P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Résumé

Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o^- cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.

Résumé

la recherche sur le traitement des infections pulmonaires progresse vers des modèles in vitro prédictifs de grande complexité. La présence multiforme de bactéries dans les modèles pulmonaires peut ré-adapter l’arrangement épithélial, tandis que les cellules immunitaires coordonnent une réponse inflammatoire contre les bactéries dans le microenvironnement. Bien que les modèles in vivo aient été le choix pour tester de nouveaux anti-infectieux dans le contexte de la mucoviscidose, ils n’imitent toujours pas avec précision les conditions in vivo de ces maladies chez l’homme et les résultats du traitement. Des modèles in vitro complexes des voies respiratoires infectées à base de cellules humaines (épithéliales et macrophages bronchiques) et des agents pathogènes pertinents pourraient combler cet écart et faciliter la traduction de nouveaux anti-infectieux dans la clinique. À cette fin, un modèle de coculture de la lignée épithéliale de la fibrose kystique humaine CFBE41o^- et des macrophages dérivés du monocyte THP-1 a été établi, imitant une infection de la muqueuse bronchique humaine par P. aeruginosa à des conditions d’interface air-liquide (ALI). Ce modèle est mis en place en sept jours, et les paramètres suivants sont simultanément évalués : intégrité de barrière épithéliale, transmigration de macrophage, survie bactérienne, et inflammation. Le présent protocole décrit un système robuste et reproductible pour évaluer l’efficacité des médicaments et les réponses de l’hôte qui pourrait être pertinent pour découvrir de nouveaux anti-infectieux et optimiser leur livraison d’aérosols aux poumons.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène pertinent dans la mucoviscidose (CF) qui contribue à l’affaiblissement des tissus pulmonaires¹. La production de polysaccharides, tels que l’alginate et d’autres exopolysaccharides mucoïdes, coordonne la progression de la maladie, qui conduit à l’observance bactérienne tenace, limite la livraison d’antibiotiques aux bactéries et protège les bactéries contre le système immunitaire hôte². La transition de P. aeruginosa de l’étape planctonique à la formation de biofilm est un problème critique dans ce contexte, facilitant également l’apparition de la tolérance aux antibiotiques.

Dans le contexte des FC, la souris a été principalement utilisée comme modèle. Les souris, cependant, ne développent pas spontanément cette maladie avec l’introduction des mutations de CF³. La plupart des études sur le biofilm bactérien et la susceptibilité aux médicaments ont été réalisées sur des surfaces abiotiques, comme les boîtes de Pétri. Toutefois, cette approche ne représente pas la complexité in vivo. Par exemple, d’importantes barrières biologiques sont absentes, y compris les cellules immunitaires ainsi que l’épithélium muqueuse. Bien que P. aeruginosa soit très toxique pour les cellules épithéliales, certains groupes ont réussi à co-cultiver un biofilm P. aeruginosa plus tôt avec des cellules bronchiques humaines. Ces cellules provenaient de patients atteints de mucoviscidose présentant une mutation CFTR (CFBE41o^- cellules)⁴ et ont permis d’évaluer l’efficacité des antibiotiques⁵ ou d’évaluer la correction de la protéine CFTR pendant l’infection⁶. Un tel modèle a été montré pour améliorer la prévisibilité de l’efficacité des médicaments, en plus de permettre la caractérisation des problèmes avec les médicaments qui ont échoué dans les phases ultérieures du développement de médicaments⁷.

Cependant, dans le poumon, l’épithélium muqueuse est exposé à l’air. En outre, les cellules immunitaires présentes dans les voies respiratoires, comme les macrophages tissulaires, jouent un rôle essentiel contre les agents pathogènes inhalés ou les particules⁸. Les macrophages migrent à travers les différentes couches cellulaires pour atteindre le lumen bronchique et combattre l’infection. En outre, les médicaments inhalés doivent également faire face à la présence de mucus comme un élément non cellulaire supplémentaire de la barrière pulmonaire air-sang⁹. En effet, plusieurs modèles in vitro tridimensionnels complexes (3D) ont été développés, dans le but d’accroître la pertinence in vivo. Les systèmes de coculture augmentent non seulement la complexité des systèmes in vitro pour la découverte de médicaments, mais permettent également d’étudier les interactions cellule-cellule. Une telle complexité a été abordée dans des études sur la migration des macrophages¹⁰, la libération de peptides antimicrobiens par les neutrophiles¹¹, le rôle du mucus dans l’infection⁹, et la réaction épithéliale des cellules aux dommages excessifs¹². Cependant, un modèle in vitro fiable infecté par les FC qui présente la mutation génétique dans la FIBROSE, qui est exposée à l’air (condition physiologique accrue), et intègre les cellules immunitaires fait encore défaut.

