Induction de modification des cellules leptomeningeales par injection intracisterale

Résumé

Nous décrivons une injection intracisternale qui emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée au crâne, éliminant ainsi le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. L’approche peut être utilisée pour la cartographie du destin génétique et les manipulations des cellules leptoméningeales et pour le suivi du mouvement des fluides phériques.

Résumé

Le protocole décrit ici comment injecter des solutions en toute sécurité et manuellement par le biais de la cisterna magna tout en éliminant le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. Les protocoles précédemment publiés recommandent d’utiliser des aiguilles droites qui devraient être abaissées à un maximum de 1-2 mm de la surface durale. La chute soudaine de résistance une fois que la membrane durale a été perforée rend difficile le maintien de l’aiguille dans une position stable. Notre méthode, au lieu, emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée contre l’os occipital du crâne, empêchant ainsi la seringue de pénétrer dans le tissu après perforation de la membrane durale. La procédure est simple, reproductible, et ne cause pas d’inconfort durable chez les animaux opérés. Nous décrivons la stratégie d’injection intracisternale dans le contexte de la cartographie génétique du destin des cellules leptomeningeal vasculaires. La même technique peut, en outre, être utilisée pour répondre à un large éventail de questions de recherche, telles que l’examen du rôle des leptomeninges dans le neurodéveloppement et la propagation de la méningite bactérienne, par ablation génétique des gènes impliqués dans ces phénomènes. En outre, la procédure peut être combinée avec un système d’infusion automatisé pour une livraison constante et utilisé pour le suivi du mouvement du liquide phébrospin par injection de molécules étiquetées fluorescentes.

Introduction

Les cellules leptoméningéales sont une population fibroblaste-like de cellules organisées dans une fine couche superposant le cerveau et exprimant des gènes impliqués dans le collagène crosslinking (par exemple, Dcn et Lum), et dans l’établissement d’une barrière cerveau-méningeal (par exemple, Cldn11)^1,2. Les cellules leptomeningeal sont impliquées dans un large éventail de fonctions physiologiques, du contrôle strict sur le drainage de fluide céphalochental³ à la conduite des progéniteurs neuraux dans le cerveau en développement^4,5. Une étude récente a également proposé que les leptomeninges chez le nouveau-né peuvent abriter des cellules radiales ressemblant à des gliax qui migrent dans le parenchyme du cerveau et se développent en neurones corticaux fonctionnels⁶.

Les cellules leptoméningéales sont situées à proximité des astrocytes de surface et partagent avec eux, ainsi que d’autres astroglias parenchymiques, expression de connexin-30 (Cx30)⁷. La procédure chirurgicale décrite ci-dessous permet l’étiquetage généralisé et spécifique de ces cellules méningées par l’intermédiaire d’une livraison ponctuelle d’endoxifène dans la cisterna magna des souris transgéniques exprimant conditionnellement tdTomato dans les cellules Cx30 (c.-à-d., en utilisant un système CreER-loxP pour la cartographie du destin).⁺ Endoxifen est un métabolite actif de Tamoxifen et induit la recombinaison des cellules exprimant creER de la même manière que Tamoxifen. Il est, cependant, la solution recommandée pour l’application topique, car il se dissout dans 5-10% DMSO, au lieu de fortes concentrations d’éthanol. En outre, l’endoxifène ne traverse pas la barrière cerveau-méningeal, permettant ainsi une recombinaison spécifique des cellules leptomeningéales, sans étiquetage de la population cx30 sous-jacente^et astroglial (voir résultats représentatifs).

La technique présentée ici vise à injecter manuellement et en toute sécurité le composé dans le liquide phérépinal, via un accès direct à la cisterna magna. Contrairement à d’autres procédures plus invasives nécessitant la craniotomie, cette approche permet d’infuser des composés sans causer de dommages au crâne ou au parenchyme cérébral. Ainsi, il n’est pas associé à l’induction des réactions inflammatoires déclenchées par l’activation des cellules parenchymales de glia. Semblable à d’autres stratégies d’injection décrites avant^8,9,10, l’approche actuelle repose sur l’exposition chirurgicale de la membrane dural atlanto-occipital couvrant la cisterna magna, après dissection émoussée des muscles du cou supergel. Cependant, contrairement à d’autres procédures, nous recommandons l’utilisation d’une aiguille pliée à la pointe, qui peut être stabilisée contre l’os occipital pendant l’administration. Ceci empêchera le risque que l’aiguille pénètre trop profondément et endommage le cervelet et le medulla sous-jacents.

Cette intervention chirurgicale est compatible avec les recherches de traçage de la lignée qui visent à cartographier les changements dans les identités cellulaires et les itinéraires de migration à travers les couches parenchymales. Il peut également être adapté aux études d’ablation génétique qui ont l’intention de sonder le rôle des cellules leptoménageesales dans la santé et la maladie, telles que leur contribution au développement cortical⁵ ou la propagation de la méningite bactérienne^3,11. Enfin, il peut être utilisé pour suivre le mouvement des fluides phégonaux lorsqu’il est combiné avec la livraison de traceurs fluorescents chez les animaux de type sauvage.

