In Vivo Ciblage des cellules cancéreuses humaines xénograftées avec des nanoparticules de silice fluorescente fonctionnelles chez le poisson zèbre

Résumé

Décrit ici est une méthode pour utiliser des embryons de poisson zèbre pour étudier la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à cibler les cellules cancéreuses humaines in vivo. Cette méthode permet l’évaluation et la sélection de nanoparticules optimales pour les futurs essais chez les grands animaux et dans les essais cliniques.

Résumé

Le développement de nanoparticules capables de détecter, de cibler et de détruire les cellules cancéreuses est d’un grand intérêt dans le domaine de la nanomédecine. Des modèles animaux in vivo sont nécessaires pour faire le pont entre la nanotechnologie et son application biomédicale. La souris représente le modèle animal traditionnel pour les essais précliniques; cependant, les souris sont relativement chères à garder et ont de longs cycles expérimentaux en raison de la descendance limitée de chaque mère. Le poisson zèbre est devenu un puissant système modèle de recherche développementale et biomédicale, y compris la recherche sur le cancer. En particulier, en raison de sa transparence optique et de son développement rapide, les embryons de poisson zèbre sont bien adaptés à la surveillance in vivo en temps réel du comportement des cellules cancéreuses et de leurs interactions avec leur microenvironnement. Cette méthode a été développée pour introduire séquentiellement les cellules cancéreuses humaines et les nanoparticules fonctionnalisées dans les embryons transparents de poisson zèbre Casper et surveiller la reconnaissance in vivo et le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules en temps réel. Ce protocole optimisé montre que les nanoparticules fluorescentes étiquetées, qui sont fonctionnalisées avec des groupes folates, peuvent reconnaître et cibler spécifiquement les cellules cancéreuses épithéliales humaines métastatiques étiquetées avec un fluorochrome différent. Le processus de reconnaissance et de ciblage peut se produire dès 30 min post-injection des nanoparticules testées. L’expérience ne nécessite que la reproduction de quelques couples de poissons adultes et prend moins de 4 jours pour terminer. En outre, les embryons de poisson zèbre n’ont pas un système immunitaire adaptatif fonctionnel, permettant l’engrafment d’un large éventail de cellules cancéreuses humaines. Par conséquent, l’utilité du protocole décrit ici permet de tester des nanoparticules sur différents types de cellules cancéreuses humaines, facilitant la sélection de nanoparticules optimales dans chaque contexte spécifique de cancer pour les tests futurs chez les mammifères et la clinique.

Introduction

Le développement de nanoparticules capables de détecter, de cibler et de détruire les cellules cancéreuses est d’un grand intérêt pour les physiciens et les chercheurs biomédicaux. L’émergence de la nanomédecine a conduit au développement de plusieurs nanoparticules, telles que celles conjuguées avec des ligands de ciblage et/ou des médicaments chimiothérapeutiques^1,2,3. Les propriétés ajoutées des nanoparticules permettent leur interaction avec le système biologique, la détection et la surveillance des événements biologiques avec une grande efficacité et précision ainsi que des applications thérapeutiques. Les nanoparticules d’or et d’oxyde de fer sont principalement utilisées dans la tomographie calculée et les applications d’imagerie par résonance magnétique, respectivement. Alors que les activités enzymatiques des nanoparticules d’or et d’oxyde de fer permettent la détection des cellules cancéreuses par des tests colorimétriques, les nanoparticules fluorescentes sont bien adaptées aux applications d’imagerie in vivo⁴. Parmi eux, les nanoparticules fluorescentes ultrabright sont particulièrement bénéfiques, en raison de leur capacité à détecter les cancers tôt avec moins de particules et des toxicités réduites⁵.

