Un modèle d’interposition veineuse de lapin imitant la chirurgie de revascularisation utilisant des greffes de veine pour évaluer l’hyperplasie intimale sous la tension artérielle

Résumé

Le protocole actuel vise à créer expérimentalement l’hyperplasie intimale veineuse en soumettant les veines à la tension artérielle pour développer des stratégies pour atténuer l’hyperplasie intimale veineuse après la chirurgie de revascularisation utilisant des greffes de veine.

Résumé

Bien que les greffes veineuses aient été couramment utilisées comme greffes autologues dans les chirurgies de revascularisation pour des maladies ischémiques, la patency à long terme reste pauvre en raison de l’accélération de l’hyperplasie intimale due à l’exposition à la tension artérielle. Le protocole actuel est conçu pour l’établissement d’hyperplasie veineuse expérimentale en interposant les veines jugulaires de lapin aux artères carotides carotides ipsilateral. Le protocole ne nécessite pas de procédures chirurgicales profondément dans le tronc du corps et l’étendue de l’incision est limitée, ce qui est moins invasif pour les animaux, permettant l’observation à long terme après l’implantation. Cette procédure simple permet aux chercheurs d’étudier des stratégies pour atténuer la progression de l’hyperplasie intimale des greffes de veine implantées. En utilisant ce protocole, nous avons rapporté la transduction d’effets du microARN-145 (miR-145), qui est connu pour commander le phénotype des cellules vasculaires lisses de muscle (VSMC) de la prolifération à l’état contractile, dans les greffes de veine récoltées. Nous avons confirmé l’atténuation de l’hyperplasie intimale des greffes de veine en transduisant le miR-145 avant chirurgie d’implantation par le changement de phénotype des VSMC. Ici, nous rapportons une plate-forme expérimentale moins invasive pour étudier les stratégies qui peuvent être employées pour atténuer l’hyperplasie intimale des greffes de veine dans les chirurgies de revascularisation.

Introduction

Le nombre de patients souffrant de maladies ischémiques dues à l’athérosclérose augmente dans le monde entier¹. Malgré les progrès actuels dans les thérapies médicales et chirurgicales pour les maladies cardiovasculaires, les maladies cardiaques ischémiques, telles que l’infarctus du myocarde, restent une cause majeure de morbidité et de mortalité². En outre, les maladies artérielles périphériques caractérisées par une réduction du flux sanguin vers les membres induit l’ischémie des membres critiques, dans lequel environ 40% des patients perdent leurs jambes dans les 6 mois suivant le diagnostic, et le taux de mortalité est jusqu’à 20%³.

Les chirurgies de revascularisation, telles que la greffe de pontage d’artère coronaire (CABG) et la chirurgie de pontage pour les artères périphériques, sont des options thérapeutiques principales pour des maladies ischémiques. Le but de ces chirurgies est de fournir une nouvelle voie de sang pour fournir le flux sanguin suffisant vers le site distal des lésions sténotiques ou occluded des artères athérosclérotiques. Bien que les greffes artérielles in situ, telles que les artères thoraciques internes pour CABG, soient préférées comme greffons de pontage en raison de la patency plus longue prévue, les greffes de veine, telles que les veines sapheneuses autologues, sont couramment utilisées en raison de l’accessibilité et de la disponibilité plus élevées⁴. Le point faible des greffes de veine est le taux pauvre de patency comparé à celui des greffes d’artère⁵ en raison de l’hyperplasie intimale accélérée une fois soumise à la pression artérielle, qui mène à la maladie de greffe de veine^6.

La maladie de greffe de veine se développe par les trois étapes suivantes : 1) la thrombose ; 2) hyperplasie intimale ; et 3) athérosclérose⁷. Afin de traiter la maladie de greffe de veine, beaucoup de recherche fondamentale a été menée⁸. Jusqu’à présent, aucune stratégie pharmacologique autre que l’antiplaquettaire et les thérapies de lipide-abaissement sont recommandées pour la prévention secondaire après des chirurgies coronaires ou périphériques de revascularisation dans les lignes directrices récentes^9,10,11,12. Ainsi, pour surmonter la maladie de greffe de veine, particulièrement l’hyperplasie intimale, l’établissement d’une plate-forme expérimentale pertinente pour d’autres études est exigé.

