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Résumé

Un protocole est présenté combinant la compensation de tissu avec la microscopie de fluorescence de feuille de lumière (LSFM) pour obtenir des images tridimensionnelles et de résolution cellulaire des vaisseaux lymphatiques et des ganglions lymphatiques (LNs) recueillant le fluide céphalo-rachidien (CSF) et le fluide épidural spinal.

Résumé

Le système lymphatique associé au système nerveux central (SNC) comprend la vascularisation lymphatique qui tourne autour du cerveau, de la moelle épinière et de ses LN associés. Le système lymphatique associé au SNC est impliqué dans le drainage des macromolécules CSF et des cellules immunitaires méningées vers les LN drainant le SNC, régulant ainsi le déblaiement des déchets et la surveillance immunitaire dans les tissus du SNC. Présenté est une nouvelle approche pour obtenir des images tridimensionnelles (3D) et de résolution cellulaire des lymphatiques associés au SNC tout en préservant l’intégrité de leurs circuits dans les tissus environnants. Le protocole iDISCO+ est utilisé pour immunolabelr les vaisseaux lymphatiques dans les préparations de montage entier décalcifiés et dégagés de la colonne vertébrale qui sont ensuite photographiés avec la microscopie de fluorescence de feuille de lumière (LSFM). La technique révèle la structure 3D du réseau lymphatique reliant les espaces méningéal et épidural autour de la moelle épinière aux vaisseaux lymphatiques extravertébraux. Les images 3D des circuits de drainage des traceurs moléculaires précédemment injectés dans le CSF par l’intermédiaire de la cisterna magna ou du parenchyme spinal thoracoumbar. L’approche iDISCO+/LSFM offre des occasions sans précédent d’explorer la structure et la fonction du système lymphatique associé au SNC en biologie neurovasculaire, neuroimmunologie, cancer du cerveau et des vertèbres, ou biologie vertébrale des os et des articulations.

Introduction

Le SNC est entouré par le CSF et superposant des couches de méninges, de tissu épidural et d’os. Au total, le CSF offre une protection physique au cerveau doux et à la moelle épinière. Il est principalement sécrété par le plexus choroïde et les membranes méningéales (c.-à-d. le pia mater, l’arachnoïde et le dura mater). Le complexe CSF-méningéal établit également une interface fonctionnelle entre les tissus du SNC et le reste du corps, contribuant ainsi à l’homéostasie du SNC. Tout d’abord, le CSF pénètre le parenchyme du SNC à travers les espaces paraériels du SNC et interagit dynamiquement avec le fluide interstitiel (ISF)1 via le système glymphatique (glia-lymphatique), qui se compose des espaces paravasculaires et des membranes des pieds d’extrémité astrocytes autour des vaisseaux CNS2,3,4. Les déchets métaboliques et l’excès de liquide sont ensuite finalement effacés par drainage périvasculaire intra-muros directement du parenchyme cérébral vers la circulation systémique3, ainsi que les espaces paraventous vers le CSF et par l’intermédiaire des vaisseaux lymphatiques drainant le cerveau, selon le modèle glympmatique2,4. L’écoulement du CSF se fait principalement par l’intermédiaire du système lymphatique, à travers la plaque cribriforme et les vaisseaux lymphatiques extracrâniens associés5,,6,7, ainsi que par les vaisseaux lymphatiques méningés, qui convergent aux LN8,,9,10,11,12 ( Figure1). Un rôle important, bien que secondaire, dans la sortie de CSF est pris par les villi arachnoïdes crâniens, qui pénètrent la lacune des sinus veineux méningés13.

Les circuits de drainage du SCF ont fait l’objet d’une étude approfondie au moyen d’approches expérimentales basées sur l’injection de traceurs colorés/fluorescents dans le SNC ou le CSF, suivis de l’imagerie du modèle des traceurs à l’intérieur du SNC et dans l’ensemble des organes et tissus du corps à différents points de temps après l’injection13. Pendant longtemps, l’écoulement du CSF a été considéré comme exclusivement et directement pris en charge par la circulation sanguine, par le biais de villoïdes arachnoïdes se projetant dans les sinus veineux dural13. Cependant, l’écoulement de CSF est principalement exécuté par la vascularisation lymphatique, comme récemment montré par l’imagerie dynamique proche-infrarouge (NIR) du transport de traceur CSF-injecté chez les souris9,10. Les vaisseaux lymphatiques drainants par CSF retournent alors la lymphe dans la circulation sanguine par l’intermédiaire de la veine subclavian droite. Des approches complémentaires ont détecté à la fois des sorties extracrâniennes6,,7,,13 et intracrâniennes9,10,11,12 sorties lymphatiques des traceurs injectés CSF et suggèrent que le CSF soit absorbé par deux voies lymphatiques, l’une externe et l’autre interne au crâne et à la colonne vertébrale. La partie principale du drainage CSF se produit rapidement par les vaisseaux lymphatiques situés rostrally, à l’extérieur du crâne dans la muqueuse nasale, par les canaux de la plaque critriforme de l’os éthmoid3,6,13 et, caudally, en dehors des os vertébraux lumbosacral par des voies dorsolaterales qui ne sont pas encore entièrementcaractérisés 7,14. En outre, dans les méninges du crâne, les capillaires lymphatiques de la dura mater absorbent directement CSF et les cellules immunitaires meningales vers les collecteurs lymphatiques dural qui traversent les os du crâne et se connectent aux LNs12,,14. Ces vaisseaux lymphatiques méningés jouent un rôle important dans la pathophysiologie du SNC, parce que les lymphatiques méningés du cerveau sont altérés lors du vieillissement et ont également un impact sur les résultats des maladies neurologiques du cerveau, y compris la neurodégénérescence, la neuroinflammation, et le cancer du cerveau15,16,17. Par conséquent, la vascularisation lymphatique associée au SNC (c.-à-d. les vaisseaux lymphatiques durals et périphériques drainant le CSF) peut être une nouvelle cible prometteuse pour combattre les maladies du SNC chez l’homme.