Malgré ces avantages, les nanoparticules nécessitent des expérimentations à l’aide de modèles animaux in vivo pour la sélection de nanomatériaux appropriés et l’optimisation du processus de synthèse. En outre, tout comme les médicaments, les nanoparticules s’appuient sur des modèles animaux pour les tests précliniques afin de déterminer leur efficacité et leur toxicité. Le modèle préclinique le plus utilisé est la souris, qui est un mammifère dont l’entretien a un coût relativement élevé. Pour les études sur le cancer, les souris génétiquement modifiées ou les souris xénograftées sont généralement utilisées^6,,7. La durée de ces expériences s’étend souvent de semaines à mois. En particulier, pour les études de métastases cancéreuses, les cellules cancéreuses sont directement injectées dans le système circulatoire des souris à des endroits tels que les veines de queue et les rates^8,9,10. Ces modèles ne représentent les phases finales de la métastase que lorsque les cellules tumorales extravasent et colonisent des organes éloignés. En outre, en raison de problèmes de visibilité, il est particulièrement difficile de surveiller la migration des cellules tumorales et le ciblage des nanoparticules des cellules tumorales chez les souris.

Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un puissant système vertébré pour la recherche sur le cancer en raison de sa fécondité élevée, faible coût, développement rapide, transparence optique, et les conservations génétiques^11,12. Un autre avantage du poisson zèbre sur le modèle de souris est la fertilisation des oeufs de poisson ex utero, qui permet aux embryons d’être surveillés tout au long de leur développement. Le développement embryonnaire est rapide chez le poisson zèbre, et dans les 24 heures postfertilisation (hpf), le plan du corps vertébré a déjà formé¹³. Par 72 hpf, les œufs sont éclos à partir du chorion, passant de l’embryon au stade des alevins. La transparence du poisson zèbre, la souche Casper en particulier¹⁴, offre une occasion unique de visualiser la migration des cellules cancéreuses et leur reconnaissance et leur ciblage par les nanoparticules chez un animal vivant. Enfin, le poisson zèbre développe son système immunitaire inné de 48 hpf, le système immunitaire adaptatif étant à la traîne et ne devenant fonctionnel qu’à 28 jours après la fertilisation¹⁵. Cet écart de temps est idéal pour la transplantation de divers types de cellules cancéreuses humaines dans des embryons de poisson zèbre sans éprouver de rejets immunitaires.

Décrit ici est une méthode qui tire parti de la transparence et le développement rapide du poisson zèbre pour démontrer la reconnaissance et le ciblage des cellules cancéreuses humaines par des nanoparticules fluorescentes in vivo. Dans ce test, les cellules cancéreuses du col de l’utérus humains (cellules HeLa) génétiquement modifiées pour exprimer une protéine fluorescente rouge ont été injectées dans la zone vascularisée dans la cavité périviseline de 48 embryons de hpf. Après 20-24 h, les cellules HeLa s’étaient déjà propagées à travers les embryons par le système circulatoire des poissons. Les embryons atteints de métastases apparentes ont été microinjectés avec ~0,5 nL d’une solution de nanoparticule directement derrière l’œil, où se trouve le riche lit capillaire. Grâce à cette technique, les nanoparticules fluorescentes ultrabright peuvent cibler les cellules HeLa aussi rapidement que 20-30 min post-injection. En raison de sa simplicité et de son efficacité, le poisson zèbre représente un modèle in vivo robuste pour tester une variété de nanoparticules pour leur capacité à cibler des cellules cancéreuses spécifiques.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Boston University School of Medicine en vertu du protocole #: PROTO201800543.