Pour combler cet écart, nous décrivons un protocole pour la co-culture humaine stable 3D des voies respiratoires infectées. Le modèle est constitué de cellules et de macrophages épithéliales bronchiques cf humaine, infectées par P. aeruginosa et capables de représenter à la fois une barrière diffusionnelle et immunologique. Dans le but de tester des anti-infectieux à un débit raisonnablement élevé, cette co-culture a été établie sur la membrane filtrante perméable des inserts de plaque de puits, à l’aide de deux lignées cellulaires humaines : CFBE41o^- et macrophages dérivés de monocytes THP-1. En outre, pour étudier éventuellement le dépôt d’anti-infectieux aérosols¹³, le modèle a été établi à l’interface air-liquide (ALI) plutôt que dans des conditions couvertes par le liquide (LCC).

Comme nous le rapportons ici, ce modèle permet d’évaluer non seulement la survie bactérienne sur un traitement antibiotique, mais aussi la cytotoxicité cellulaire, l’intégrité de barrière épithéliale, la transmigration de macrophage, et les réponses inflammatoires, qui sont des paramètres essentiels pour le développement de drogue.

Ce protocole combine deux types de cellules pertinents pour la thérapie par inhalation des voies respiratoires pulmonaires : les macrophages et l’épithélium bronchique de CF. Ces cellules sont ensemencées sur les côtés opposés des inserts de support perméables, ce qui permet l’exposition cellulaire à l’air (appelé l’interface air-liquide (ALI) conditions). Cette co-culture des cellules hôtes est par la suite infectée par P. aeruginosa. Les deux lignées cellulaires hôtes sont d’origine humaine : les cellules épithéliales représentent l’épithélium bronchique de la fibrose kystique, avec une mutation sur le canal CF (CFBE41o^-), et les cellules THP-1¹⁴ sont une lignée cellulaire bien caractérisée comme un macrophages. Une couche épithéliale confluente est d’abord autorisée à se former sur le côté supérieur des inserts de plaque de puits avant que les cellules macrophage-like soient ajoutées au compartiment opposé. Une fois que la co-culture est établie à ALI, le système est inoculé avec P. aeruginosa du côté apical. Ce système de coculture infecté est ensuite utilisé pour évaluer l’efficacité d’un antibiotique, par exemple la tobramycine. Les points d’extrémité suivants sont analysés : intégrité des barrières épithéliales en termes de résistance électrique transépithéliale (TEER), visualisation des interactions cellule-cellule et cellule-bactériose par microscopie à balayage laser confocale (CLSM), survie bactérienne en comptant les unités de formation de colonies (CFU), survie des cellules hôtes (cytotoxicité) et libération de cytokine.