L’hyperplasie intimale est un phénomène adaptatif qui se produit en réponse au changement dans l’environnement, où les cellules vasculaires lisses de muscle (VSMC) prolifèrent, s’accumulent, et génèrent la matrice extracellulaire dans l’intima. Par conséquent, il présente une base pour l’atherome de greffe⁷. Dans l’intima hyperplastique, les VSMC supportent la prolifération, et la production plutôt que la contraction, appelée « changement phénotypique »⁸. Il s’agit d’une cible de recherche clé pour contrôler le phénotype des VSMCs des greffes veineuses pour prévenir la maladie de greffe de veine, et de nombreuses études de base ont été menées sur ce sujet⁸. Cependant, une étude clinique contrôlée randomisée qui visait à réaliser le contrôle pharmacologique du phénotype de VSMC a montré des résultats limités¹³. En outre, il n’existe pas de thérapies normalisées pour prévenir l’hyperplasie intimale. Des recherches plus fondamentales, y compris des études sur les modèles animaux, sont nécessaires.

Pour promouvoir la recherche dans ce domaine, il est crucial d’établir un modèle animal qui récapitule les greffes de veine sous la pression artérielle artérielle, permettant une observation postopératoire à long terme. Carrel et coll. ont établi un modèle canin d’implantation de la veine jugulaire externe dans l’artère carotide¹⁴. Thérafter, une variété de greffes de veine ont été employées pour étudier les effets physiologiques et pathologiques des altérations dans la tension artérielle, y compris le cava de vena inférieur engrafted dans l’aorte thoracique ou abdominale, ou la veine saphenous gravée dans l’artère fémorale^15,16,17. Ces modèles ont été construits chez de plus grands animaux, tels que des porcs ou des chiens, qui sont appropriés pour imiter une maladie de greffe de veine dans un cas clinique. Cependant, l’établissement d’un modèle animal qui peut être préparé sans techniques chirurgicales spéciales et à moindre coût serait idéal pour les chercheurs qui tentent de développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour atténuer l’hyperplasie intimale par le contrôle du phénotype VSMC in vivo. Initialement, l’interposition de la veine jugulaire dans l’artère carotide dans un lapin a été introduit dans le domaine de la neurochirurgie^18,19. Par la suite, il a été appliqué à la recherche sur l’hyperplasie intimale^20,21. Le modèle initial se compose d’interposition veineuse seule, ce qui permet de gagner du temps. En outre, une étude ultérieure a démontré que la préparation d’une greffe de veine a également affecté l’hyperplasie intimale²². Davies et coll. ont évalué l’effet des dommages de cathéter de ballon sur l’hyperplasie intimale dans un modèle d’interposition veineux de lapin^23,24. Bien que les dommages de cathéter de ballon en plus de l’interposition de veine aient été plus pertinents pour un arrangement clinique, un modèle plus reproductible était également désiré. Ainsi, Jiang et coll. ont examiné l’impact des environnements de flux différentiels sur l’hyperplasie intimale et ont établi une procédure de ligature de branche distale comme modèle^{reproductible 25}. Cependant, ils ont employé une technique de manchette au moment de l’interposition de greffe de veine qui semble différente de l’anastomose cousue à la main dans le cadre clinique. Dans le protocole actuel, nous rapportons une procédure reproductible, médicalement pertinente, et largement disponible pour la préparation d’un modèle d’interposition veineuse de lapin pour évaluer l’hyperplasie intimale sous la tension artérielle.

Protocole

REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales effectuées sur des animaux doivent être effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (www.nap.edu/catalog/5140.html) ou d’autres lignes directrices éthiques appropriées. Les protocoles devraient être approuvés par le comité de protection des animaux de l’établissement approprié avant d’aller de l’avant.

1. Préparation des animaux

1. Achetez des lapins blancs japonais mâles (ou lapins de taille corporelle équivalente) pesant de 2,7 à 3,0 kg.
2. Acclimatez les lapins pendant 1 semaine dans un cycle de 12 heures lumière-obscurité et nourrir un régime régulier de chow lapin avant la procédure.

2. Anesthésie et cadre animal

REMARQUE : Toutes les procédures ultérieures doivent être effectuées dans des conditions aseptiques. Le champ chirurgical et les dispositifs doivent être désinfectés avec 10% de solution povidone-iode, 70% d’alcool, ou un composé quaternaire d’ammonium avant utilisation.