Des études convergentes réalisées avec l’immunohistologie et l’imagerie par résonance magnétique à haute résolution ont démontré que la vascularisation lymphatique méningée existe également chez les primates, y compris les singes marmoset communs et les humains7,11,13. En outre, les vaisseaux lymphatiques méningés ne sont pas limités au crâne, mais s’étendent dans la colonne vertébrale à la surface des ganglions spinaux et rami13,18. L’imagerie tridimensionnelle (3D) des lymphatiques de colonne vertébrale préservant l’anatomie globale des échantillons vertébraux et spinaux étiquetés, y compris les os, les muscles, les ligaments, ainsi que les tissus viscéraux voisins, a été récemment effectuée14. L’iDISCO+ protocole19,20 a été utilisé pour immunolabel décalcifié et autorisé les préparations de toute la colonne vertébrale avec des anticorps lymphatiques spécifiques contre le récepteur de la membrane LYVE121 ou le facteur de transcription PROX122. L’acquisition et l’analyse d’images ont ensuite été réalisées avec la microscopie de fluorescence des feuilles de lumière (LSFM) et le logiciel Imaris. LSFM permet une imagerie 3D rapide et peu invasive de grands spécimens par confinement axial de l’éclairage, ce qui entraîne une réduction du photobleachage et de la phototoxicité23.

L’approche iDISCO+/LSFM permet la caractérisation des couches distinctes des vaisseaux lymphatiques durals et épidurales, et la connexion de cette vasculature aux circuits lymphatiques extravertébraux et aux LN voisins de la colonne vertébrale. Le protocole a été appliqué aux tissus précédemment injectés avec des traceurs fluorescents pour démontrer le drainage vertébral de canal. Le présent document fournit des détails sur la méthodologie iDISCO+/LSFM pour l’image de la vascularature lymphatique vertébrale et illustre sa pertinence pour csf et l’étude de drainage de fluide épidural.

Protocole

Toutes les procédures in vivo utilisées dans la présente étude étaient conformes à toutes les réglementations éthiques pertinentes en matière d’expérimentation et de recherche sur les animaux, conformément aux directives de la Communauté européenne en matière d’utilisation expérimentale des animaux (L358-86/609EEC). L’étude a reçu l’approbation éthique du Comité d’éthique de l’INSERM (n°20161111126651) et du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).

1. Préparation

  1. Préparez les outils de dissection suivants pour la chirurgie : scalpel (1), microforceps (2), forceps (1), ciseaux de dissection, et clips de suture Michel. Préparer 26 aiguilles G (0,45 mm x 13 mm), 1 seringue mL et 10 microsyringe de μL.
  2. Tirez les microcapillaires avec un protocole en une seule étape à 67,5 °C avec un puller en micropipette en verre. Préparer deux microcapillaires par injection.
  3. Préparer des réactifs pour le drainage lymphatique d’imagerie (Tableau 1) : Conjugué à l’Ovalbumine Alexa Fluor 555 (OVA-A555, 2 mg/mL en solution saline tamponnée 1x phosphate [PBS]) et anticorps anti-LYVE1 (1 mg/mL en 1x PBS).
  4. Préparer des anticorps (Tableau 1) pour iDISCO+. Pour les anticorps primaires, utilisez des anticorps polyclonals de lapin anti-LYVE1 (1:1 600) et des anticorps igg polyclonal de chèvre anti-PROX1 (1:2 000). Pour les anticorps secondaires, utilisez Alexa Fluor âne anti-lapin-568, âne anti-lapin-647, et âne anti-chèvre-647 (1:2,000).

2. Procédures chirurgicales pour les injections intra-cisterna magna (ICM) et thoracoumbar (ThLb)

  1. Préparation de l’animal pour la chirurgie
    1. Utilisez des souris C57BL6/J mâles et femelles adultes, âgées de 8 à 12 semaines.
    2. Injectez la souris intrapéritoneally (IP) avec 0,015 mg/mL buprénorphine solution diluée dans 0,9% chlorure de sodium à 0,1 mg/kg, 15 min avant la chirurgie.
    3. Anesthésier la souris dans une boîte d’induction avec 2–3% de gaz isoflurane.
  2. Préparation d’un animal anesthésié pour l’injection de traceur
    1. Placez la souris anesthésiée et son coussin chauffant sur l’appareil stéréotaxique. Utilisez des barres d’oreille pour tenir la tête de la souris, et déposer le corps à un angle d’environ 135° par rapport à la tête ou immobiliser la moelle épinière au niveau vertébral ThLb (Th12-L1) avec un adaptateur spinal. Pincez la queue ou la patte avec le forcep pour vérifier l’efficacité de l’anesthésie.
    2. Injecter ip 200 μL de chlorure de sodium de 0,9% pour l’hydratation de souris.
    3. À l’aide d’une lame de scalpel, faire une incision de la peau, soit dans la région occipitale vers la région cervicale pour l’injection iCM, ou au niveau vertébral ThLb (Th10-L3) pour l’injection dans le parenchyme spinal ThLb.
  3. Injection de traceur
    1. Jeter les muscles paracervicaux et paraspinal couvrant le cou et la colonne pour visualiser la surface dura mater, la couche la plus externe des méninges.
    2. Ponctifier soigneusement la zone centrale de la dura mater et sous-déposer arachnoïde avec une aiguille de 26 G.
    3. Implantation microcapillaire
      1. Couper 2 mm de la pointe capillaire en verre (voir étape 1.2), puis utiliser le microcapillaire relié à une canule reliée à une seringue de 10 μL pour aspirate 2−8 μL de l’anticorps OVA-A555 ou LYVE1.
      2. Introduire le microcapillaire dans la région médiale du dura mater à un angle de 30° pour les injections iCM ou 10° d’angle pour les injections spinales ThLb, et le pousser à 1,5 mm sous le dura mater.
        REMARQUE : Le ligament est perforé, mais aucune laminectomie n’est exécutée.
      3. Ajouter 10 μL de colle chirurgicale pour fermer l’incision autour du capillaire en verre et attendre qu’elle sèche.
    4. Injectez lentement le traceur fluorescent à 1 μL/min. Une fois le volume d’injection livré, maintenir le capillaire en place pendant 1 min. Rétractez le microcapillaire et ajoutez de la colle chirurgicale pour fermer le trou d’injection.
  4. Postinjection, fermez les incisions cutanées avec des pinces de suture. Retirez la souris de l’appareil stéréotaxique et placez-la dans une chambre chauffante à 37 °C jusqu’à ce qu’elle se rétablisse.

