Détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de Toxoplasma Gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase

Résumé

Présenté ici est un protocole pour évaluer l’efficacité d’inhibition des composés chimiques contre la croissance intracellulaire in vitro de Toxoplasma gondii en utilisant un essai de croissance à base de luciferase. La technique est utilisée pour confirmer la spécificité de l’inhibition par la suppression génétique du gène cible correspondant. L’inhibition de LHVS contre la protéase TgCPL est évaluée en exemple.

Résumé

Toxoplasma gondii est un agent pathogène protozoaire qui affecte largement la population humaine. Les antibiotiques actuels utilisés pour le traitement de la toxoplasmose clinique sont limités. En outre, ils présentent des effets secondaires indésirables dans certains groupes de personnes. Par conséquent, la découverte de nouvelles thérapies pour la toxoplasmose clinique est impérative. La première étape du développement d’antibiotiques de nouveau est d’identifier des composés chimiques montrant une efficacité élevée dans l’inhibition de la croissance des parasites à l’aide d’une stratégie de dépistage à haut débit. En tant qu’agent pathogène intracellulaire obligatoire, Toxoplasma ne peut se répliquer qu’à l’intérieur des cellules hôtes, ce qui interdit l’utilisation de mesures d’absorption optique comme indicateur rapide de croissance. Présenté ici est un protocole détaillé pour un essai de croissance basé sur la luciferase. À titre d’exemple, cette méthode est utilisée pour calculer le temps de doublement des parasites Toxoplasma de type sauvage et mesurer l’efficacité du phényl de sulfone morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyle (LHVS, un composé de protéase-ciblage de cystéine) concernant l’inhibition de la croissance intracellulaire parasite. Un protocole de suppression de gènes à base de CRISPR-Cas9 à base de CRISPR-Cas9 dans Toxoplasma utilisant 50 régions homologues de 50 bp pour la recombinaison dépendante de l’homologie (HDR). En quantifiant les efficacités d’inhibition du LHVS dans les parasites de type sauvage et TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease), il est démontré que le LHVS inhibe la croissance des parasites de type sauvage plus efficacement que la croissance de la TgCPL est une cible à laquelle LHVS se lie dans Toxoplasma. La sensibilité élevée et le fonctionnement facile de cet essai de croissance basé sur la luciferase le rendent approprié pour surveiller la prolifération de Toxoplasma et évaluer l’efficacité de drogue d’une manière élevée de débit.

Introduction

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire très réussi qui infecte environ un tiers de la population humaine. Son taux de transmission élevé est principalement dû à ses diverses voies de transmission, y compris la consommation de viande insuffisamment cuite, l’exposition aux réservoirs de mammifères et la transmission congénitale pendant la naissance. T. gondii provoque principalement des infections opportunistes qui peuvent conduire à une morbidité sévère et la mortalité chez les individus immunodéprimés^1,2,3,4,5,6. Les antibiotiques actuellement utilisés pour le traitement de la toxoplasmose aigue sont particulièrement inefficaces dans le traitement des infections congénitales et latentes et provoquent des réactions graves chez certaines personnes^3,7,8. Il existe donc un besoin urgent d’identifier de nouvelles thérapies. Comprendre les différences dans les processus subcellulaires au sein de Toxoplasma et de son hôte aidera à identifier les cibles potentielles de médicaments. Par conséquent, des techniques efficaces et pratiques de manipulation du génome sont nécessaires pour étudier les rôles des gènes individuels au sein de Toxoplasma. En outre, Toxoplasma appartient au phylum Apicomplexa, qui comprend plusieurs autres agents pathogènes humains importants, tels que Plasmodium spp. et Cryptosporidium spp. Par conséquent, Toxoplasma peut être utilisé comme un organisme modèle pour aider à étudier la biologie de base chez d’autres parasites apicomplexan.