Protocole

1. Croissance et différenciation des cellules dans les inserts de support perméables

1. Cultiver CFBE41o^- dans une fiole T75 avec 13 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% de sérum fœtal de veau (FCS), 1% d’acides aminés non essentiels et 600 mg/L de glucose à 37 °C avec 5 % d’atmosphère CO_2. Ajouter un milieu frais aux cellules tous les 2 à 3 jours.
   1. Détachez les cellules après avoir atteint 70% de confluence dans la fiole avec 3 ml d’acide trypsine- éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 37°C pendant 15 min. Ajouter 7 mL de MEM frais et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 4 min à température ambiante (RT). Jeter le supernatant et ajouter de nouveaux 10 mL de MEM tout en perturbant les amas en faisant doucement des tuyaux de haut en bas.
   2. Comptez les cellules à l’installation d’un compteur cellulaire automatisé ou d’une chambre d’hémocytomètre. Cellules de graines avec une densité de 2 x 10⁵ cellules/puits dans des plaques de 12 puits avec des supports perméables (taille des pores de 3 μm, voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Le compteur cellulaire automatisé détermine le nombre de cellules, la répartition de la taille et la viabilité des cellules (voir tableau des matériaux). Des supports perméables d’une taille de pore de 0,4 μm pourraient être utilisés ici; cependant, les macrophages, dans cet état, devraient être ajoutés directement au côté apical, et leur migration transcellulaire ne sera pas évaluée dans ce cas.
   3. Cellules de semences à condition liquide-liquide (LLC) en ajoutant 500 μL de la suspension cellulaire sur le côté apical du support perméable et 1,5 mL de milieu frais dans le côté basolatéral. Incuber ensuite les cellules à 37°C sous 5% de CO_2,pendant 72 h.
   4. Pour passer à la culture de l’interface air-liquide (ALI), le troisième jour après l’ensemencement, retirer le milieu du côté basolatéral d’abord, puis du côté apical. Pour le côté basolatéral, ajouter 500 μL de MEM frais et changer le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules forment une monocouche confluente.
      NOTE: Pour les conditions utilisées dans ce protocole, le CFBE41o^- les cellules sont généralement confluentes après 3-7 jours en culture.
   5. Évaluer les propriétés de la barrière épithéliale le jour 7 en incubant CFBE41o^- cellules avec 500 μL de cellules moyennes dans le côté apical et 1,5 mL dans le côté basolatéral pendant 1 h, à 37°C sous 5% DE CO₂.
   6. Mesurer les propriétés de la barrière par résistance électrique transépithéliale (TEER), avec une électrode de baguette STX2 et un volt-ohmmètre épithélial; après 7 jours, c’est plus de 300 Ω×cm².
      REMARQUE : Finalement, dans certains inserts membranaires, les cellules ont un TEER faible. Par conséquent, les inserts perméables avec TEER < 300 Ω×cm² ne sont pas utilisés.
2. Pour cultiver les cellules THP-1, les cultiver dans une fiole T75 en utilisant 13 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen complété par 10% FCS, et incuber à 37°C sous 5% DE CO₂. Fractionner les cellules tous les deux jours en ensemencement de 2 cellules^{de 6 cellules/mL} dans une nouvelle fiole T75.
   REMARQUE : Les cellules THP-1 non différenciées sont cultivées sous forme de monocytes en suspension.
   1. Différencier les cellules THP-1 comme suit. Teneur en centrifugeuse d’un T75 à 300 x g pendant 4 min. Jeter le supernatant, resuspender le granulé dans un milieu frais et mettre dans un nouveau T75. Ajouter 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) incubatig les cellules dans RPMI pour 48 h à 37 °C et 5% CO₂ atmosphère¹⁵.
      REMARQUE : Après la différenciation avec la PMA, les cellules ne prolifèrent plus et ne s’attachent plus à la fiole.
   2. Pour détacher les cellules de type macrophage THP-1, lavez-le une fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C et incuber avec 3 mL de solution de détachement cellulaire (p. ex. accutase) contenant 0,5 mM EDTA pendant 10 min à température ambiante.
   3. Inspectez les cellules au microscope inversé pour rechercher le détachement cellulaire. Ajouter 7 mL de milieu frais et la centrifugeuse à 300 x g pendant 4 min à RT.
      REMARQUE : Les macrophages peuvent également être détachés avec la trypsine-EDTA, 37 °C pendant 20 min. Toutefois, la trypsie est plus sévère pour les macrophages que la solution de détachement cellulaire choisie (voir tableau des matériaux).
   4. Après avoir enlevé le supernatant, re-suspendre les cellules macrophage dans 3 ml de THP-1 moyen dans un tube conique de 15 mL, compter les cellules comme décrit dans 1.1.2. et incuber pendant un maximum de 1 h à 37 °C sous 5 % de CO₂ avant de mettre en place la coculture.
      NOTE: Les cellules THP-1 en suspension peuvent être tachées de colorants de viabilité pour l’image de la co-culture plus loin. À cette étape, utilisez la procédure ci-dessous (étape 1.2.5).
   5. Macrophages de tache avec 10 μM d’un colorant de viabilité cellulaire (basé sur la conversion des moiètes d’acétate par estérases intracellulaires, voir tableau des matériaux)dans lequel 3 μL du colorant de viabilité cellulaire est appliqué à la suspension cellulaire. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 °C, 5 % de CO_2,puis laver 1x avec pbs 37°C pour enlever le colorant.
      REMARQUE : Centrifugez les cellules pour enlever le colorant à 300 x g pendant 4 min à température ambiante (RT).