3. Perfusion et dissection tissulaire

  1. À 15 min ou 45 min après l’injection de traceur CSF, injectez à IP une dose létale (100 μL) de pentobarbital de sodium. Pincez la queue ou la patte pour vérifier qu’il n’y a pas de réflexe.
  2. Avec des ciseaux de dissection, couper la peau et ouvrir la couche péritonéale de la région du bas-ventre vers la cage thoracique. Ouvrez la cage thoracique avec des ciseaux pour avoir accès au cœur.
  3. Insérez l’aiguille de 26 G dans la ventricule gauche du cœur et commencez à perfuse avec 20 mL de paraformaldéhyde glacé (PFA) dans 1x PBS à 2 mL/min. Utilisez des ciseaux pour couper rapidement l’atrium droit et libérer le flux de liquide de perfusion.
  4. Retirez complètement la peau avec des forceps et coupez les quatre pattes avec des ciseaux. Retirez tous les organes internes, mais veillez à préserver les LN intacts.
    REMARQUE : Les LN mandibulaires sont superficielles, alors prenez soin de ne pas les enlever lors de la coupe de la peau. Les LNs (dcLN) profonds-cervicals sont situés de chaque côté de la trachée, en contact avec la surface latérale des veines jugulaires internes et près des muscles stéréomastoïdes.
  5. Couper les côtes pour enlever la colonne vertébrale avec la moelle épinière à l’intérieur du col de l’utérus aux segments lombaires.
  6. Plongez les tissus disséqués dans la PFA glacée de 4 % dans 1x PBS dans un tube de 50 ml pendant la nuit (~18 h) à 4 °C. Laver les tissus fixes 3x en 50 mL de 1x PBS pendant 5 min.

4. Macroscopie de fluorescence d’un segment vertébral

  1. Placer l’échantillon sous le microscope stéréozoom de fluorescence à l’aided’unecaméra ( Table des matériaux ). Prenez une vue d’ensemble de l’exemple ou zoomez sur une région spécifique.

5. Préparation d’échantillon pour l’immunostaining de montage entier

  1. À l’aide d’une lame de microtome, couper transversalement la colonne tête et vertébrale aux niveaux occipital et cervical.
    REMARQUE : Cette dissection permet l’isolement de la tête et de la région vertébrale cervicale du reste de la colonne vertébrale.
  2. À l’aide d’une lame de microtome, couper les régions cervicales, thoracoumbar et sacrées de la colonne vertébrale transversalement en segments de 2−4 vertèbres, soit environ 0,5 cm de taille chacun.
  3. Isoler chaque segment dans l’ordre où il a été séparé de l’axe vertébral, le long de toute la longueur des régions cervicales et thoraciques de la colonne vertébrale. Conserver chaque échantillon dans un tube de 2 ml 1x PBS.

6. iDISCO+ immunostaining de montage entier d’un segment vertébral

REMARQUE : La description détaillée du protocole iDISCO+ est accessible à http://www.idisco.info.