1. Anesthésiez un lapin avec l’administration intraveineuse de sodium pentobarbital (25 mg/kg) par l’intermédiaire de la veine auriculaire.
2. Après s’être assuré que le lapin a perdu de sa force, transférez-le sur une table d’opération et mettez-le en position de supine. Couvrir le nez et la bouche d’un masque anesthésique. Commencez l’administration de l’anesthésie générale avec l’inhalation de 0,7 à 1,0% de mélange isoflurane-oxygène.
   REMARQUE : Si le lapin commence à se déplacer, une poussée temporelle d’isoflurane jusqu’à 2 % sera efficace.
3. Couper la fourrure sur le cou et l’épaule à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique. Après avoir désinfecté la surface en pulvérisant 70% d’éthanol ou une autre solution antiseptique, rasez le reste des cheveux dans la région cervicale avec un rasoir. Désinfecter le champ chirurgical avec 10% de povidone-iode et administrer l’hydrochlorure de lidocaïne (3 mg/kg) sous-cutanée comme anesthésie locale.
   REMARQUE : Examinez le mouvement répétitif de la trachée. Observez la pulsation de la veine jugulaire et de l’artère carotide. Lorsque les taux respiratoires et pulsatiles diminuent, envisagez une réduction temporaire de l’administration de l’anesthésie. La surveillance de la saturation percutanée de l’oxygène et du pouls est également utile.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Récolte de la veine jugulaire

REMARQUE : Des anesthésiques locaux (comme la lidocaïne) doivent être utilisés avant de faire l’incision de la peau.

1. Avant l’incision de peau, administrer l’enrofloxacine prophylactique (5 mg/kg) sous-cutanée. Pour l’analgésie, administrer 0,05 mg/kg de buprénorphine sous-cutanée deux fois par jour pendant 3 jours.
   REMARQUE : Pour éviter une baisse de la température corporelle, un gommage chirurgical du site d’incision peut être utilisé au lieu de pulvériser le corps de l’animal avec 70% d’éthanol.
2. Incise 50-60 mm de la région cervicale avec le scalpel chirurgical longitudinally. Disséquez émoussé les tissus sous-cutanés et le fascia pour exposer un segment de 20 à 30 mm de la veine jugulaire. Ligate toutes les branches de la veine exposée avec 4-0 sutures de soie.
3. Placez une suture de soie 2-0 autour des veines jugulaires internes et externes pour effectuer la ligature immédiatement après l’incision de la veine jugulaire à l’étape suivante.
4. Incisez la paroi veineuse (environ 1 mm) du côté distal de la veine. Insérez un cathéter ballon à 2 Français de la coupe vers le côté proximale de la veine. Ligate la suture de soie 2-0 aux sites distal des veines jugulaires.
5. Gonflez le ballon avec 0,2 ml d’air. Denude l’intima de la veine en utilisant trois passages du cathéter pour l’exfoliation endothéliale.
   REMARQUE : Ce procédé est considéré équivalent à la distension d’une greffe de veine saphenous dans les chirurgies humaines de revascularisation, qui cause l’exfoliation endothéliale.
6. Ligate l’extrémité proximale de la veine. Couper la veine pour récolter.
   REMARQUE : Distinguez soigneusement l’extrémité distale et proximale de la veine récoltée, parce que l’anastomose à l’artère doit être exécutée d’une manière inversée (c.-à-d., l’extrémité distale de la veine devrait être anastomosed à l’extrémité proximale de l’artère). Par exemple, l’insertion d’un cathéter intraveineux d’un certain côté fonctionnerait comme marqueur.
7. Pour les manipulations thérapeutiques de la veine jugulaire récoltée, traitez la veine récoltée avec des méthodes conçues pour chaque question de recherche (p. ex., électroporation²⁶ ou immersion directe avec des solutions²⁷ pour transduire les microARN dans les veines).
   REMARQUE : Pour ce protocole, les greffes de veine ont été trempées dans le salin, le microARN de commande de phosphate-tamponed, et le microARN-145. Le protocole peut être mis en pause ici.