2. Mise en place d’une co-culture épithéliale-macrophage sur supports perméables

1. Utilisez CFBE41o^- monocouches à ALI avec TEER ≥ 300 Ω×cm² (étape 1.1.6.). Retirez le milieu de la chambre inférieure, inversez soigneusement le support à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre stérile (50 mm x 200 mm) et retirez les cellules envahies par les pores membranaires du côté inférieur de la membrane à l’aide d’un grattoir cellulaire.
   REMARQUE : En raison de la taille des pores de 3 μm, les cellules épithéliales ont tendance à se développer à travers les pores vers le côté basolateral. Par conséquent, il faut les enlever avant d’ajouter les macrophages de ce côté. CFBE41o^- les cellules épithéliales pulmonaires peuvent être tachées à cette étape. La procédure à l’étape 1.2.5 peut être utilisée; toutefois, au lieu d’une suspension cellulaire, la solution de colorant dans MEM est appliquée (500 μL côté apical seulement) sur les cellules adhérentes sur le support perméable.
2. Utilisez 2 x 10⁵ cellules/puits (en 200 μL de RPMI) à partir de la suspension cellulaire des macrophages THP-1 différenciés par LA PMA et placez les cellules sur le côté basolatéral des inserts inversés.
3. Fermez soigneusement les plats Petri et incuber pendant 2 h à 37 °C sous 5% DE CO_2.
4. Remettre les inserts dans les microplaques de 12 puits et ajouter 500 μL de mem moyen dans le côté basolatéral de l’insert perméable pour maintenir les conditions d’ALI. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’infection.

3. Infection par P. aeruginosa

REMARQUE : Toutes les étapes suivantes à partir d’ici doivent être effectuées dans un laboratoire de niveau 2 (BSL2) de biosécurité.

1. Inoculer 15 ml de bouillon de lysogenie (LB) complété par une ampicilline de 300 μg/mL dans une fiole Erlenmeyer (50 ml) avec une seule colonie de P. aeruginosa PAO1-GFP.
   NOTE: D’autres souches de P. aeruginosa pourraient également être utilisées ici, par exemple, pao1 type sauvage, PA14, ou souches cliniques, suivant leurs propres protocoles de culture.
2. Incuber les bactéries pendant 18 h à 37°C, en secouant à 180 tr/min.
3. Transférer le contenu après le 18 h à un tube conique de 50 mL et la centrifugeuse à 3850 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et ajouter 10 mL de PBS stérile à 37°C.
4. Mesurer la densité optique sur un spectrophotomètre à 600 nm de longueur d’onde et ajuster la concentration de bactéries utilisant le milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 2 x 10⁵ CFU/mL. Cela correspond à une multiplicité d’infection (MOI) d’une bactérie par cellule épithéliale.
5. Ajouter 100 μL de suspension bactérienne au côté apical du support perméable (étape 2.4.) et incuber à 37 °C sous 5% de CO₂ pendant 1 h, pour permettre l’attachement des bactéries aux cellules. Ensuite, retirez soigneusement le liquide apical à l’aide d’une pipette pour rétablir les conditions d’ALI. Gardez certains échantillons non infectés comme un contrôle.
   REMARQUE : À ce stade, les bactéries attachées doivent être plaquées dans l’agar LB (voir les étapes 5.4/5.5) pour déterminer les bactéries initiales inoculum.
6. Incuber le médicament d’intérêt après l’adhérence bactérienne dans les cellules. Pour les expériences de traitement, ajouter 500 μL d’une solution médicamenteuse diluée dans le milieu cellulaire (dans ce protocole tobramycine 6 μg/mL a été utilisé) au côté apical. Ajouter 1 500 μL de milieu cellulaire sans drogue du côté basolatéral.
   REMARQUE : Au lieu d’inculquer les médicaments comme solution, le modèle peut également être adapté au dépôt d’aérosols. À cette fin, les cellules d’ALI sont alimentées du côté basolatéral avec 500 μL de milieu cellulaire. Le médicament est ensuite d’abord nébulisé et autorisé à être déposé dans le compartiment apical par un dispositif approprié (non décrit ici). L’échantillon infecté et traité peut être vérifié pour les critères d’évaluation décrits aux sections 4 à 7. À partir de cette étape, des supports perméables peuvent être utilisés pour créer des images (section 4) ou pour obtenir des résultats de la croissance des bactéries et de la viabilité des cellules des mammifères, entre autres (sections 5 à 7).

