le bioink en manipulant plusieurs interfaces liquides dans le réservoir de bioink. Ces interfaces liquides créées par la modification multicouches du bioink peuvent non seulement fournir une rétention interfaciale, ce qui retarde la sédimentation des cellules, mais aussi maintenir une biocompatibilité appropriée et le comportement rhéologique du bioink. Dans la pratique, nous avons modifié la solution aqueuse GelMA (5%, w/v) avec la fibroine de soie (SF) d’une manière multicouches pour produire longitudinalement quatre interfaces, fournissant des tensions interfaciales dans le bioink mélangé. En conséquence, la charge de gravité sur les cellules a été compensée par la tension interfaciale artificielle, et une dispersion presque homogène des cellules encapsulées dans le bioink a été obtenue en raison de moins de sédimentation à travers les couches adjacentes des cellules. Aucun protocole similaire pour ralentir la sédimentation des cellules encapsulées en manipulant la rétention interfaciale dans les bioinks liquides n’a été rapporté à ce jour. Nous présentons notre protocole ici pour démontrer une nouvelle façon de résoudre la sédimentation cellulaire dans la bioimpression.

Protocole

1. Préparation de SF-GelMA chargé de cellules

1. Stériliser tous les matériaux à l’aide d’unités de filtre à seringues de 0,22 μm. Effectuez toutes les étapes d’une armoire de sécurité biologique.
2. Chauffer 1x PBS à 50 °C et dissoudre la gélatine dans le PBS chauffé 1x en remuant. La concentration finale de gélatine dans pbs devrait être de 10% (w/v).
3. Ajouter lentement l’anhydride méthacrylique dans la solution gélatine (rapport poids de l’anhydride méthacrylique à la gélatine de 0,6 à 1) en remuant, et mélanger le complexe pendant au moins 1 h (50 °C). Typiquement, préparer 200 mL de 10% solution de gélatine avec 12 g d’anhydride méthacrylique; le volume dépend des besoins de l’étude.
4. Transférer la solution mélangée contenant de la gélatine et de l’anhydride méthacrylique dans un tube stérile de 50 ml.
5. Centrifuge la solution mixte à 3 500 x g. Il faut habituellement 3-5 min pour obtenir deux couches. Recueillir la couche supérieure (GelMA) et jeter la couche inférieure (anhydride méthacrylique non expurgée).
6. Diluer la solution de couche supérieure obtenue à l’étape 1.5 avec deux volumes d’eau déionisée (40−50 °C).
7. Dialyze la solution obtenue à l’étape 1.6 avec une membrane de dialyse de coupure de poids moléculaire de 12-14 kDa contre l’eau déionisée pendant 5−7 jours (40−50 °C). Changez l’eau deux fois par jour.
8. Recueillir et congeler la solution GelMA à −80 °C pendant la nuit.
9. Lyophilisez la solution GelMA pendant 3 à 5 jours dans un séchoir à congélation avec une température fixée à -45 °C et la pression réglée à 0,2 mbar.
10. Dissoudre le GelMA lyophilisé (degré de substitution d’environ 75%) dans 1x PBS contenant 10 % de FBS (sérum bovin fœtal, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyéthylpiperazine-N-éthane-sulfonic acid), et photoinitiator (0,5 %, w/v) pour obtenir la préparation de bioink gelma.
    REMARQUE : Le degré de substitution de GelMA peut être calculé par un essai de ninhydrine³.
11. Mélanger la solution GelMA (10%, w/v) avec différents volumes de solution SF initiale (5%, w/v) et différents volumes de 1x PBS pour obtenir des bioinks SF-GelMA avec différentes concentrations de SF. La proportion par 1 mL de la solution GelMA et SF dans les différents bioinks est présentée dans le tableau 1.
    REMARQUE : Tous les bioinks doivent contenir une concentration finale de 5 % (w/v) gelma, mais la concentration de SF varie : 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 et 1,5 % (w/v) dans les différents bioinks SF-GelMA. Utilisez SF-M-Layered-GelMA pour termer le bioink GelMA modifié avec SF d’une manière couche par couche. Utilisez SF-X-GelMA pour termer ceux GelMA modifié avec SF d’une manière homogène (par exemple, GelMA avec modification de 1% SF a été appelé SF-1-GelMA).
12. Soniment tous les bioinks pendant 10-20 min.
13. Cultiver des cellules NIH3T3 utilisant le DMEM (le milieu Aigle modifié de Dulbecco) contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur (37 °C avec 5 % de CO₂). Passer les cellules à un rapport de 1:3 lorsque la densité atteint 80%.
14. Centrifugez la suspension des cellules NIH3T3 à 1500 tr/min pendant 5 min. Retirez le supernatant avec aspiration et resuspendez le granulé cellulaire avec une solution de bioink fraîche dans un tube stérile de 15 mL.
    REMARQUE : La concentration des cellules encapsulées dans le bioink doit être de 1 x 10⁶ cellules/mL, et la concentration doit être calculée à l’aide d’un cytomètre.
15. Utilisez 2 mL de différents bioinks SF-GelMA pour suspendre les granulés cellulaires afin d’obtenir divers bioinks chargés de cellules.