  1. Jour 1 : Déshydratation des tissus
    1. Déshydrater des échantillons de tissus vertébraux (c.-à-d. un segment vertébral) par immersion successive dans 20%, 40%, 60%, 80%, et 100% méthanol dans 1x PBS pendant 1 h avec agitation.
    2. Incuber les échantillons pendant la nuit dans une solution de 33% de méthanol/66% de dichlorométhane (DCM) à température ambiante (RT) avec agitation.
  2. Jour 2 : Blanchiment des tissus
    1. Laver les échantillons 2x avec 100% de méthanol pendant 1 h à RT. Incuber les échantillons en 5% H2O2 en méthanol (30% H2O2 et méthanol 1:5 v/v) à 4 °C pendant la nuit.
  3. Jour 3 : Étape de décalcification et de perméabilisation
    1. Réhydrater progressivement les échantillons en 80%, 60%, 40%, 20% méthanol, puis en 1x PBS (1 h dans chaque solution) à RT avec agitation.
    2. Décalcifier les vertèbres en incuber des échantillons dans la solution de Morse (10 % de citrate de trisodique et 45 % d’acide formique 1:1 v/v) pendant 30 min à RT afin de préserver la structure osseuse.
    3. Rincer les échantillons 2x avec 1x PBS et incuber 2x pour 1 h dans la solution PTx2 (0,2% Triton X-100 en 1x PBS, renouveler pour la deuxième incubation) à RT avec agitation. Incuber ensuite les échantillons prétraités dans la solution de perméabilisation (PTx2 avec 20% de sulfoxyde de diméthyle [DMSO] et 2,3% w/v glycine) à 37 °C pendant 24 h.
  4. Jour 4: Étape de blocage
    1. Incuber des échantillons dans la solution de blocage (PTx2 avec 6% de sérum d’âne et 10% DMSO) à 37 °C pendant 24 h.
  5. Jours 5−16 : Immunolabeling de montage entier
    1. Incuber des échantillons d’anticorps primaires dilués dans le PTwH (1x PBS contenant 0,2 % d’héroïsme tween-20 et 0,1 % d’héparine à 10 mg/mL dans 1x PBS) avec 5 % de sérum d’âne de 5 % à 37 °C pendant 6 jours. Laver les échantillons 4−5x en PTwH à RT avec agitation pendant la nuit.
    2. Incuber des échantillons dans des dilutions d’anticorps secondaires dans le PTwH avec 3% de sérum d’âne à 37 °C pendant 4 jours. Laver les échantillons dans PTwH 4−5x à RT sous agitation pendant la nuit avant de le nettoyer.
  6. Jours 17 et 18: iDISCO+ compensation des tissus
    1. Déshydrater progressivement les échantillons par immersion successive dans 1x PBS, puis 20%, 40%, 60%, 80%, et 2x en méthanol 100% (1 h dans chaque solution). Incuber chaque échantillon du jour au lendemain dans une solution de 33% de méthanol/66% DCM.
    2. Laver 2x en 100% DCM pendant 15 min pour enlever le méthanol. Incuber dans l’éther dibenzyl (DBE) sans trembler jusqu’à ce qu’il soit effacé (4 h) et puis conserver en DBE à RT avant l’imagerie.

7. Imagerie LSFM

  1. Image effacée échantillons dans un plan transversal avec le LSFM équipé d’un objectif 4x/0.3.
    1. Utilisez une configuration d’éclairage à trois feuilles à face unique, position x fixe (pas de mise au point dynamique). Utilisez des lasers LED réglés à 561 nm, 100 mW; et 639 nm, 70 mW. Réglez l’ouverture numérique de la feuille de lumière à 30%.
    2. Utilisez différents filtres d’émission : 595/40 pour Alexa Fluor-568 ou -555, et -680/30 pour Alexa Fluor-647.
  2. Remplissez la chambre de microscope avec DBE.
  3. Aquire empile avec des étapes de 2,5 μm z et un temps d’exposition de 30 ms par étape avec la caméra (Table des matériaux). Utilisez le zoom optique x2 pour un grossissement efficace de (x8), 0,8 μm/pixel, et effectuez les acquisitions de mosaïque avec un chevauchement de 10% sur le cadre complet.
  4. Acquérir des images au format .tif avec un logiciel d’acquisition et les convertir en format 3D avec un logiciel de conversion de fichiers.
  5. Reconstruire l’acquisition de mosaïques avec un logiciel de couture (Table of Materials). Ouvrez les images et déplacez-vous manuellement pour reconstituer l’image de mosaïque entière, en utilisant le chevauchement de 10% entre les images comme ligne directrice.
  6. Utilisez le logiciel 3D (Tableau des matériaux)pour générer des projections orthogonales de données, comme indiqué à la figure 1, figure 2, figure 3et figure 4, et ajoutez un attribut de code de couleur aux vaisseaux lymphatiques et aux autres structures anatomiques exposées. Définissez une correction gamma de 1,47 sur les données brutes obtenues auprès du LSFM selon les instructions du fabricant.

Résultats

Imagerie 3D de la vascularisation lymphatique vertébrale
La figure 1 présente les étapes de la procédure iDISCO+/LSFM et une image LSFM des circuits lymphatiques à l’intérieur du canal vertébral d’iDISCO+vertèbres ThLb traitées. La combinaison d’iDISCO+ avec LSFM a préservé l’anatomie vertébrale et a capturé une vue du réseau vasculaire lymphatique (c.-à-d. les vaisseaux intravertébraux reliés aux vaisseaux extravertébraux sortant dorsalement et latéralement du corps vertébral) dans les os environnants, les ligaments, les muscles, et les ganglions nerveux.

Imagerie de macroscopie de fluorescence du drainage dcLN
Afin d’imager le drainage macromolécule dans le système lymphatique cns-associé, les traceurs macromoléculaires ont été administrés in vivo par injection dans le CSF ou le parenchyme spinal. Un traceur macromoléculaire peut être facilement livré dans le CSF à la cisterna magna. Le cisterna magna est situé entre le cervelet et la surface dorsale de la médulla oblongata, au-dessus du magnum foramen. Le traceur macromoléculaire peut également être injecté dans le parenchyme spinal par chirurgie stéréotaxique à différents niveaux le long de la colonne vertébrale.

Les traceurs macromoléculaires utilisés ont été soit directement étiquetés avec un fluorophore, soit détectés post mortem par immunohistorichemisme avec des anticorps spécifiques. La figure 2A illustre le plan expérimental de suivi de l’OVA-A555, un traceur fluorescent rouge et de petit poids moléculaire (environ 45 kDa), qui a été injecté dans le CSF (Figure 2B) ou dans la région ThLb de la moelle épinière (Figure 2C).