4. Préparation d’échantillons pour la microscopie à balayage laser confocale (CLSM)

1. Après l’établissement de la co-culture, l’infection et le traitement médicamenteux, retirer tous les milieux du côté atical et basolatéral. Laver 1x avec pbs à 37°C, puis fixer les cellules avec 3% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 h à RT (300 μL sur apical/600 μL sur basolatéral). Les noyaux cellulaires sont tachés de 5 μg/mL de DAPI-PBS pendant 30 min à température ambiante.
   ATTENTION: PFA est dangereux.
2. Couper les membranes à l’aide d’un scalpel et les placer entre deux lames de couverture de microscopie de 12 mm à l’aide d’unsupport de montage (voir tableau des matériaux). Laissez sécher à l’intérieur du banc d’écoulement pendant 30 min avant d’être stocké à 4 °C. Visualisez par microscopie à balayage confocal.
   NOTE : Après la co-culture et avant le montage, l’immunostaining de jonctions serrées peut être exécuté. Pour cela, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde 3% pendant 30 min, lavées à nouveau avec pbs, et permeabilisées avec de la saponine 0,05%/BSA 1% dans PBS. Dans ce protocole, la protéine zonula occlus (ZO-1) a été détectée par l’intermédiaire de la souris anticorps anti-humain ZO-1 (1:400, incubation à 4 °C pendant la nuit). Les échantillons ont ensuite été incubés pendant 2 h à RT avec l’anticorps anti-souris de chèvre Alexa Fluor 633 (1:2000 en rouge). Les noyaux ont été tachés avec du DAPI (1 μg/mL) et montés avec un support de montage sur des couvercles.
3. Utilisez un microscope confocal pour l’imagerie des membranes stockées. Choisissez des objectifs d’immersion aquatique 25x ou 63x et des lasers à 405, 488, 505 ou 633 nm pour la détection. Les images doivent avoir une résolution de 1024 x 1024 pixels.
   REMARQUE : Les lasers sont choisis en fonction de la tache utilisée.
4. Acquérir des vues apical et transversales et utiliser le mode de stack zeta (10–15 piles) pour la construction d’un modèle tridimensionnel à l’aide d’un logiciel d’imagerie.