Pour identifier de nouveaux antibiotiques contre les agents pathogènes microbiens, le dépistage à haut débit d’une bibliothèque de composés chimiques est initialement effectué pour déterminer leur efficacité dans la répression de la croissance microbienne. Jusqu’à présent, plusieurs essais de croissance à base de microplates ont été développés pour mesurer la croissance intracellulaire de T. gondii (c.-à-d. la quantification à base d’incorporation ³H-uracil⁹, la détection quantitative des parasites à base d’ELISA à l’aide de T. gondii-anticorps spécifiques^10,11, la mesure protéinée journaliste à l’aide de souches Toxoplasma ^12,13et une imagerie à haute teneur récemment développée assay¹⁴).

Ces stratégies individuelles ont toutes des avantages uniques; toutefois, certaines limitations limitent également leurs demandes. Par exemple, puisque Toxoplasma ne peut se répliquer qu’à l’intérieur des cellules animales nucléées, l’autofluorescence et la liaison non spécifique des anticorpsanti-T. gondii pour héberger des cellules provoquent des interférences dans les mesures à base de fluorescence. De plus, l’utilisation d’isotopes radioactifs exige une conformité particulière à la sécurité et des problèmes de sécurité potentiels. Certains de ces essais sont plus appropriés pour évaluer la croissance à un seul moment plutôt que la surveillance continue de la croissance.

Présenté ici est un protocole basé sur la luciferase pour la quantification de la croissance intracellulaire de Toxoplasma. Dans une étude précédente, le gène NanoLuc luciferase a été cloné sous le promoteur de toxoplasma tubulin, et cette construction d’expression luciferase a été transfected dans le type sauvage (RH-ku80ô hxg souche) parasites pour créer un RH'ku80hxg::NLuc souche (appelé RH'ku80::NLuc ici)¹⁵. Cette souche a servi de souche parentale pour la détermination intracellulaire de croissance et la suppression de gène dans cette étude. À l’aide duRH-ku80:: soucheNLuc, la croissance des parasites dans les fibroblastes en prépuce humain (FSF) a été surveillée sur une période de 96 h post-infection pour calculer le temps de doublement des parasites.

En outre, l’efficacité d’inhibition de LHVS contre la croissance de parasite peut être déterminée en traçant des taux de croissance de Toxoplasma contre des concentrations sérieuses de LHVS pour identifier la valeur_{IC 50.} La littérature précédente a rapporté que TgCPL est une cible principale de LHVS dans les parasites et que le traitement avec LHVS diminue le développement des infections aigues et chroniques de Toxoplasma ^16,17,18,19. En outre, RH-ku80::NLuc a été utilisé comme la souche parentale pour la modification du génome pour générer une souche TgCPLdéficiente (RH'ku80'cpl::NLuc), et l’inhibition de LHVS a été mesurée par rapport à ce mutant. En observant un décalage des valeurs IC₅₀ pour LHVS dans les parasites TgCPL-déficientspar rapport à la souche WT, il a été validé que TgCPL est ciblé par LHVS in vivo.

Dans ce protocole,RH-ku80::NLuc est utilisé comme la souche parentale, qui n’a pas une voie efficace non-homologe de jointure (NHEJ), facilitant ainsi double multisegment homologie-dépendance recombinaison (HDR)^20,21. En outre, 50 régions homologues bp sont flanqués aux deux extrémités d’une cassette de résistance aux médicaments par PCR. Le produit PCR sert de modèle de réparation pour enlever l’ensemble du locus génétique via HDR à l’aide d’outils d’édition du génome à base de CRISPR-Cas9. Ces courtes régions homologues peuvent être facilement incorporées dans les amorces, fournissant une stratégie pratique pour la production du modèle de réparation. Ce protocole peut être modifié pour effectuer la suppression universelle des gènes et le marquage des gènes endogènes.

Par exemple, dans notre publication la plus récente, trois gènes de protéase, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease), et TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-like protease 1), ont été génétiquement ablés dans TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistance transporteur) -parasites déficients en utilisant cette méthode¹⁵. En outre, TgAMN (un aminopeptidase putatif N [TgAMN, TGGT1_221310]) a été étiqueté endogènement¹⁵. Le laboratoire de Lourido a également rapporté l’utilisation de régions homologues courtes dans la gamme de 40-43 bp pour l’introduction de la mutation génétique dirigée par le site et le marquage de gène endogène dans le génome de Toxoplasma utilisant une méthode similaire²². Ces modifications réussies du génome suggèrent qu’une région homologue de 40-50 bp est suffisante pour la recombinaison efficace de l’ADN dans la souche TgKU80-déficiente,qui simplifie grandement la manipulation du génome dans Toxoplasma gondii.