À 45 min après l’injection de traceur macromoléculaire, les souris ont été sacrifiées, perfusées avec 4% PFA, et traitées pour isoler les segments disséqués de la région du tronc cérébral de la tête et de la colonne vertébrale qui ont été décalcifiés et clarifiés. Le drainage de macromolécule a alors été facilement évalué par l’imagerie de macroscopie de fluorescence des LN qui recueillent le CSF et les fluides épidurals. Comme le montre la figure 2 , l’injectiond’OVA-A555 dans la région du CSF (figure 2B)ou de la région de ThLb (Figure 2C)de la moelle épinière a entraîné l’accumulation d’OVA-A555 dans les dcLN à 45 min après injection. Cette observation indique l’absorption et le drainage du traceur fluorescent par le système lymphatique; c’est une condition préalable avant de poursuivre la procédure iDISCO+/LSFM pour l’image du drainage lymphatique vertébral.

Imagerie 3D du drainage macromolécule dans le système lymphatique vertébral
Sur la base de la détection de l’étiquetage OVA-A555 dans les dcLNs, la procédure iDISCO+/LSFM pourrait être appliquée aux échantillons vertébraux décalcifiés et prédécoupés isolés de souris OVA-A555-injectées. Cette approche a permis la création d’une carte 3D du drainage lymphatique du CSF et du liquide épidural spinal à un moment précis après injection de traceur. Cette cartographie 3D pourrait être réalisée par imagerie des segments successifs du SNC, à chaque niveau de colonne vertébrale, à partir du point d’injection.

La figure 3A montre la conception expérimentale de l’injection d’OVA-A555 dans le parenchyme spinal ThLb et le modèle 3D résultant de la distribution OVA-A555 dans un segment cervical et un segment vertébral thoracique, en conjonction avec la vascularature lymphatique. À 45 min après l’injection d’OVA-A555, l’accumulation d’OVA-A555 a été détectée dans les tissus de la moelle épinière et les dcLN (flèches blanches de la figure 3B),en accord avec les observations au microscope illustrées à la figure 2. Il n’a pas été détecté, cependant, dans la vascularisation lymphatique cervicale et thoracique étiquetée avec des anticorps anti-LYVE1. L’absence de traceur injecté par CSF dans les vaisseaux lymphatiques vertébraux peut être due soit à un court temps de persistance du traceur à l’intérieur des vaisseaux lymphatiques, soit à un manque d’absorption du traceur par les vaisseaux lymphatiques (figure 3C).

Pour tester la première hypothèse, l’anticorps anti-LYVE1 de lapin a été employé comme étiquette de cellule endothéliale lymphatique pour lier les vaisseaux lymphatiques CNS-associés. L’anticorps anti-LYVE1 injecté de lapin a été par la suite détecté par immunohistorique avec un anticorps secondaire anti-lapin, tandis que les cellules endothéliales lymphatiques ont été immunolabeled avec des anticorps anti-PROX1. La figure 4 représente la conception expérimentale de l’injection anti-LYVE1 dans le parenchyme spinal ThLb (figure 4A),et le modèle de distribution 3D résultant des anticorps LYVE1 dans un segment ThLb près du site d’injection, en ce qui concerne PROX1+ lymphatique (Figure 4B). Les lymphatiques vertébraux et leurs connexions lymphatiques extravertébrales ont été étiquetés par des anticorps anti-LYVE1 injectés, qui ont justifié l’absorption de traceur par les vaisseaux lymphatiques vertébraux et le drainage lymphatique vers le système lymphatique extravertébral. Les LN manquaient dans la région de ThLb et, par conséquent, ne pouvaient pas être visualisées dans le segment d’image. En outre, le modèle discontinu du marqueur LYVE1 observé le long des vaisseaux lymphatiques a probablement reflété l’expression discontinue de LYVE1 dans la vascularature lymphatique, comme indiqué dans les études précédentes14,21. Au total, les résultats de la présente étude ont démontré que, à 45 min après injection de traceur, l’anticorps LYVE1, mais pas OVA-A555, a permis la détection de l’absorption lymphatique vertébrale locale et était préférable à OVA-A555 comme marqueur persistant du drainage lymphatique vertébral local.