2. Chargement, réchauffage et bioimpression de la SF-M-Layered-GelMA

1. Chargez 0,4 mL de SF-0.5-GelMA chargé de cellules dans la couche inférieure de la seringue.
   REMARQUE : Utilisez une seringue de 2 mL comme réservoir de bioink dans cette étude. Chargez différents bioinks SF-GelMA dans la seringue d’une manière couche par couche.
2. Placez la seringue dans le bain d’eau glacée (0 °C) pendant 5 min pour que le bioink de la couche inférieure se transforme en gel.
3. Chargez 0,4 mL de bioink SF-0.75-GelMA chargé de cellules au-dessus de la couche inférieure.
4. Placez la seringue avec les deux couches de bioinks dans un bain d’eau glacée (0 °C) pendant 5 min pour que les deux couches de bioinks se transforment en un état de gel.
5. Faites le tour des étapes de chargement et de refroidissement 3 fois de plus avec les 3 autres types de bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) pour obtenir un système de bioink multicouches avec différentes concentrations de SF dans les différentes couches. Le volume utilisé pour le chargement de tous les bioinks doit être de 0,4 mL.
6. Réchauffer le bioink multicouches en plaçant la seringue dans un incubateur (37 °C) pendant 30 min avant la bioimpression.
7. Utilisez une seringue de 2 mL comme réservoir de bioink avec une buse d’impression de 27 G. Réglez la vitesse d’écoulement à 50 μL/min, la vitesse de déplacement de la buse à 2 mm/s et la hauteur de la buse à 1 mm. Effectuer la procédure de bioimpression à température ambiante (environ 20 °C).
   1. Imprimez la construction tissulaire d’une manière extrusion à l’aide d’un bioimprimeur sur mesure sous les paramètres adaptés de nos études précédentes^11,12.
8. Utilisez la lumière ultraviolette (365 nm, 800 mW) pendant 40 s pour relier la construction de tissu bioimprimé.
9. Culture de la construction de tissus croisés dans DMEM (le milieu aigle modifié de Dulbecco) contenant 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine dans un incubateur (37 °C avec 5% de CO_2). Le milieu a été changé tous les 8 h pendant les 2 premiers jours et tous les 2-3 jours par la suite.

Résultats

Un schéma de préparation des bioinks chargés de cellules est illustré à la figure 1. Après la préparation des différents bioinks, le chargement, le réchauffage et la bioimpression ont été effectués (figure 2). Pour évaluer la distribution des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, une procédure de bioimpression a été effectuée à l’aide de trois bioinks différents chargés de cellules dans trois plaques de 96 puits (

Discussion

La stabilité du système multicouches est un point clé pour effectuer ce protocole avec succès. Nous avons théoriquement calculé la diffusion des molécules SF dans la solution GelMA sur la base de l’étude de Nauman¹³. Il a été constaté que la diffusion des protéines dans la solution était liée à leur poids moléculaire. Le poids moléculaire moyen (MW) de l’albumine de sérum bovin (BSA) est de 66,5 kDa, et son coefficient de diffusion est de 64-72 μm²/s. Le MW moyen ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)	TCI	M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	10569044
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10091
Gelatin	Sigma-Aldrich	V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA)	Sigma-Aldrich	276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics	Gibco	15140163
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
Silk fibroin	Advanced BioMatrix	5154