Protocole

Toxoplasma gondii est classé dans le groupe de risque 2 et doit être traité à un niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Le protocole a été examiné et approuvé par le Comité de biosécurité institutionnelle de l’Université Clemson.

1. Toxoplasma croissance basée à Luciferase

1. Fibroblastes de prépuce humain de graines (FFC) 1 semaine avant l’inoculation de parasite pour s’assurer que les cellules hôtes sont entièrement confluentes. Effectuez un simulacre d’essai dans une plaque transparente pour s’assurer que les parasites restent intracellulaires tout au long de la période d’évaluation.
   REMARQUE: Ici, l’essai est effectué en 96 microplates de puits. Selon les besoins expérimentaux, il peut être mis à l’échelle jusqu’à 384 ou 1536 microplates de puits.
2. Passer les parasites Toxoplasma en FFC confluents 2 jours avant utilisation en transférant 0,3 à 0,4 ml de parasites entièrement lysed dans un flacon T25. Incuber les cellules hôtes infectées à 37 oC avec 5% de CO₂ pendant 2 jours.
3. Syringe 5 mL de parasites fraîchement lysed à travers une aiguille de sécurité 21 G 5x pour libérer les parasites intracellulaires, puis passer à travers un filtre de 3 m pour enlever les débris cellulaires hôtes. Rincer les parasites résiduels hors du flacon à l’aide de 7 ml de milieu D10 sans phénol, puis passer à nouveau à travers le filtre.
4. Centrifuge parasites à 1000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Verser le supernatant et réutiliser la pastille dans 10 ml de phénol sans phénol D10 médias.
5. Comptez les parasites à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la concentration.
6. Diluer les parasites à 1 x 10⁴ parasites/mL pour la souche de type sauvage (WT). Pour les souches parasites déficientes en croissance, augmentez la concentration en conséquence pour observer une augmentation significative des signaux de luciferase.
7. Aspirez soigneusement les supports de 96 microplaces de puits pré-ensemencées de FFC et inoculez 150 L de réanimation de parasite dans des puits dans un format de trois colonnes et cinq rangées, ce qui représente trois répliques techniques et cinq points de temps.
8. Incuber la microplaque à 37 oC et 5% de CO₂ pour 4 h.
9. Aspirez soigneusement les médias des puits pour éliminer les parasites non envahis, puis remplissez les puits avec des supports sans phénol RT dans chaque rangée (sauf pour la première rangée).
10. Mélanger des volumes égaux de TAMPON d’analyse de 2x luciferase et diluer le substrat de luciferase à 12,5 m.
11. Ajouter 100 L de substrat de luciferase dilué dans chaque puits de la rangée supérieure. Incuber les microplates à RT pendant 10 min pour permettre aux cellules de lyse complètement.
12. Mesurer l’activité de luciferase à l’aide d’un lecteur de microplaque. Les paramètres du lecteur de plaques sont répertoriés dans le tableau 1. Chaque lecture représente le nombre initial de parasites envahis à 4 h post-infection.
13. Répéter les étapes 1.9-1.12 pour chaque rangée toutes les 24 h pendant 4 jours sans changer le milieu. Ces lectures reflètent le nombre total de parasites répliqués à 24 h, 48 h, 72 h et 96 h post-infection.
14. Calculez les lectures moyennes à chaque point de temps et divisez-les par les lectures moyennes à 4 h pour déterminer les changements de pli dans la croissance des parasites au fil du temps.
15. Tracez les données à l’aide d’un logiciel graphique. Une table de lecture de croissance représentative et des parcelles de RH-ku80:: Les parasitesNLuc sont montrés dans la figure 1A,B.
16. Pour calculer le temps de doublement, tracez les valeurs journal2 des changements de pli aux points de temps individuels au cours du temps d’incubation. Utilisez une fonction de régression linéaire pour calculer la pente, ce qui représente le temps de doublement de chaque souche(figure 1A,C).