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Figure 1 : Vue tridimensionnelle de la vascularisation lymphatique vertébrale. (A) Représentation schématique du protocole. (B) Projection planaire d’une vue 3D de la vascularisation lymphatique vertébrale de ThLb d’une perspective dorsofrontale. Les vaisseaux lymphatiques ont été immunolégnés avec l’anticorps anti-PROX1 (vert) utilisant le protocole iDISCO+ et ensuite photographiés par LSFM. Notez le modèle métamérique de la vasculature dans le canal vertébral de trois vertèbres successives (pointes de flèche blanches). En plus des vaisseaux dorsaux semi-circulaires (pointes de flèche blanches), chaque réseau vertébral comprenait des branches ventrales (flèches jaunes), des voies de sortie latérales bilatérales le long de la rami spinale et des ganglions (flèches blanches), ainsi qu’une voie de sortie dorsale à la ligne médiane (double flèche blanche). Les réseaux vertébraux étaient reliés à un navire longitudinal (flèches violettes). Pour une description complète, voir Jacob L. et coll.18 SC = moelle épinière; Astérisque = corps vertébral ventral; D = dorsal; L = latéral; V = ventral; Barres d’échelle = 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2 : dcLNs a recueilli des fluides CSF étiquetés OVA-A555. (A) Schéma de la conception expérimentale. OVA-A555 a été injecté dans l’ICM ou le parenchyme spinal ThLb, puis les souris ont été sacrifiées 45 min après injection. Les échantillons ont été effacés et observés par imagerie macroscope de fluorescence (B,C). Images macroscopes de fluorescence des vertèbres cervivales de souris injectées par ICM- (B) et ThLb- (C). Notez que OVA-A555 s’est accumulé dans les dcLNs (B,C, pointes de flèche blanches), les espaces pial et paravasculaires de la moelle épinière cervicale (B,C) et après l’injection d’ICM, dans les voies de sortie ventrolatérales, probablement le long des nerfs cervicals (B, flèches blanches). SC = moelle épinière. Astérisque = corps vertébral ventral; D = dorsal; L = latéral; V = ventral; Barres d’échelle en B et C = 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3 : Détection des fluides CSF étiquetés OVA-A555dans le système lymphatique vertébral. (A) Schéma de la conception expérimentale. OVA-A555 a été injecté dans le parenchyme spinal ThLb, puis les souris ont été sacrifiées à 45 min après injection. Les échantillons ont été traités avec le protocole iDISCO+ et photographiés avec un LSFM. (B,C) Projections planaires des vues 3D frontales capturées par LSFM des segments de la colonne vertébrale cervicale (B) et thoraciques (C). L’accumulationd’OVA-A 555 (rouge) a été détectée dans les tissus de la moelle épinière et les dcLN (B, flèche blanche), comme illustré dans la figure 2, mais pas dans la vascularisation lymphatique cervicale et thoracique immunolabeled ici avec des anticorps anti-LYVE1 (vert). SC = moelle épinière; Astérisque = corps vertébral ventral; D = dorsal; L = latéral; V = ventral; Barres d’échelle = 1 mm (B), 300 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4 : Détection du drainage lymphatique vertébral après injection intraspinale d’anticorps anti-LYVE1. (A) Schéma de la conception expérimentale. Des anticorps anti-LYVE1 ont été injectés dans le parenchyme spinal ThLb, puis les souris ont été sacrifiées 45 min après injection. Les échantillons ont été traités avec le protocole iDISCO+ et photographiés avec un LSFM. (B). Projections planaires des vues 3D frontales d’un segment de colonne vertébrale ThLb (B), capturés avec un LSFM. Des anticorps anti-LYVE1 ont été détectés avec des anticorps anti-lapin (violet) et la vascularisation lymphatique avec des anticorps anti-PROX1 (verts). Les vaisseaux blancs sont PROX1+ lymphatiques colabeled avec des anticorps anti-LYVE1 (B); il s’agit notamment des lymphatiques vertébraux (flèches jaunes) et extravertébraux (doubles flèches jaunes). SC = moelle épinière; Astérisque = corps vertébral ventral; D = dorsal; L = latéral; V = ventral; Barres d’échelle = 300 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

RéactifsCibleFigureÉtape du protocoleCommentaire
OVA-A555 Traceur CSFFigure 2 et figure 32. Injection iCM ou ThLb
7. Imagerie LSFM.		Soluble dans l’eau, facile à injecter et haute fluorescence intense
Anticorps anti-Lyve1Marqueur membranaire des cellules de LVFigure 36. iDISCO+ monture entière immnunostaining.
7. Imagerie LSFM.		Anticorps efficace à l’immnunostaining de montage entier
Drainage traceur des VBL dural et périduralesFigure 42. Injection iCM ou ThLb
6. iDISCO+ monture entière immnunostaining
7. Imagerie LSFM
Anticorps anti-Prox1Marqueur nucléaire des cellules LVFigure 1 et figure 46. iDISCO+ monture entière immnunostaining
7. Imagerie LSFM		Anticorps efficace à l’immnunostaining de montage entier

Tableau 1 : Anticorps et traceurs utilisés dans l’étude.

ProblèmeRaison possibleSolution
Chirurgie pour injection de traceurLésion tissulaire non désirée du SNC1. Manque de contrôle de l’insertion capillaire en verre
2. Profondeur incorrecte de l’insertion capillaire en verre		1. Punctate avec soin, mais entièrement, le dura mater avec une aiguille de 26 G avant l’insertion capillaire en verre.
2. Réduire la profondeur de l’insertion capillaire en verre (<1,5 mm du dura mater).
3. Réduire le diamètre capillaire en verre.
Profanation non désirée du traceur injecté dans les espaces épiduraux ou extra-vertébrauxInjection incorrecte de traceur1. Vérifiez si le micro capillaire en verre a été bien inséré dans le punctate le dura mater.
2. Ajouter de la colle chirurgicale entre le microcapillaire en verre et le tissu entouré avant d’injecter un traceur.
Volume excessif de traceur injectéRéduire le volume de traceur injecté (<2 μL).
immunostaining iDISCO+Absence, hétérogénéité ou arrière-plan excessif de l’étiquetage dans le tissu1. Problèmes avec la concentration de l’anticorps primaire
2. Perméabilisation insuffisante
3. Lavage insuffisant
4. Compensation insuffisante		Augmenter le nombre et/ou le temps des étapes d’incubation : permébilisation, whashing, anticorps primaires et compensation. Voir http://www.idisco.info (FAQ ET DÉPANNAGE).
Décalcification insuffisanteUtilisez un traitement de décalcification plus rigoureux de l’échantillon avec la solution EDTA21 ou Morse pour les tissus de la tête en particulier.
compensation iDISCO+Les échantillons sont opaques ou brunsBlanchiment insuffisantUtilisez une solution H2O2 fraîche, augmentez le volume et/ou le temps d’incubation.
Présence d’oxydationRemplissez complètement le tube pour éviter la présence d’air.
Compensation insuffisanteAugmenter le volume et/ou le temps d’incubation. Voir http://www.idisco.info (FAQ ET DÉPANNAGE).
Détection de traceurTraceur indétectableCombinaison incorrecte du traceur sélectionnéAlexa 555, 594 et 647 fluorochromes sont résistants au protocole iDISCO+5,6,7,8,9,10. Cependant, ce n’est pas le cas pour les fluorochromes FITC, GFP, DFP.
Temps de sacrifice après injectionPréférez OVA-A555 pour l’analyse de drainage à court terme (15 min) dans les lymphatiques vertébraux locaux. Pour l’analyse du drainage des ganglions lymphatiques, les anticorps OVA-A555 et Lyve1 peuvent être utilisés à plus long terme (>45 min).
Imagerie : capture et analyseLes images capturées du circuit lymphatique ne sont pas satisfaisantesProblème de dissection (les ganglions lymphatiques sont manquants)Inclure soigneusement les tissus voisins vertébraux/crâne dans votre échantillon disséqué, selon le circuit lymphatique que vous voulez imager.
Problème d’imagerie1. Modifier les paramètres d’acquisition du LSFM : intensité laser, ouverture numérique de la feuille de lumière, épaisseur de la feuille de lumière, temps d’exposition.
2. Placez l’échantillon dans le support pour réduire le chemin parcouru par la lumière à travers le tissu jusqu’à l’objectif.
3. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles à l’intérieur de l’échantillon de tissu pendant l’acquisition.