1. Génération d’embryons de poisson zèbre Casper

1. Choisissez des poissons casper adultes âgés d’au moins 3 mois pour la reproduction naturelle afin de générer des embryons transparents de poisson zèbre Casper.
2. Remplir les réservoirs d’accouplement à deux chambres d’eau de poisson le soir, séparer les réservoirs supérieurs à l’aide de séparateurs, placer un poisson mâle dans un côté de la chambre et un ou deux poissons femelles dans l’autre côté de la chambre, et laisser le poisson séparé pendant la nuit par des séparateurs.
3. Retirez les séparateurs le lendemain matin à 8h00 lorsque les lumières sont allumées. Ajouter les plantes d’enrichissement artificiel et incliner légèrement la chambre supérieure pour créer une zone peu profonde de l’eau. Laisser les poissons se reproduire pendant 3-4 h.
4. Soulevez les chambres supérieures des réservoirs d’accouplement qui contiennent les poissons et retournez-les dans leurs réservoirs d’origine.
5. Recueillir les œufs situés dans les chambres inférieures en versant l’eau à travers un filet de maille. Transférer les œufs dans une boîte de Pétri stérile à une densité ne pas dépasser 200 œufs par plat. Retirer les œufs morts ou non fécondés et remplir le plat 2/3 d’eau fraîche.
   REMARQUE : Les œufs fécondés et sains doivent être translucides et ronds. Tous les œufs nuageux, blancs ou défigurés doivent être enlevés. L’eau de poisson est obtenue à partir de réservoirs de poissons dans l’installation de poissons.
6. Incuber les embryons dans l’incubateur à 28,5 °C pendant la nuit.
7. Blanchir les embryons le lendemain matin en utilisant le protocole standard tel que décrit dans le Livre de poissons zèbres¹⁶, et remettre les embryons à l’incubateur (étape facultative).
8. Sortez les 24 embryons de hpf de l’incubateur dans l’après-midi et déchoirez les embryons à l’aide de pronase.
   1. Retirer autant d’eau de poisson que possible des embryons dans la boîte de Pétri et ajouter quelques gouttes de la solution pronase (1 mg/mL dans l’eau de poisson) au plat. Faire tourbillonner délicatement la boîte de Pétri. Une fois que les chorions montrent des signes de désintégration, pipette les embryons de haut en bas à quelques reprises pour décomposer les chorions pour libérer les embryons.
   2. Ajouter immédiatement de l’eau de poisson frais dans la boîte de Pétri pour mettre fin au processus une fois que la majorité des embryons sont hors des chorions. Rincer les embryons 3 fois plus à l’aide d’eau de poisson pour enlever les chorions flottants. Retournez les embryons à l’incubateur.

2. Préparation des cellules cancéreuses humaines pour la transplantation

1. Réglez la température de l’incubateur à exactement 35.5 °C. Surveillez l’incubateur pour assurer une température constante et stable à l’aide d’un thermomètre à l’intérieur de l’incubateur.
2. Autoclave 1 L d’eau de poisson dans une bouteille en verre. Faire une solution agarose de 3 % en ajoutant 3 g d’agarose de qualité électrophorèse à 100 mL d’eau de poisson autoclavée et de micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
   1. Verser la solution agarose chaude dans une boîte de Pétri jusqu’à ce qu’elle soit pleine de 3/4. Placez le moule de microinjection sur l’agarose. Assurez-vous que le moule n’est pas en contact avec le fond de la boîte de Pétri et qu’aucune bulle ne se forme en dessous.
   2. Laissez la solution solidifier et retirer soigneusement le moule de la plaque. Remplissez la plaque d’eau de poisson autoclavée et rangez la plaque à 4 °C. Préguerre la plaque d’agarose et l’eau de poisson dans l’incubateur de 35,5 °C avant de récolter les cellules HeLa.
3. Tirez 1,0 mm O.D. x 0,78 mm de capillaires en verre borosilicate sur un puller de pipette en utilisant les réglages suivants : pression à 500, chaleur à 560, traction à 100, vitesse à 100 et temps/retard à 200. Conservez les aiguilles sur le mastic dans une grande boîte de Pétri qui a été essuyée avec une serviette à l’éthanol.
   ATTENTION : Les aiguilles tirées sont très pointues et fragiles. Soyez prudent lors de la manipulation.
4. Préparer une solution de stockage de méthanesulfonate de tricaine (MS222, 4 mg/mL) en dissolvant le MS222 dans l’eau de poisson autoclavée. Vortex bien avant utilisation. Diluer la solution de stock MS222 1:100 dans l’eau de poisson (c.-à-d. ajouter 200 μL de solution de stock MS222 à 20 mL d’eau de poisson à une concentration finale de 40 μg/mL) pour anesthésier les embryons pour les procédures suivantes.
5. Culture hLabel HeLa cellules en les transducant avec PLenti6.2_miRFP670 lentivirus en utilisant le protocole décrit¹⁷. Récoltez les cellules RFP+ HeLa 30 min-1 h avant la transplantation.
   REMARQUE : Les cellules hela humaines ont été cultivées dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à 70% de confluence dans le milieu de croissance complet (milieu DMEM avec 10% FBS) à 37 °C complétés par 5% de CO₂.
   1. Retirez le milieu cellulaire HeLa par aspiration dans une hotte de culture tissulaire. Rincez brièvement la couche cellulaire à l’un de la pbs stérile pour enlever toutes les traces du sérum.
   2. Ajouter 3,0 ml de solution stérile Trypsine-EDTA à une fiole T-75 et remettre les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 3 à 5 min pour faciliter la digestion enzymatique. Observez la fiole au microscope jusqu’à ce que ~80% des cellules deviennent suspendues.
   3. Ajouter 6 à 8 ml de milieu de croissance complet dans la fiole. Recueillir les cellules dans un tube stérile de 15 mL en pipeting doucement. Centrifugeuse à 135 x g pendant 5 min.
   4. Remplacer les cellules HeLa supernatantes et resuspend dans 3 mL de milieu de croissance complet. Répétez l’étape de lavage 2x ci-dessus. Resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu de croissance complet et comptez les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre.
   5. Faites tourner les cellules vers le bas à nouveau, retirez le supernatant, et resuspendent les cellules dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL à une concentration de 5 x 10⁷ cellules/mL. Gardez les cellules au chaud en tenant le tube dans une main lors du transport à l’installation de poissons.
      REMARQUE : Gardez toujours les cellules au chaud en stockant les cellules à l’intérieur de l’incubateur de 35,5 °C avant ou pendant l’injection des embryons.