2. Évaluation de l’efficacité de l’inhibition du composé chimique contre la croissance de Toxoplasma

REMARQUE : Ici, l’évaluation de l’inhibition de LHVS dans la croissance de Toxoplasma est présentée comme exemple. Huit concentrations différentes de LHVS sont testées, et trois répliques techniques sont effectuées pour chacune des trois répliques biologiques pour les deux RHku80::NLuc et RH'ku80'cpl:: souchesNLuc.

1. Avant l’infection par parasite, les FSF de graine à 96 microplaques de puits dans le format de trois rangées et neuf colonnes pour une réplique biologique par composé par souche. Les cellules hôtes seront autorisées à se développer pendant au moins 7 jours avant l’utilisation.
2. PassRH-ku80::NLuc et RH'ku80'cpl::NLuc parasites pendant 2 jours avant l’utilisation. Suivez les étapes 1.2-1.6 pour la purification et la quantification des parasites. Résuspendez les parasites dans les médias sans phénol à 1 x 10⁴ parasites/mL.
3. Aspirer les supports d’une plaque contenant des FFC confluents et inoculer chaque puits avec 150 l de résuspension parasite. Incuber la microplaque à 37 oC et 5% de CO₂ pour 4 h.
4. Préparer le LHVS à huit concentrations différentes dans un réservoir de 12 puits par dilution en série. En général, les concentrations sont multipliées par trois d’une manière de dilution sérielle.
   REMARQUE : La concentration la plus faible est réduite de 6 561 fois par rapport à la concentration la plus élevée. Le changement de pli de la dilution peut être ajusté en conséquence en fonction des différentes propriétés des composés individuels.
5. À 4 h post-infection, les supports d’aspiration pour enlever les parasites non envahis et remplir chacun des colonnes 2-9 avec 150 L de médias complétés par LHVS à différentes concentrations. Laissez la première colonne remplie de milieu régulier pour servir de contrôle non traité.
6. Incuber la microplaque à 37 oC et 5% de CO₂ pour un supplément de 96 h.
7. Effectuez les étapes 1.9-1.11 et mesurez l’activité de luciferase des puits individuels.
8. Moyenne des activités de luciferase de trois répliques techniques à partir de puits de chaque concentration individuelle de LHVS.
9. Divisez l’activité moyenne de luciferase pour chaque concentration de LHVS par l’activité moyenne de luciferase dérivée des parasites non traités pour calculer l’activité normalisée de luciferase en pourcentage.
10. Tracez les activités de luciferase normalisées par rapport aux concentrations individuelles de LHVS à l’aide d’un logiciel graphique(figure 2). L’inhibition de la pyriméthamine contre la croissance des parasites est également mesurée comme un contrôle. La pyriméthamine est un antibiotique clinique utilisé pour traiter la toxoplasmose aigue en inhibant le métabolisme de l’acide folique dans Toxoplasma.
11. Calculez les valeurs IC₅₀ pour les composés individuels à l’aide de la méthode intégrée dans le logiciel graphique, réponse normalisée par rapport [inhibiteur], dans le cadre du programme de régression de « dose-réponse-inhibition ». L’IC₅₀ est calculé à l’aide de la formule suivante :
    Y 100/(1 X/IC₅₀)
    Où : Y représente les activités normalisées de luciferase des cellules infectées sous différentes concentrations d’inhibiteur, et X représente des concentrations individuelles d’inhibiteur.