Tableau 2 : Résolution des conseils pour chaque étape du protocole, y compris les problèmes et les solutions possibles.

Discussion

Le protocole iDISCO+/LSFM fournit des vues 3D sans précédent du réseau lymphatique associé au SNC dans ses tissus environnants à un niveau de résolution cellulaire. Ce protocole est bien adapté aux échantillons de taille moyenne, et non à 1,5 cm3, en raison des limites du système optique LSFM, de la distance de travail réduite et de la grande taille des lentilles objectives commerciales pour la microscopie haute résolution23. Cette limitation empêche la capture de l’ensemble du système lymphatique associé au cerveau. Il est important de noter que le domaine d’investigation doit être délimité avec prudence et que les tissus entourant le SNC doivent être soigneusement disséqués afin d’inclure les vaisseaux lymphatiques extracrâniens et les LN qui contribuent à l’ensemble des circuits lymphatiques (tableau 2).

En plus de la taille et des considérations anatomiques, la complexité des tissus mésenchymal environnants varie le long du crâne et de la colonne vertébrale, ce qui nécessite l’adaptation de la décalcification et du traitement précombrant afin d’obtenir une clarification homogène de l’échantillon et de permettre la propagation du faisceau lumineux dans un tissu biologique isotrope mou. En l’absence d’os, l’imagerie LFSM du cerveau ou des tissus de la moelle épinière ne nécessite pas l’étape de décalcification, et la résolution finale des images capturées est optimale19. Le protocole décrit ci-dessus, qui comprend une étape de décalcification légère avec la solution de Morse, est bien adapté pour l’imagerie LSFM de la colonne vertébrale comme illustré dans la figure 1 et la figure 4. En revanche, la région du cou affiche une anatomie osseuse particulièrement complexe en plus de plusieurs couches de muscles, de graisses et de tissus glandulaires, qui réduisent la qualité des images capturées de LSFM, telles que reflétées dans la figure 3B. L’imagerie LSFM du cou et de la région cervicale peut donc être améliorée par un traitement plus rigoureux des tissus; par exemple, avec EDTA, comme indiqué précédemment24. L’étape de décalcification est donc critique et les conditions de décalcification doivent être testées précédemment pour chaque anticorps utilisé avant de commencer le protocole iDISCO+ complet (tableau 2).

Alors que le protocole iDISCO+/LSFM permet la génération d’une vue 3D de la connexion des circuits entre les espaces méningés et épidurales et les LN associés, l’analyse quantitative directe de la vascularisation lymphatique à partir d’images capturées par le LSFM n’est pas possible pour les raisons suivantes : 1) la délimitation des circuits lymphatiques des vaisseaux n’est pas fiable en raison du modèle discontinu de l’expression des marqueurs lymphatiques, parce que le LYVE1 membranenaire est distribué de façon hérétique21 et PROX1 a un modèle d’expression nucléaire22; 2) la pénétration hétérogène des anticorps, ainsi que l’anisotropie qui peut persister dans le tissu biologique en raison de la décalcification incomplète et hétérogène et le précontrôle. L’imagerie LSFM doit donc être étendue par des outils de réalité virtuelle qui permettent une visualisation interactive et facilitent ainsi la quantification de la vascularisation lymphatique (www.syglass.io). Il convient également de noter que la description précise des circuits associés au SNC nécessite la sauvegarde de l’information LSFM avec des données confocales à haute résolution obtenues par immunoétiquement conventionnel sur des sections de cryostat ou de tissus incorporés à la paraffine, en particulier pour localiser précisément la position des vaisseaux lymphatiques en ce qui concerne le dura mater et le CSF, comme indiqué précédemment11,14,18.

Le protocole iDISCO+/LSFM permet la visualisation tridimensionnelle du drainage macromoléculaire dans le système lymphatique associé au SNC, comme l’illustre la figure 3 et la figure 4. Toutefois, l’évaluation fonctionnelle du drainage lymphatique exige, en plus des recommandations sur le protocole iDISCO+/LSFM détaillée ci-dessus, suivant une procédure rigoureuse, car le résultat final dépend de la qualité de la chirurgie d’injection, du choix du site d’accouchement, du type et du volume injecté de marqueur macromolécule utilisé, et du temps de sacrifice après l’administration du traceur (Tableau 2). En raison des variations du modèle de traceur entre les animaux injectés, la caractérisation des circuits de drainage lymphatique nécessite de grands groupes expérimentaux (>10 par condition d’injection). Dans le protocole présenté, 1) le dura mater doit être perforé avant l’injection pour empêcher les lésions indésirables et la pénétration dans les tissus du SNC; 2) le volume injecté doit être inférieur à 2 μL pour limiter la diffusion non désirée par le trou d’injection, le long du capillaire d’injection, dans l’espace épidural ou les tissus extravertébraux; 3) la profondeur de l’insertion capillaire par injection doit être limitée à 2 mm en dessous de la dura mater pour éviter les blessures du SNC ou le brouillard dans les injections icm et intraspinal, respectivement. Notez également qu’une analyse confocale complémentaire à haute résolution des segments vertébraux voisins doit être effectuée, comme indiqué ci-dessus, pour évaluer la présence de traceur injecté à l’intérieur des vaisseaux lymphatiques. Cette analyse nécessite d’établir les parcelles de profil d’intensité du traceur et du marqueur lymphatique sur des sections transversales des vaisseaux lymphatiques marqués par marqueur. Cette approche a déjà été utilisée pour démontrer l’absorption d’OVA555 par les lymphatiques ThLb à 15 min après injection (Figure supplémentaire 5F dans Jacob et al.14). Toutefois, il n’a pas été illustré pour le traceur anti-LYVE1 dans la présente étude (Figure 4).

Parmi les traceurs CSF possibles, OVA-A555 est une excellente option car il est résistant aux traitements de protocole iDISCO+ et maintient une fluorescence élevée pour l’imagerie LSFM. Toutefois, notez que le type de traceur doit être choisi conformément au point de tempsd’analyse ( tableau 1 et tableau 2). Comme indiqué ci-dessus, l’étiquetage OVA-A555 des vaisseaux lymphatiques vertébraux locaux est observé à 15 min après l’injection14. Cependant, OVA-A555 n’est plus détecté dans ces circuits lymphatiques locaux à 45 min après injection (figure 3) contrairement à l’anticorps anti-LYVE1 (figure 4).

Pour conclure, le protocole iDISCO+/LSFM est bien adapté pour étudier la structure 3D et le drainage du système lymphatique associé au SNC dans des conditions physiologiques et pathologiques telles que les cancers du SNC et de la colonne vertébrale, ou les maladies vertébrales des os et des articulations. Bien que la procédure complète soit longue et exige une rigueur méthodologique, elle fournit des informations précieuses et uniques lorsqu’elle est utilisée avec une analyse complémentaire à l’aide d’outils de réalité virtuelle et d’imagerie confocale haute résolution.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Institut national de la Sante et de la Recherche Médicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (à L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ pour J.B.), NIH (R01EB016629-01) et Yale School of Medicine. Nous reconnaissons les plates-formes ICM : ICM-QUANT pour l’imagerie cellulaire et ICM-histomics pour l’immunohistochimie. Tous les travaux sur les animaux ont été effectués à l’installation PHENO-ICMice. Le Noyau est soutenu par 2 « Investissements d’avenir » (ANR-10- IAIHU-06 et ANR-11-INBS-0011-NeuraTRIS) et la « Fondation pour la Recherche Médicale ». Nous reconnaissons Nicolas Renier pour ses conseils méthodologiques et sa lecture manuscrite.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Centrifuge tubes: 0.2mlEppendorf30124359
Centrifuge tubes: 2mlEppendorf30120094
Conical centrifuge tubes: 15mlFalcon352096
Conical centrifuge tubes: 50mlFalcon352070
Microtome blade 80mmMicrom Microtech FranceF/MM35P
Needles 26G (0.45x13 mm)TerumoAN*2613R1
Syringe 1mlTerumoSS+01H1
Microscopes and imaging softwares
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS cameraZeiss
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software)Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software)OXFORD instruments
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayionCOHERENT
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6)LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti RabbitThermo FisherA10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goatJackson ImmunoResearch705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti RabbitJackson ImmunoResearch711-605-152
Anti-LYVE1 polyclonal antibodyAngiobio#11-034
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibodyR&D systems#AF2727
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml)AnimalcareAmpule 1ml
Dibenzyl Ether 100% (DBE)Sigma Aldrich108014
Dichloromethane 100% (DCM)Sigma Aldrich270997
Formic acid 99%CARLO ERBA405793
GlycineSigma AldrichG.7126
Heparine sodium salt from porcineSigma AldrichH4784
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%)Sigma AldrichH1009
Isoflurane (Iso-Vet 100%)PiramalNDC 66794-013-10
Methanol 100%Sigma Aldrich322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 ConjugateInvitrogen11549176
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X)EuromedexET330-A
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL)Dechra08718469445110
Tri-sodium citrateVWR6132-04-3
Surgical tools and equipments
Anaesthesia systemUniventorUniventor 410 Anaesthesia Unit
Glass micropipette pullerNarishigePC-10
Heating padCMA Microdialysis ABCMA 450 Temperature controller
Microcapillaries (Glass Capillaries)Harvard ApparatusGC120-15
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm)Fine Science Tool12040-01
Scalpel (sterile disposable scalpel 23)Swann-Norton0510
Stereotaxic apparatusKOPFModel 940
Syringe Hamilton 10µl 701NHamilton28618-U
Warm air SystemVet-Tech LTDHE011

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