Protocole

Les interventions chirurgicales présentées par la présente ont été approuvées par Stockholms Norra Djurf’rsetiska Nâmnd et réalisées en accord avec les spécifications fournies par l’institut de recherche (Institut Karolinska, Suède).

REMARQUE: L’injection intracisternale peut être adaptée avec souplesse à de multiples fins de recherche. Nous présentons ci-dessous une procédure développée pour étiqueter efficacement les cellules leptomeningeales pour la cartographie du destin basée sur l’injection d’endoxifène dans une lignée de souris transgénique portant R26R-tdTomato¹² et CreER, ce dernier sous le promoteur Cx30¹³. L’étiquetage de cette population de cellules peut être réalisé par injection de constructions virales en utilisant la même procédure décrite ci-dessous. Enfin, cette approche peut être utilisée pour le suivi du flux de liquide phébrospinal, par perfusion de traceurs fluorescents.

1. Préparation du système d’injection

REMARQUE: Nous recommandons d’effectuer la procédure dans une salle chirurgicale appropriée, et dans des conditions aseptiques. Les outils chirurgicaux peuvent être stérilisés à l’aide de chaleur (autoclave, stérilisateur de perles de verre) ou aseptisés à l’aide d’un désinfectant chimique de haut niveau s’ils sont sensibles à la chaleur. Rincer les instruments avant d’utiliser lors de l’utilisation de la désinfection chimique ou leur permettre de refroidir lorsqu’ils sont aseptisés avec de la chaleur.

1. À l’aide de forceps, plier l’aiguille de la seringue d’injection à 30 degrés à 3 mm de la pointe.
   REMARQUE: Utilisez des seringues Hamilton avec une aiguille biseautée de 30 G.
2. Préparer 1 mg/mL de solution endoxifène, dilué dans 10% DMSO et remplir la seringue avec l’aiguille pliée.
   REMARQUE : Administrer 5 L du composé pour assurer une exposition généralisée des cellules méningées chez la souris adulte C57Bl/6j (vers 25-30 g), bien que des expériences pilotes qui testent différentes concentrations et volumes d’injection puissent être nécessaires pour traiter des animaux d’âges et de souches différents.
3. Ajuster le porte-tête de la souris de sorte que le morceau de bouche est à environ 30 degrés de la surface de la table chirurgicale.
   REMARQUE: Un cadre stéréotaxique avec fixation à trois points (c.-à-d. les oreilles et la bouche) peut également être utilisé pour cette procédure. Dans ce cas, cependant, l’animal ne sera fixé qu’avec le morceau de bouche, tandis que les barres d’oreille peuvent être prolongées sous les membres antérieurs de l’animal et être utilisées pour soutenir le corps de l’animal pendant la procédure.

2. Induction de l’anesthésie

1. Pour les anesthésiques injectables, utilisez les concentrations et les modes d’administration recommandés par l’unité vétérinaire de l’établissement local.
2. Pour les anesthésiques par inhalation, tels que l’isoflurane, préparer l’unité d’administration selon les spécifications du fabricant.
3. Avec l’isoflurane, placez la concentration du composé à 4% pour l’induction de l’anesthésie.
4. Livraison de l’air à un taux de 400 ml/min.
5. Laissez l’unité d’anesthésie remplir la chambre avec l’anesthésique pendant quelques minutes et placez la souris dans la chambre par la suite.
   REMARQUE: Pour les expériences actuelles, nous avons utilisé des souris transgéniques adultes (2 mois et environ 30 g) mâles et femelles portant Cx30-CreER et R26R-tdTomato, et élevés sur un fond C57Bl/6j.
6. Surveillez l’animal lors de l’induction de l’anesthésie. Le modèle de respiration devrait ralentir lorsque la souris est sous anesthésie complète.
7. Retirez l’animal de la chambre et vérifiez la suppression du réflexe de la patte en pinçant délicatement les pattes postérieures.
   REMARQUE: Le réflexe peut encore être présent, mais retardé de quelques secondes. Si tel est le cas, placez l’animal dans la chambre jusqu’à ce que la suppression complète du réflexe de patte ait été réalisée.
8. Administrer l’analgésique (p. ex. Carprofène, 5 mg/kg par injection sous-cutanée) pour faciliter la prise en charge de la douleur postopératoire.

3. Positionnement de l’animal pour la procédure

1. Fixer la tête de l’animal sur le porte-tête. Pour améliorer l’accessibilité à la cisterna magna, placez le corps de l’animal à environ 30 degrés de la surface de la table et de la tête intitulée vers le bas, pour établir un angle de 120 degrés avec le reste du corps et étendre l’arrière du cou pour faciliter l’accès à la cisterna magna(figure 1A).
2. Ajouter des essuie-tout sous l’animal pour soutenir son corps tout au long de la procédure.
3. Fixer l’anesthésie par le morceau de bouche et réduire la concentration d’isoflurane à 2,5 % et la livraison d’air à 200 ml/min.
4. Appliquer la pommade ophtalmique.