3. Suppression génétique à base de CRISPR-Cas9 chez les parasites Toxoplasma

1. Génération d’une construction plasmide exprimant l’ARN guide (sgRNA) et Cas9 pour la suppression d’un gène d’intérêt
   1. Allez à www.ToxoDB.org et récupérer toute la séquence de codage génétique, y compris les introns et les exons, ainsi que 1,5 kb 5'-UTR et 3'-UTR (régions non traduites).
      REMARQUE : Ici, TgCPL (TGGT1_321530) est visé comme un exemple représentatif.
   2. Copiez la séquence TgCPL récupérée dans le logiciel d’analyse de séquence (se référer à La Table des Matériaux pour le nom et la version) et étiquetez les régions 5'- et 3'-UTR.
   3. Sélectionnez l’icône Tools dans la barre de menu supérieure, puis sélectionnez Cloning . Trouver des sites CRISPR.
   4. Choisissez 3'(Cas9) ' pour l’emplacement du site PAM et sélectionnez le dossier contenant la séquence du génome de Toxoplasma dans la section de notation de spécificité. Laissez le reste des paramètres par défaut.
   5. Choisissez un sgRNA avec les deux critères suivants: 1) montrant un score de spécificité élevé, généralement -gt;98%, et 2) manquant d’un G suivant le NGG, un protospacer motif adjacent (PAM) séquence. Le sgRNA sélectionné est généralement situé à des endroits proches du début et arrêter les codons du gène d’intérêt.
   6. Copiez la séquence du sgRNA sélectionné et collez-le dans le modèle d’amorce suivant.
      
      La partie en rouge représente la séquence TgCPL sgRNA sélectionnée. Il peut être remplacé par différents sgRNAs pour divers gènes d’intérêt.
      REMARQUE : Si le sgRNA sélectionné ne commence pas avec G, ajoutez G au début du sgRNA pour aider à améliorer son expression.
   7. Effectuez une réaction PCR pour modifier le plasmide préexistant exprimant le sgRNA (figure 3A) qui cible Toxoplasma uracil phosphoribosyltransferase (TgUPRT) gène²³ à l’aide d’un prémélange PCR avec les paramètres fournis dans le tableau 2.
   8. Exécuter le produit PCR sur un gel agarose pour confirmer l’amplification réussie. On s’attend à ce qu’un produit PCR de 10 kb soit amplifié(figure 3B).
   9. Extraire le produit PCR à l’aide d’un kit d’extraction de gel d’ADN et circulairez-le à l’aide d’un kit de mutagenesis dirigé par le site. Consultez le tableau 3 pour la recette. Incuber la réaction pendant 10-20 min à RT.
   10. Transformez le produit PCR circulaire en E. coli et choisissez 10 clones pour une vérification plus poussée de l’incorporation du sgRNA conçu.
   11. Cultivez deux clones et extrayez des plasmides. Couper les plasmides purifiés avec BamHI et EcoRV. Les plasmides candidats donneront deux bandes à 2,4 kb et 7,2 kb(figure 3C).
   12. Envoyez les plasmides pour le séquençage Sanger à l’aide d’amorces inversées M13 pour confirmer le remplacement réussi de TgUPRT sgRNA avec le sgRNA conçu(figure 3D).
2. Génération de modèle de réparation pour la suppression des gènes via le mécanisme HDR
   1. Selon les sites de ciblage du sgRNA sélectionné, localisez 50 bp de 5'-UTR ou 3'-UTRs du gène cible pour la recombinaison dépendante de l’homologie (HDR, voir section de discussion). La sélection des régions suit les critères énumérés ci-dessous, selon l’emplacement des cibles sgRNA.
      1. Si le site de clivage par Cas9 est situé en amont à partir du codon de départ, sélectionnez ce qui suit: une séquence d’ADN de 50 bp en amont du site de clivage comme la région HDR gauche, et une séquence d’ADN de 50 bp en aval de l’arrêt codon comme la bonne région HDR.
      2. Si le site de clivage par Cas9 se trouve entre le début et l’arrêt des codons, sélectionnez ce qui suit : une séquence d’ADN de 50 bp en amont du codon de départ comme région HDR gauche, et une séquence d’ADN de 50 bp en aval du codon d’arrêt comme région HDR droite.
      3. Si le site de clivage par Cas9 est situé en aval du codon d’arrêt, sélectionnez ce qui suit : une séquence d’ADN de 50 bp en amont du codon de départ comme région HDR gauche, et une séquence d’ADN de 50 bp en aval du site de clivage comme région HDR droite.
         REMARQUE : Pour le gène TgCPL, le site de clivage est situé entre les codons de démarrage et d’arrêt. Ainsi, les amorces suivantes sont conçues pour amplifier le modèle de réparation en utilisant pMDC64 comme modèle, qui code une cassette de résistance à la pyriméthamine. Les séquences en anneal noir au plasmide pMDC64 pour l’amplification DE PCR. Les régions étiquetées en rouge sont des séquences spécifiques À TgCPLpour la recombinaison homologue.
         