5. Mesure de la prolifération bactérienne par l’intermédiaire d’unités de formation de colonies (CFU)

1. Recueillir le milieu atical et basolatéral (contenant des bactéries) pour évaluer l’EC des bactéries non attachées. Recueillir 500 μL sur les côtés apical et basolatéral et les mettre en commun.
   REMARQUE : Utilisez cette suspension directement pour compter les bactéries (étape 5.4) ou la centrifugeuse à 21 250 x g pendant 10 min pour évaluer la déshydrogénase lactate (LDH) du supernatant (section 6) et/ou re-suspendue dans pbs pour compter les bactéries extracellulaires (étape 5.4).
2. Évaluer la survie des bactéries attachées et/ou intériorisées dans les cellules en ajoutant 500 μL d’eau froide déionisée stérile dans chaque compartiment du support perméable. Incuber les cellules pendant 30 min à température ambiante.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être plaqués sur un agar LB (voir étape 5.4) ou congelés (comme plaque d’insertion entière) à -20 °C pour le placage plus tard.
3. Pour l’évaluation de l’UC des bactéries adhérentes/intériorisées, décongeler des échantillons à 37°C pendant 10 min (s’ils sont congelés). À l’aide de pointes de pipette pour chaque puits, grattez la surface de la membrane et la pipette de haut en bas pour enlever tout le contenu adhérent.
   REMARQUE : À cette étape, toutes les cellules épithéliales sont lysées et les bactéries adhérentes/intériorisées sont disponibles sous forme de suspension à plaquer.
4. Avec la suspension bactérienne des deux fractions, effectuer une dilution en série 1/10 en utilisant Tween-80 0,05% dans PBS et plaquer les bactéries sur les plaques d’agar LB.
   REMARQUE : Des dilutions entre 1 et 10 sont recommandées. Les bactéries doivent être comptées dans la dilution la plus élevée, où les colonies uniques sont identifiées pour la première fois.
5. Incuber les plaques d’agar à 30°C pendant 16 à 72 h pour compter les colonies, et calculer l’UC en conséquence.
   REMARQUE : Une température de 30 °C au moment de l’incubation des plaques est essentielle pour les échantillons traités et pour observer la croissance retardée des colonies.

6. Évaluation de la cytotoxicité cellulaire par l’essai de déshydrogénase de lactate

1. Utiliser le supernatant des cellules infectées contenant des bactéries (à partir de l’étape 5.1) pour l’évaluation de la viabilité cellulaire pour l’essai¹⁶de LDH . Centrifuge le supernatant à 21 250 x g pendant 10 min pour granuler les bactéries et éventuellement le reste des cellules. Utilisez le supernatant sans bactéries pour mesurer la libération de LDH.
   NOTE: Le supernatant ne doit pas être congelé avant de mesurer la LDH par ce test.
2. Transférer 100 μL du supernatant dans une plaque de 96 puits et ajouter 100 μL de la solution d’analyse LDH (voir le tableau des matériaux). Incuber à température ambiante pendant 5 min dans l’obscurité, puis lire l’absorption à 492 nm.

7. Évaluation de la libération de cytokines humaines

1. Pour la quantification de la cytokine, utilisez l’immunoassay¹⁷elisa ou cytométrique de tableau de perles (voir le tableau des matériaux). Pour cela, le supernatant de centrifugeuse de l’étape 5.1 à 21.250 x g pendant 10 min et mesurer soit immédiatement ou stocker -80 °C pendant jusqu’à 15 jours jusqu’à l’analyse.
2. Évaluez les supernatants avec un kit ELISA disponible dans le commerce.
   REMARQUE : La procédure suit les instructions de fabrication, qui comprennent le revêtement des plaques avec l’anticorps de capture, l’ajout des échantillons (100 μL) et les normes de cytokine, l’incubation, le lavage et l’ajout d’anticorps de détection pour fournir une mesure colorimétrique de la présence de cytokine. Alternativement, la cytométrie de flux peut être employée pour mesurer des cytokines par l’intermédiaire des kits disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux).

Résultats

La figure 1A montre la morphologie de la coculture par rapport aux cellules épithéliales bronchiques humaines et aux macrophages après avoir augmenté à la fois pendant 24 h sur le côté atical et basolateral des supports perméables, respectivement. L’intégrité de la barrière épithéliale est démontrée par teer plus élevé (834 Ω×cm²) et CLSM par immunostaining pour la protéine de jonction serrée ZO-1 (Figure 1B). Les mêmes résult...

Discussion

Cet article décrit un protocole pour une co-culture 3D des voies respiratoires infectées, constitué par la ligne de cellules épithéliales bronchiques de fibrose kystique humaine CFBE41o- et la ligne de cellules macrophages humaines dérivées de monocytes THP-1. Le protocole permet l’évaluation de l’intégrité des barrières épithéliales, de la transmigration des macrophages, de la survie des bactéries et de l’inflammation, qui sont des paramètres importants lors de l’essai simultané de l’efficacit?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	-
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o- cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754