4. Exposition de la Cisterna Magna

1. Raser l’arrière du cou de l’animal et désinfecter la zone avec 70% d’éthanol et de bêtadine.
2. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, effectuer une incision de ligne médiane (environ 7 mm de longueur) à partir du niveau de l’os occipital et l’étendre postérieurement.
3. Séparez doucement les tissus conjonctifs superficiels et les muscles du cou tirant latéralement à partir de la ligne médiane avec de fines pincettes à pointe. Ceci exposera la membrane durale superposant la magna de cisterna, formée comme triangle inversé.
4. Utilisez des lances d’absorption stériles ou des cotons-tiges pour contrôler les saignements qui en résultent.
5. Placez un petit séparateur chirurgical pour maintenir les muscles du cou mis de côté et permettre la visualisation de la magna cisterna tout au long de la procédure.

5. Injection intracisternale

1. Pour accéder à la magna cisterna, identifiez l’extrémité cautale de l’os occipital et insérez l’aiguille qui était auparavant pliée immédiatement en dessous.
   REMARQUE: Il y aura une baisse soudaine de la résistance que la membrane durale est perforée. Cependant, la pointe de l’aiguille ne pénétrera que légèrement sous la surface méningée, grâce à sa forme crochetée.
2. Une fois que la dura a été perforée, laissez la pointe pliée de l’aiguille pénétrer sous la surface durale en tirant doucement la seringue vers le haut et parallèle au corps de l’animal, afin de « crocheter » l’aiguille au crâne (voir la figure 1B). Cela assurera une meilleure stabilité et empêchera l’aiguille de pénétrer plus profondément, évitant ainsi le risque d’endommager le cervelet sous-jacent ou la médulle.
3. Injecter le composé lentement pour éviter toute interférence avec le flux naturel du liquide phérépinal.
   REMARQUE: Selon le but de l’expérience, le taux d’infusion peut varier. Si un taux d’infusion lent et régulier est nécessaire (p. ex., lors de l’utilisation de la procédure pour retracer le mouvement du liquide phéxique), il peut être conseillé d’utiliser un système automatisé de microinfusion en combinaison avec la seringue.
4. Après l’injection, laissez l’aiguille reposer sur place pendant 1 min et retirez-la soigneusement. Utilisez des forceps à pointe fine pour faciliter la rétraction de l’aiguille de sa position accrochée.
   REMARQUE: L’utilisation d’une aiguille mince (p. ex., 30 G) n’entraîne pas de dommages importants à la membrane méningéale et à l’écoulement du liquide phérépinal qui en résulte. Si de plus grandes tailles d’aiguilles sont nécessaires, nous recommandons d’arrêter la fuite de liquide en appliquant une pression au site d’injection à l’aide d’une pointe de coton stérile.

6. Conclusion de la procédure et des soins postopératoires

1. Retirez le séparateur et laissez les muscles revenir à leur position d’origine en superposant la membrane durale.
2. Fermez l’incision cutanée à l’aide de quelques gouttes d’adhésif cyanoacrylate.
   REMARQUE: Alternativement, utiliser des sutures absorbables (p. ex., 5-0 sutures de vicryl) et fermer l’incision de la peau avec des points interrompus.
3. Appliquer l’anesthésique local (p. ex., 100 L de 5 % de lidocaïne) sur le site d’incision.
4. Retirer l’animal du support et placer dans une cage propre placée sur un coussin chauffant. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne conscience.
   REMARQUE: On ne s’attend pas à ce que la procédure cause une douleur ou une détresse de longue durée chez l’animal. Néanmoins, la souris doit être surveillée de près pendant les premiers jours postopératoires et des mesures de soulagement de la douleur peuvent être prises chaque fois que cela est jugé nécessaire, et conformément aux recommandations fournies par l’unité vétérinaire de votre établissement.

Résultats

L’injection intracisternale d’endoxifène chez des souris transgéniques exprimant CreER sous le promoteur Cx30¹³ et un reporter fluorescent inductible permet une recombinaison spécifique des cellules leptoméningéales sans étiqueter la surface voisine Cx30-exprimant surface et astrocytes parenchymal dans le cortex (Figure 1). Afin d’accéder à la cisterna magna, l’animal anesthésié est positionné avec son corps et sa t?...

Discussion

Le protocole décrit ici présente une procédure simple et reproductible pour étiqueter les cellules leptomeningeales pour la cartographie du destin. Nous utilisons l’injection intracisternale d’endoxifen, un métabolite actif de Tamoxifen, pour induire l’expression du journaliste fluorescent de tdTomato dans Cx30-CreER ; R26R-tdTomato souris^12,13.

Par rapport à d’autres protocoles utilisés pour accéder au liquide phébros...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760