3. Transplantation de cellules cancéreuses humaines

1. Nettoyez la zone de travail à l’aide de serviettes à éthanol avant la transplantation (ciseaux, pinces à épiler, pipettes en plastique, lames de rasoir).
2. Aligner les embryons dans les rainures de la plaque d’agarose à l’aide d’une pipette en plastique. Déposer les embryons sur le côté avec le face avant antérieur vers l’avant.
   REMARQUE : Assurez-vous que l’eau de poisson recouvre les embryons. Mettre certains embryons de côté pour ne pas injecter de cellules cancéreuses et les utiliser comme témoins.
3. Allumez la source d’air et le microinjecteur. Retirez les cellules HeLa de l’incubateur et pipette les cellules de haut en bas 20-30x à l’aide d’une pointe P200. Charger 3 μL de mélange cellulaire immédiatement dans une aiguille à l’aide d’une pointe de chargement de gel avec une extrémité coupée. Insérez soigneusement la pointe vers l’extrémité inférieure pointue de l’aiguille. Si nécessaire, secouez l’aiguille pour s’assurer que le mélange cellulaire se déplace vers le bas de l’aiguille pour remplir l’extrémité pointue.
   1. Insérez l’aiguille dans le support de l’aiguille. Utilisez une pince à épiler pour ouvrir soigneusement le bout de l’aiguille. Ajuster la pression et la durée du temps sur le microinjecteur pour repousser toutes les bulles d’air à l’intérieur de la pointe de l’aiguille. Réduisez la durée de la pression et de la durée d’injection jusqu’à ce que la taille des gouttelettes d’injection soit de ~1 nL.
   2. Placez la plaque d’injection sous le microscope dans une position appropriée pour avoir le côté jaune des embryons face à l’aiguille. Anesthésier les embryons en ajoutant cinq gouttes de la solution diluée MS222 (40 μg/mL).
   3. Positionnez l’injecteur et laissez l’aiguille toucher la cavité périviseline de chaque embryon.
4. Injecter le mélange cellulaire dans les embryons à la zone vascularisée sous la cavité périviseline en appuyant sur la pédale du pied.
5. Utilisez la main non dominante pour déplacer la plaque d’injection vers l’embryon suivant. Utilisez la main dominante pour étendre et rétracter l’injecteur tout en appuyant simultanément sur la pédale de pied pour continuer l’injection. Pipette quelques gouttes d’eau de poisson stérile sur les embryons qui ont été injectés. Une fois l’injection de tous les embryons sur la plaque terminée, laver les embryons avec de l’eau de poisson stérile, les mettre sur une boîte de Pétri stérile et les déplacer immédiatement à l’incubateur de 35,5 °C.
6. Après 3 h, examiner les embryons injectés et enlever les embryons morts.
7. Remettre les embryons vivants à l’incubateur de 35,5 °C et les incuber pendant 20 à 24 h pour permettre aux cellules HeLa de se propager du site d’injection à d’autres parties du corps.
   REMARQUE : Les embryons sont conservés dans un incubateur de 35,5 °C pour permettre la survie et la migration des cellules cancéreuses humaines parce que les cellules ne réussissent pas bien à 28,5 °C, la température des embryons de poissons sont normalement incubées.

4. Injection de nanoparticules ou de véhicules

1. Anesthésiez les embryons transplantés le lendemain matin avec cinq gouttes de solution diluée MS222. Ne pas ajouter trop de MS222, car cela tuera les embryons. Sous un microscope fluorescent, ramasser soigneusement les embryons avec la métastase de la queue des cellules de RFP+ HeLa et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri avec de l’eau de poisson stérile.
2. Faire les aiguilles d’injection comme décrit précédemment à la section 2 en utilisant les réglages suivants : pression à 500, chaleur à 645, traction à 60, vitesse à 50 et temps/retard à 100.
3. Suivez les procédures à l’étape 3.1-3.3 pour aligner les embryons et le véhicule de chargement (p. ex., H₂O) ou la solution de nanoparticule dans l’aiguille.
4. Injecter 0,5 nL de solution nanoparticule de 1 mg/mL derrière l’œil et poursuivre l’injection telle que décrite aux étapes 3.5-3.6 (figure 1B). Cet emplacement derrière les yeux est enrichi de capillaires, permettant aux nanoparticules d’entrer en circulation.
5. À la suite d’une procédure similaire, injectez le véhicule (p. ex., H₂O) qui a été utilisé pour suspendre les nanoparticules dans les embryons dont les cellules HeLa sont transplantées et celles qui n’en ont pas (c.-à-d. les contrôles) (figure 1A, C).
6. Incuber tous les embryons injectés à 35,5 °C.

5. Imagerie et suivi des nanoparticules et des cellules cancéreuses

1. Examiner les embryons injectés au microscope fluorescent à 0, 30, 60, 90, 120, 180 et 210 min post-injection de nanoparticules pour surveiller leur distribution en circulation et le degré de ciblage des cellules cancéreuses. Le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules peut être observé dès 30 min postinjection selon le type de nanoparticule testé.
2. Pipette 2-3 embryons dans une boîte de Pétri et les immobiliser en ajoutant cinq gouttes de solution diluée MS222 (40 μg/mL). Une fois que les embryons cessent de nager, retirez la majeure partie de l’eau pour permettre aux embryons de se coucher sur leurs côtés.
3. Utilisez une pipette avec une brosse fine et douce attachée à son extrémité pour aligner les embryons de sorte qu’ils se trouvent sur leurs côtés avec le précédent face vers l’avant et un seul œil visible.
4. Imagez les embryons en rouge, bleu et brillant canaux à faible grossissement (2x) pour capturer l’embryon entier et répéter à un grossissement plus élevé (6,4x) pour capturer la zone de la queue. Concentrez l’embryon sous le canal rouge pour éviter le saignement des nanoparticules.
   REMARQUE : Les embryons ne doivent pas se déplacer pendant l’imagerie. Tout mouvement conduira à des images floues et l’incapacité de chevaucher des images de différents canaux.
5. Ajoutez de l’eau fraîche aux embryons immédiatement après l’imagerie et retournez-les à l’incubateur. Répétez les étapes 5.2-5.4 pour imager les embryons à différents points de temps.

Résultats

Le schéma du protocole de la figure 1 illustre les procédures globales de cette étude. Des poissons adultes mâles et femelles en casper transparent ont été élevés pour produire des embryons (section 1). Les cellules de RFP+ HeLa ont été injectées dans la zone vascularisée sous la cavité périviseline des embryons de poisson zèbre à 48 hpf, avec des embryons non injectés comme témoins (section 3). Pour les personnes expérimentées en...

Discussion

Le protocole décrit ici utilise le poisson zèbre comme un système in vivo pour tester la capacité des nanoparticules à reconnaître et à cibler les cellules cancéreuses humaines métastatiques. Plusieurs facteurs peuvent avoir un impact sur l’exécution réussie des expériences. Tout d’abord, les embryons doivent être entièrement développés à 48 hpf. Le stade de développement correct des embryons leur permet de supporter et de survivre à la transplantation de cellules cancéreuses humaines. Les embryon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122