   2. Effectuez le PCR à l’aide d’un prémélange PCR dans les conditions PCR décrites dans le tableau 4.
   3. Exécuter le produit PCR sur un gel d’agarose(figure 3E), suivi de l’extraction du gel et des procédures standard de quantification de l’acide nucléique.
      REMARQUE : Si la bande attendue ne peut pas être amplifiée avec succès, optimisez les conditions pcR et/ou changez les paires d’amorce.
3. Transfection Toxoplasma
   1. PassRH-ku80:: parasitesNLuc pendant 2 jours dans un flacon T25 contenant des FFC confluents. Un flacon T25 de parasites entièrement lysed est suffisant pour deux à trois transfections.
   2. Syringe et filtre-purifier les parasites comme décrit dans l’étape 1.2. Résuspendez les parasites dans le tampon cytomix et tournez vers le bas à 1.000 x g pendant 10 min à RT.
   3. Laver les parasites granulés avec 10 ml de tampon cytomix et faire tourner les parasites à 1000 x g pendant 10 min à RT.
   4. Versez soigneusement le supernatant et réutilisez les parasites dans le même tampon à une concentration de 1 x 10⁸ parasites/mL.
   5. Mélanger 2 g d’ADN du modèle de réparation avec 20 g de plasmides d’expression sgRNA/Cas9 (rapport de masse de 1:5, soit l’équivalent d’un rapport de 1:3 molaire). Si le rendement d’amplification du modèle de réparation est faible, réduisez l’entrée des deux pièces d’ADN en conséquence. Un minimum de 0,5 g de modèle de réparation peut être utilisé.
   6. Mélanger 400 l de réanimation de parasite, d’ADN et de 5 L de glutathion réduite DE 200 mM ATP/500 mM (GSH) dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL. Porter le volume total à 500 L avec tampon cytomix, si nécessaire.
   7. Transférer le mélange de parasites et d’ADN dans une cuvette d’électroporation (largeur d’écart de 4 mm) et effectuer une électroporation (2 kV de tension, 50 résistance) à l’aide d’un appareil d’électroporation.
   8. Transférer les parasites électropolés dans un flacon T25 contenant des FFC confluents dans un milieu frais D10. Appliquer antibiotique approprié pour la sélection des médicaments après 24 h.
   9. Maintenez la pression sélective des médicaments jusqu’à ce que la croissance des parasites transgéniques soit stable.
   10. Purifier l’ADN génomique de la population knock-out et vérifier l’intégration de la cassette de résistance à la pyriméthamine dans le locus TgCPL par PCR. Après vérification, passez à l’article 3.4. Si ce n’est pas le cas, effectuez une autre série de transfection de parasites et de sélection de médicaments. L’incapacité de détecter l’intégration correcte de la cassette de résistance aux médicaments suggère généralement que le gène cible est essentiel ou que le locus génétique n’est pas accessible.
4. Clonage de parasites knock-out
   1. Semences deux microplaques de puits 96 avec des cellules HFF et incuber à 37 oC et 5 % de CO₂ pendant 1 semaine avant le clonage des parasites.
   2. Passer de 0,3 à 0,4 ml de la population de parasites transgéniques dans un flacon T25 contenant des FFC confluents et les cultiver pendant 2 jours. Envisagez de passer plus de parasites si le mutant montre des défauts de croissance.
      REMARQUE : Pour obtenir le meilleur rendement et la meilleure viabilité, les cellules hôtes sont fortement infectées par les parasites, et la plupart des parasites sont conservés au stade intracellulaire.
   3. Cellules hôtes infectées par la seringue et parasites frais lysés comme mentionné à l’étape 1.3. Resuspendez les parasites dans D10 milieu et les faire tourner vers le bas à 1.000 x g pendant 10 min à RT.
   4. Résuspendez les parasites granulés dans 10 ml de D10 moyen.
   5. Comptez les parasites à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la concentration de parasites.
   6. Effectuer une dilution en deux étapes pour amener la concentration à 10 parasites/mL dans le milieu D10 complété par l’antibiotique approprié. Habituellement, la réanimation initiale de parasite est diluée par 1.000 fois, suivie d’une deuxième dilution à 10 parasites/mL.
   7. Aspirer les supports de 96 microplates de puits contenant des FFC confluents et inoculer 150 L de parasites dilués dans chaque puits.
   8. Plaques incubate à 37 oC avec 5% de CO₂ pendant 7 jours sans perturbation pour permettre la formation de plaque. La période d’incubation peut être plus longue si les parasites transgéniques présentent des défauts de croissance.
   9. Filtrer les plaques à l’aide d’un microscope à contraste de phase et marquer uniquement les puits contenant une seule plaque.
   10. Effectuez la colonie PCR pour identifier les clones corrects.
       1. Utilisez des pointes pipette pour gratter le fond de chaque puits pour soulever les monocouches infectées HFF.
       2. Pipet 75 L de la résuspension cellulaire de chaque puits marqué dans 1,5 mL tubes de microcentrifuge.
       3. Tubes de centrifugeuse pendant 10 min à vitesse maximale à RT. Aspirez soigneusement le supernatant et réutilisez la granule dans 10,25 l de tampon de lyse contenant le tampon de dilution et l’additif de libération d’ADN fourni dans le kit (Tableau des matériaux).
       4. Incuber les échantillons pendant 4 min à RT, puis 2 min à 98 oC. Par la suite, les échantillons peuvent être utilisés pour pcR ou stockés à -20 oC jusqu’à l’utilisation. Trois séries de réactions PCR sont utilisées pour tester l’intégration de la cassette de résistance aux médicaments et la perte du gène d’intérêt(figure 4A). Consultez le tableau 5 pour la configuration de réaction PCR et le tableau 6 pour les réglages thermocycler.
   11. Identifiez les clones corrects et transférez quatre clones dans des flacons T25 contenant des FFC confluents.
   12. Après que les clones individuels lyse cellules hôtes, purifier l’ADN génomique pour la vérification plus poussée de PCR.
   13. Si un anticorps reconnaissant la protéine d’intérêt est disponible, suivez une procédure d’immunoblotting standard pour vérifier la perte de la protéine cible dans les KO Toxoplasma corrects. Des images représentatives pour le dépistage d’un mutant TgCPL-deletion sont montrées dans la figure 4B,C.