4. Interposer l’artère carotide par la veine jugulaire récoltée

1. Exposez un segment de 20 à 30 mm de l’artère carotide ipsilateral. Séparez soigneusement l’artère de la veine et du nerf à proximité. Ligate toutes les branches de la veine exposée avec 4-0 suture de soie.
2. Administrer l’héparine de sodium par voie intraveineuse (200 UI/kg). Attendez 3 à 4 min.
3. Serrez les extrémités proximales et lugubres de l’artère avec des pinces chirurgicales. Couper l’artère au milieu, entre les pinces. Injecter saline normale dans l’artère carotide incisée proximally et distally pour distend l’artère.
   REMARQUE : Une artère carotide de lapin tend à rétrécir. Choisissez un site bien distendu comme site d’anastomose.
4. Anastomose la veine récoltée à l’artère d’une manière inversée de bout en bout.
   1. Insérez un cathéter intraveineux de 20 G dans la veine récoltée de la direction distale à la direction proximal pour garder les lumen veineux ouverts pendant l’anastomose distale.
   2. Anastomose l’extrémité proximale de la veine à l’extrémité distale de l’artère utilisant 8-0 sutures interrompues en polypropylène. Placez deux stiches d’ancrage sur le site et le site opposé. Ajouter les stiches le côté supérieur de la ligne d’anastomose entre les stiches d’ancrage.
   3. Retournez l’artère et la greffe de veine à l’envers. Ajouter les stiches sur la partie restante de la ligne d’anastomose.
   4. Retirez le cathéter intraveineux de la veine. Serrez la greffe de veine proximally et déclampez l’artère carotide distally. Assurez-vous que la greffe de veine se développe progressivement.
   5. Anastomose l’extrémité distale de la veine à l’extrémité proximale de l’artère utilisant 8-0 sutures interrompues en polypropylène. Déclampez l’artère pour vérifier le saignement des emplacements d’anastomose. Ajouter les sutures pour l’hémostase, si nécessaire.
      REMARQUE : Une compression douce du site de saignement avec la gaze et l’attente peut être assez pour l’hémostase. Vérifiez l’expansion immédiate et la forte pulsation de la greffe de veine après le dégrimpage proximal. Si cela n’est pas observé, envisagez de répéter les étapes 4.4.2-4.4.3
5. Ligater l’artère carotide interne avec une suture de soie 4-0 pour simuler une mauvaise condition de ruissellement et pour faciliter l’hyperplasie intimale.
6. Nettoyez la plaie avec du salin. Fermer la plaie à l’aide de 3-0 polyglactine 910, couche par couche.

5. Procédures postopératoires

1. Terminez l’anesthésie et retirez le masque d’anesthésie après vérification de la respiration spontanée de l’animal. Vérifiez fréquemment les conditions de l’animal jusqu’à ce qu’il se rétablisse de l’anesthésie.
2. Gardez l’animal séparé des autres animaux jusqu’à ce que la fonction respiratoire soit entièrement restaurée. Soutenir la respiration manuellement, si nécessaire. Ne retournez pas l’animal dans un groupe plus grand jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli.
3. Vérifiez la prise de nourriture et d’eau après la récupération de l’anesthésie et fournissez un soutien nutritionnel approprié. Administrer des analgésiques (p. ex., buprénorphine 0,05 à 0,2 mg/kg sous-cutanée 2x par jour pendant 3 jours) et vérifier les signes d’inconfort ou de douleur.

Résultats

La figure 1A montre une image représentative de l’hyperplasie intimale réussie à 2 semaines après chirurgie veineuse d’interposition (panneau supérieur). Le panneau inférieur montre les effets thérapeutiques des nanoparticules polyparticales poly(acide co-glycolique) chargées par microARN-145 qui atténuaient l’hyperplasie intimale (panneau inférieur). La figure 1B montre la comparaison de l’hyperplasie intimale entre le groupe témoin utilisant...

Discussion

Le protocole actuel est conçu pour fournir une plate-forme expérimentale pour tester diverses interventions moléculaires ou génétiques pour vsMCs pour contrôler le phénotype de la prolifération à l’état contractile et par la suite atténuer la progression de l’hyperplasie intimale veineuse in vivo. En utilisant ce modèle, nous avons réussi à préparer l’hyperplasie intimale à 2 semaines après la chirurgie (figure 1A) et avons indiqué le potentiel thérapeutique du micro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia