In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de Photoconvertible Dendra2

Résumé

Présenté ici est un protocole pour surveiller la dégradation de la protéine huntingtine fusionnée au fluorophore photoconvertible Dendra2.

Résumé

Les protéines sont synthétisées et dégradées constamment dans une cellule pour maintenir l’homéostasie. Être capable de surveiller la dégradation d’une protéine d’intérêt est essentiel pour comprendre non seulement son cycle de vie, mais aussi pour découvrir les déséquilibres dans le réseau de protéostase. Cette méthode montre comment suivre la dégradation de la huntingtine protéique causant la maladie. Deux versions de huntingtine fusionnées à Dendra2 sont exprimées dans le système nerveux de C. elegans : une version physiologique ou une avec une étendue étendue et pathogène de glutamines. Dendra2 est une protéine fluorescente photoconvertible; sur une courte impulsion d’irradiation ultraviolette (UV), Dendra2 passe de vert à rouge ses spectres d’excitation/émission. Semblable à une expérience de chasse à l’impulsion, le chiffre d’affaires du red-Dendra2 converti peut être surveillé et quantifié, indépendamment de l’interférence de la nouvelle synthèse verte-Dendra2. À l’aide de la microscopie confocale et de la transparence optique de C. elegans,il est possible de surveiller et de quantifier la dégradation de huntingtin-Dendra2 dans un organisme vivant et vieillissant. La huntingtine neuronale-Dendra2 est partiellement dégradée peu après la conversion et effacée plus loin au fil du temps. Les systèmes contrôlant la dégradation sont déficients en présence de huntingtine mutante et sont encore altérés par le vieillissement. Les sous-types neuronaux du même système nerveux présentent des capacités de rotation différentes pour huntingtin-Dendra2. Dans l’ensemble, la surveillance de toute protéine d’intérêt fusionnée à Dendra2 peut fournir des informations importantes non seulement sur sa dégradation et les acteurs du réseau de protéostase impliqués, mais aussi sur son emplacement, le trafic et le transport.

Introduction

Le protéome d’un organisme vivant se renouvelle constamment. Les protéines sont continuellement dégradées et synthétisées en fonction de la demande physiologique d’une cellule. Certaines protéines sont rapidement éliminées, tandis que d’autres sont plus longues. La surveillance de la dynamique des protéines est une tâche plus simple, plus précise et moins invasive lors de l’utilisation de protéines fluorescentes génétiquement codées (FP). Les RP se forment automatiquement et peuvent être fusionnés à n’importe quelle protéine d’intérêt (POI), mais n’ont pas besoin d’enzymes pour plier ou ont besoin de cofacteurs sauf pour l’oxygène¹. Une nouvelle génération de FP a récemment été conçue pour changer de couleur sur l’irradiation avec une impulsion lumineuse de longueur d’onde déterminée. Ces FPs photoactivables (PAFP) permettent l’étiquetage et le suivi des POI, ou des organites ou des cellules dans lesquelles ils résident, et d’examiner leurs paramètres quantitatifs et/ou qualitatifs². Les FP permettent de suivre le mouvement, la directionnalité, le taux de locomotion, le coefficient de diffusion, les fractions mobiles par rapport aux fractions immobiles, le temps qu’il réside dans un compartiment cellulaire, ainsi que son taux de rotation. Pour des organites spécifiques, la locomotion et le transport, ou les événements de fission et de fusion peuvent être déterminés. Pour un type de cellule particulier, la position, le taux de division, le volume et la forme d’une cellule peuvent être établis. Surtout, l’utilisation de PAFPs permet le suivi sans visualisation continue et sans interférence à partir d’une sonde nouvellement synthétisée. Des études menées dans des cellules et dans des organismes entiers ont utilisé avec succès des PAFP pour aborder des questions biologiques in vivo, telles que le développement du cancer et de la métastase, l’assemblage ou le démontage du cytosquelette, et les interactions ARN-ADN/protéine³. Dans ce manuscrit, la microscopie légère et les PAFP sont utilisés pour découvrir les taux de rotation de la huntingtine protéique (HTT) à l’agrégation in vivo dans un modèle de C. elegans de la maladie neurodégénérative.

Le protocole décrit ici quantifie la stabilité et la dégradation de la protéine de fusion huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 est un PAFP monomérique^de deuxième génération qui commute irréversiblement ses spectres d’émission/excitation du vert au rouge en réponse à la lumière bleue UV ou visible, avec une augmentation de son intensité allant jusqu’à 4 000 fois^5,6. Huntingtine est la protéine responsable de la cause de la maladie de Huntington (MH), un trouble neurodégénératif héréditaire mortel. Huntingtin exon-1 contient un tronçon de glutamines (CAG, Q). Lorsque la protéine est exprimée avec plus de 39Q, elle se replie mal en une protéine mutante, toxique et pathogène. Mutant HTT est sujette à l’agrégation et conduit à la mort et la dégénérescence des cellules neuronales, soit en tant qu’espèces oligomériques courtes ou comme plus grandes amyloïdes très structurées⁷.

Le nématode est un système modèle pour étudier le vieillissement et la neurodégénérescence grâce à sa facilité de manipulation, la nature isogénique, la courte durée de vie, et sa transparence optique⁸. Pour étudier la stabilité de HTT in vivo, une construction de fusion a été exprimée dans le système nerveux de C. elegans. Un transgène HTT-D2 contenant soit un tronçon physiologique de 25Qs (HTTQ25-D2) ou un tronçon pathologique de 97Qs (HTTQ97-D2) est surexprimé pan-neuronal tout au long de la durée de vie du nématode⁹. En soumettant C. elegans en direct à un point de lumière bref et concentré, un seul neurone est photoswitched et le HTT-D2 converti est suivi au fil du temps. Pour établir la quantité de HTT-D2 dégradée, la différence entre le signal rouge du HTT-D2 fraîchement converti est comparée au signal rouge restant de HTT-D2 après une période déterminée. Par conséquent, il devient possible d’étudier comment la huntingtine est dégradée lorsqu’elle est trouvée sous sa forme étendue et toxique par rapport à sa forme physiologique; comment les neurones antérieurs ou postérieurs réagissent différemment à la présence de Q97 par rapport au Q25, en particulier sur des périodes prolongées; et comment l’effondrement du réseau de protéostase (PN) pendant le vieillissement contribuent aux différences dans les taux de dégradation. Ces résultats ne décrivent qu’un petit ensemble d’observations sur le chiffre d’affaires de HTT-D2. Cependant, beaucoup plus de questions biologiques pertinentes à la fois dans le domaine de l’agrégation des protéines et de la protéostasie peuvent être abordées avec cette application in vivo.

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Protocole

1. Génération de C. elegans exprimant la protéine de fusion neuronale Huntingtin-Dendra2

1. Clonez le gène codant le POI dans un vecteur d’expression nématode (c.-à-d. pPD95_75, Addgene #1494), par l’enzyme de restriction traditionnelle digest¹⁰, Gibson assembly¹¹, ou n’importe quelle méthode de choix. Insérez un promoteur pour conduire l’expression dans un tissu désiré ou à un stade de développement souhaité. Insérez le fluorophore Dendra2 en phase terminale N ou C avec le POI.
2. Générer transgénique C. elegans exprimant la construction de fusion (par exemple, par microinjection)¹².
   REMARQUE : Le plasmide transportant le transgène restera comme un réseau extrachromosomique. L’intégration de la construction n’est pas nécessaire mais peut être effectuée si désiré¹³. Dans ce protocole, C. elegans ont été microinjectés avec un plasmide portant la fusion construction huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) sous le contrôle du promoteur pan-neuronal Prgef-1. L’épine dorsale d’expression de C. elegans a été obtenue de Kreis et coll.¹⁴, l’exon de huntingtin 1 avec Q25 ou Q97 a été obtenu de Juenemann et al.¹⁵, et Dendra2 a été obtenu de Hamer et al.¹⁶.

2. Appariement de l’âge et entretien de C. elegans

1. L’âge correspond à tous les nématodes en synchronisant soit avec le traitement de solution d’hypochlorite^{alcaline 17} ou par la ponte pendant 4 h à 20 °C. Pour la ponte, placer 10 adultes gravid sur une plaque de milieu de croissance de nématodes fraîchement ensemencés (NGM) et laisser reposer 4 h avant d’enlever. Les œufs pondus dans ce laps de temps donneront lieu à des nématodes synchronisés.
2. Conservez des plaques expérimentales de C. elegans sur des plaques de milieux de croissance de nématode (NGM) ensemencées avec la source bactérienne de nourriture E. coli OP50, suivant l’élevage standard de nématode¹⁸.
3. Cultiver les nématodes à 20 °C jusqu’au stade désiré. Pour ce protocole, les âges requis sont les jours 4 et 10.
   REMARQUE : Les jeunes adultes au jour 4 peuvent être identifiés par la présence d’œufs dans leurs gonades et leur grande mobilité. Les nématodes âgés de 10 jours sont post-fertiles et subissent une détérioration des tissus et un déclin des locomotives¹⁹.
4. Pour le jour 10 nématodes, passage tous les jours après l’étape L4 au jour 3, une fois que les nématodes sont fertiles, pour éviter une population mixte.

3. Préparation de lames de microscopie pour l’imagerie

1. Préparez les diapositives de microscopie le jour de l’imagerie. Dans un four à micro-ondes, faire fondre l’agarose générale de qualité générale à une concentration de 3 % (w/v) en ddH₂O. Laisser refroidir légèrement.
2. Couper la pointe d’une pipette de 1 mL et aspirate environ 400 μL d’agarose fondue. Placez doucement quelques gouttes d’agarose sur une glissière en verre propre et placez immédiatement une autre diapositive sur le dessus, en veillant à ce qu’un mince tampon d’agarose soit créé entre les deux. Laisser sécher avant de glisser doucement ou de soulever la lame supérieure.
3. Placez les toboggans de la garniture d’agarose dans un récipient humidifié pour les empêcher de sécher. Ceux-ci peuvent être utilisés dans les 2-3 h.
   REMARQUE : Évitez la formation de petites bulles dans l’agarose, car les nématodes peuvent être emprisonnés à l’intérieur.

4. Définition des paramètres du microscope confocal

REMARQUE : Avant de monter les nématodes et l’acquisition de données, définissez tous les paramètres du logiciel d’acquisition confocal. Les paramètres peuvent être adaptés au matériel d’imagerie et aux logiciels de choix.

1. Ouvrez le logiciel confocal et définissez les paramètres d’imagerie laser. Définissez le chemin lumineux pour l’excitation/émission pour le Vert Dendra2 à 486-553 nm et pour le rouge Dendra2 à 580-740 nm. Ajuster la puissance et le gain des deux canaux/lasers en fonction de l’intensité du fluorophore. Ne modifiez pas le gain ou le décalage numérique et définissez le trou d’épingle comme étant entièrement ouvert.
2. Définissez la configuration de l’acquisition : sélectionnez un mode de canal séquentiel et passez une piste de chaque image. Définissez le mode d’analyse comme cadre et la taille du cadre comme 1 024 x 1 024, avec une étape de ligne de 1. Définissez la moyenne à 2, et la moyenne par méthode moyenne et le mode de ligne unidirectionnelle. Réglez la profondeur du bit à 8 bits.
3. Définissez les paramètres d’acquisitions multidimensionnelles pour la conversion de Dendra2. Pour la conversion et le blanchiment, utilisez le laser à diodes de 405 nm réglé à 60% de puissance énergétique. Si disponible, activez le gaAsP de blanchiment sécuritaire pour protéger les détecteurs.
4. Sélectionnez une série de temps de deux cycles, avec un intervalle de 0,0 ms entre les deux, et début et arrêt normal. Commencez le blanchiment après l’analyse 1 sur 2 et répétez pour 30 itérations. Arrêtez le blanchiment lorsque l’intensité tombe à 50%.
5. Définissez la vitesse d’acquisition/pixel habiter aussi rapidement (p. ex., maximum = 12) pour la conversion, et à vitesse moyenne (p. ex., moyenne = 5) pour capturer une image en forme.
   REMARQUE : Les paramètres de blanchiment définis ici sont des lignes directrices. Pour d’autres POI marqués Dendra2, les paramètres de puissance laser et les itérations et valeurs de blanchiment doivent être établis empiriquement.

5. Montage de C. elegans sur des lames de microscopie

REMARQUE : Si possible, placez un stéréomicroscope de montage près de la configuration du microscope confocal et montez les nématodes juste avant l’imagerie.

1. Sur la glissière de couverture de verre sur le côté opposé de la garniture d’agarose, dessinez une fenêtre avec quatre carrés avec un marqueur permanent et les numérotez.
2. Pipette 15 μL de levamisole au milieu de la garniture d’agarose. La concentration de levamisole variera selon l’âge du nématode : Lorsque les nématodes du jour 4 utilisent 2 mM de levamisole; lorsque l’imagerie jour 10 nématodes utilisent 0,5 mM levamisole.
3. Transférer quatre nématodes dans le liquide à l’aide d’un pic à fil. À l’aide d’un pic à cils, déplacez doucement chaque nématode individuel sur un carré de fenêtre. Pivoter le cil de sorte que toute trace de E. coli OP50 est diluée et son fond fluorescent n’interfère pas avec l’acquisition du signal.
4. Attendez que les nématodes cessent presque de bouger et placez doucement un couvercle sur le liquide pour immobiliser les nématodes dans la couche de levamisole entre le tampon agarose et le glissement de couverture.
5. Placez la diapositive inversée sur la scène confocale pour imager les nématodes.

6. Conversion du vert Dendra2 : Acquisition de données au moment zéro

REMARQUE : Les expériences de chasse aux impulsions commencent par convertir de façon irréversible la protéine de fusion Dendra2 d’un fluorophore vert émettant à une protéine rouge.

1. À l’aide de l’oculaire du microscope, localiser le premier nématode avec un objectif de 20x sous fluorescence verte. Concentrez-vous sur la tête ou la queue et passez en mode confocal.
2. Commencez le balayage laser en direct avec le laser bleu de 488 nm pour visualiser le Dendra2 vert dans le canal vert EGFP (ex/em = 486-553 nm). Sélectionnez un seul neurone et mettant en évidence. Zoomez en 3x et augmentez la cible du faisceau laser⁴.
   REMARQUE : Sélectionnez un neurone par nématode. Chaque neurone constituera un échantillon ou un point de données.
3. Trouvez le plan de projection maximal et, selon la luminosité du fluorophore, augmentez ou diminuez la puissance du gain ou du laser pour obtenir une image saturée mais non surexposée identifiable par l’indicateur de la plage de couleurs. Une fois cela défini, arrêtez la numérisation.
   REMARQUE : Ne pas irradier l’échantillon trop longtemps ou avec trop de puissance, car l’excitation avec la lumière bleue visible de 488 nm peut également convertir Dendra2, quoique lentement et moins efficacement⁴.
4. Dans le logiciel, ouvrez l’onglet pour sélectionner les régions d’intérêt (ROI) et dessinez un premier retour sur investissement autour du neurone sélectionné. Définissez une deuxième région d’intérêt plus grande englobant la tête du nématode et y compris le premier retour sur investissement.
5. Dans les paramètres de blanchiment, sélectionnez pour le premier retour sur investissement à acquérir, blanchir et analyser. Sélectionnez pour le deuxième retour sur investissement à acquérir et à analyser, mais non blanchi.
6. Réglez la vitesse de numérisation au maximum (c.-à-d. l’habitation rapide des pixels) et commencez l’expérience pour convertir les neurones Dendra2 sélectionnés.
   REMARQUE : Une fois l’expérience terminée, l’image acquise se traduira par deux images : une avant et une après la conversion. Pour le canal vert, la première image doit avoir un signal vert plus élevé qui diminue dans la deuxième image en raison de la conversion du Vert Dendra2. Pour le canal rouge, la première image doit être négative et ne montrer aucun signal, avec un signal rouge apparaissant dans l’image après la conversion. Si le signal vert ne diminue pas, la conversion n’a pas eu lieu et les paramètres, tels que la puissance laser 405 ou le nombre d’itérations, doivent être modifiés. S’il y a un signal rouge dans la première image, alors la puissance laser de 488 nm utilisée était trop élevée et une partie du Dendra2 vert a déjà été convertie en rouge. Dans ce cas, un nouveau neurone/nématode doit être sélectionné.
7. Immédiatement après la conversion, commencez à scanner en direct avec le laser vert 561 nm pour visualiser Dendra2 dans le canal rouge (ex/em = 580-740 nm). Trouvez la mise au point et la projection maximale respective du neurone converti à l’aide de l’indicateur de couleur de plage pour éviter la surexposition.
8. Réglez rapidement le taux d’analyse à une vitesse d’habitation inférieure de pixel (par exemple, 5x) et obtenez une image instantanée des deux canaux à une résolution plus élevée. Cette image est définie comme point de temps zéro (T0) après conversion.
   REMARQUE : La vitesse d’acquisition de l’image convertie peut être variée. Toutefois, une fois choisie, cette vitesse doit rester constante tout au long de la collecte de données.
9. Enregistrez l’analyse avec un nom et/ou un numéro identifiable, suivi de l’étiquette time zero (T0).
   REMARQUE : Il est conseillé de sauvegarder également l’image de l’expérience de conversion (étape 6.6) pour illustrer l’absence de signal rouge avant la conversion et son apparence par la suite.

7. Imagerie de Dendra2 rouge converti pour l’acquisition de données à un deuxième point de temps sélectionné

1. Pour suivre la dégradation de Dendra2 au fil du temps, définissez un deuxième timepoint pour reimager le même nématode/neurone. Sélectionnez le deuxième point de temps expérimentalement pour répondre à toute question biologique pertinente. Pour le protocole décrit ici, Dendra2 est photographié à la fois à 2 h (T2) et 24 h (T24) après la conversion.
   1. Au point de temps sélectionné, trouver le même nématode / neurone avec l’utilisation de l’oculaire et la fluorescence rouge.
   2. Ouvrez l’image T0 du nématode/neurone respectif et rechargez/réutilisez les paramètres de l’image. Assurez-vous que les paramètres d’acquisition de l’instantané sont exactement les mêmes lors de l’acquisition des images T0, T2 et T24 h.
   3. Numérisation en direct dans le canal rouge, mettre le neurone rouge converti au point. Étant donné que le Dendra2 rouge se dégrade au fil du temps, l’indicateur de plage affichera une projection maximale moins intense. Ne modifiez aucun paramètre d’acquisition et obtenez un instantané à la même vitesse (p. ex., 5x) que la première image.
2. Pour suivre la dégradation de Dendra2 après 4 h ou plus, sauvez les nématodes après la conversion.
   1. Retirez la lame du microscope immédiatement après la conversion et l’imagerie des quatre nématodes. Retirez doucement le couvercle et à l’aide d’un pic, soulevez chaque nématode du tampon agarose.
   2. Placez chaque nématode individuellement sur une plaque NGM bien étiquetée et identifiable.
   3. Pour le deuxième point, montez à nouveau le nématode sur un tampon d’agarose frais et procédez à l’imagerie du Dendra2 rouge converti suivant les instructions de la section 6.

8. Analyse d’image de Dendra2 converti

NOTE: L’analyse de la dégradation de Dendra2 est effectuée avec le logiciel Fidji/ImageJ²⁰.

1. Ouvrez Fidji et faites glisser et déposez le fichier .lsm dans la barre des Fidji. Ouvrez l’image T0 prise juste après la conversion et l’image du même nématode prise au moment sélectionné après la conversion (T2 ou T24 h).
   REMARQUE : Pour suivre la dégradation de la protéine d’intérêt fusionnée à Dendra2, seul le canal rouge doit être analysé.
2. Établir les paramètres de mesure à partir du menu : Analyser | Définir les mesures. Sélectionnez les fonctions Zone et Densité intégrée.
3. Sélectionnez l’image obtenue avec le canal rouge. Sélectionnez l’outil de sélection Polygone dans la barre Fidji.
4. Identifiez le neurone converti sur l’image T0 et dessinez un retour sur investissement à l’aide de l’outil de sélection.
   1. Pour identifier correctement les contours du neurone, mettez en évidence les seuils d’intensité en sélectionnant dans la barre Image | Ajuster | Seuil. Faites glisser le curseur de la barre pour délimiter le seuil et suivre autour de cette zone à l’application polygone. Pour générer un retour sur investissement précis, il est également possible d’utiliser le contour du neurone sélectionné à partir du canal vert.
5. Une fois que la sélection a été faite dans la fenêtre du canal rouge, appuyez sur Analyser | Mesure. Une fenêtre contextuelle nommée Résultats s’affiche et inclut les valeurs de retour sur investissement pour Area, IntDenet RawIntDen.
6. Effectuer le même processus de sélection et de mesure pour l’image du deuxième point de temps (T2 ou T24 h).
7. Copiez les valeurs obtenues dans un logiciel de feuille de calcul, en prenant soin d’enregistrer correctement les valeurs à T0 après la conversion, et à T2 ou T24 h après la conversion.

9. Calcul du rapport de dégradation de Dendra2

1. Pour calculer le rapport de dégradation, attribuer d’abord une valeur de 1 (ou 100%) temps de la dégradation à partir du point de temps zéro (c.-à-d. juste après la conversion, lorsque tous les Dendra2 rouges convertis sont toujours présents). Cela résulte de la division de la valeur d’IntRawDen de T0 par elle-même.
2. Pour calculer la réduction du signal d’intensité rouge Dendra2 au fil du temps, et la dégradation, divisez la valeur de RawIntDen du deuxième point de temps (par exemple, T2 ou T24 h) par la valeur du RawIntDen de T0. Le nombre qui en résulte doit être inférieur à 1. Ces valeurs peuvent également être exprimées en pourcentages, définissant T0 comme 100%.
3. Répétez la section 7 pour chaque nématode converti. Pour une représentation graphique de la dégradation de Dendra2, tracez une parcelle de dispersion ou un graphique à barres avec le pourcentage ou les valeurs de rapport de diminution de fluorescence obtenus dans l’axe y. Appliquez toute analyse statistique souhaitée et illustrez-la sur le graphique.

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Résultats

Deux souches de nématode exprimant le fragment de protéine de huntingtine exon-1 dans le cadre avec la protéine photoconvertitible Dendra2 ont été obtenues par microinjection et les plasmides ont été conservés comme un tableau extrachromosomique. La construction de fusion a été exprimée dans l’ensemble du système nerveux de C. elegans du développement tout au long du vieillissement. Ici, HTT-D2 contenait soit l’étirement physiologique de 25 polyglutamine (HTTQ25...

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Discussion

Pour comprendre la fonction d’une protéine, il est important de comprendre sa synthèse, son emplacement et sa dégradation. Avec le développement de FP nouveaux, stables et brillants, la visualisation et la surveillance des POI sont devenues plus faciles et plus efficaces. Les PAFP de fusion génétiquement exprimés comme Dendra2 sont particulièrement bien placés pour étudier la stabilité d’un POI. Lors de l’exposition à la lumière bleu pourpre, Dendra2 se brise à un endroit précis dans une triade d’a...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software