Résultats

La figure 1 représente un exemple de courbe de croissance pour le RHku80::NLuc strain et le calcul dérivé pour son temps de doublement. En général, l’essai est effectué en trois répliques techniques pour chacune des trois répliques biologiques pour tenir compte des variations des lectures d’activité de luciferase. Afin de calculer le changement de pli normalisé de la croissance des parasites, chaque lecture à 24-96 h post-infe...

Discussion

Ce protocole décrit un protocole basé sur la luciferase pour évaluer la croissance intracellulaire de Toxoplasma et évaluer l’efficacité de l’inhibition des composés chimiques contre la croissance des parasites. Comparée aux stratégies existantes disponibles pour mesurer la croissance intracellulaire de Toxoplasma, cette méthode présente une sensibilité et une spécificité élevées. Tout en surveillant la croissance des parasites, un essai simulé dans une microplaque claire de puits es...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel extraction kit	New England BioLabs	T1020L
BamHI	New England BioLabs	R0316S
Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader	BioTek Instuments
BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System	Harvard Apparatus
Chemically competent E. coli cells	New England BioLabs	C29871
CloneAmp HiFi PCR premix	Takara Bio	639298
Coelenterazine h	Prolume	301-10 hCTZ
EcoRV	New England BioLabs	R3195S
Phire Tissue Direct PCR Master Mix	Thermo Scientific	F170L
Plasmid miniprep kit	Zymo Research	D4054
Q5 Site-Directed Mutagenesis kit	New England BioLabs	E0554S
Software
Geneious software for sgRNA design (version: R11)
GraphPad Prism software (8th version)
SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)