Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

Résumé

Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.

Résumé

Le protocole actuel décrit les méthodes de production de tissus cardiaques évolutifs et en forme de maille (ECT) composés de cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs), qui sont développées vers l’objectif de l’utilisation clinique. Les cardiomyocytes dérivés de HiPSC, les cellules endothéliales et les cellules murales vasculaires sont mélangés à une matrice de gel, puis versés dans un moule tissual polydiméthylsiloxane (PDMS) avec des poteaux rectangulaires décalés internes. Par jour de culture, 14 ECT mûrissent en une structure en maille de 1,5 cm x 1,5 cm avec des faisceaux de myofiber de 0,5 mm de diamètre. Les cardiomyocytes s’alignent sur le long axe de chaque faisceau et battent spontanément de façon synchrone. Cette approche peut être étendue jusqu’à un plus grand (3,0 cm x 3,0 cm) maillage ECT tout en préservant la maturation de la construction et la fonction. Ainsi, les ECT en forme de maille générées par les cellules cardiaques hiPSC-dérivées peuvent être réalisables pour les paradigmes de régénération cardiaque.

Introduction

De nombreuses études précliniques et essais cliniques ont confirmé l’efficacité des thérapies régénératrices cardiaques à base de cellules pour les cœurs défaillants^1,2,3. Parmi divers types de cellules, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) sont des sources de cellules prometteuses en raison de leur capacité proliférative, le potentiel de générer diverses lignées cardio-vasculaires^4,5, et l’allogénicité. En outre, les technologies d’ingénierie tissulaire ont permis de transférer des millions de cellules sur un cœur endommagé^5,6,7,8.

Auparavant, nous avons signalé la génération de tissus cardiaques linéaires (ECT) linéaires tridimensionnels (ECT) à partir de lignées cardiovasculaires dérivées de hiPSC à l’aide d’un système de culture disponible dans le commerce pour les tissus bioartificiels 3D^5,7. Nous avons constaté que la coexistence des cellules endothéliales vasculaires et des cellules murales avec des cardiomyocytes dans l’ECT a facilité la maturation structurelle et électrophysiologique de tissu. En outre, nous avons validé le potentiel thérapeutique des hiPSC-ECT implantés dans un modèle d’infarctus du myocarde de rat tolérant immunitaire pour améliorer la fonction cardiaque, régénérer le myocarde, et améliorer l’angiogenèse⁵. Toutefois, les ECT linéaires construits par cette méthode étaient des cylindres de 1 mm sur 10 mm et ne convenaient donc pas à l’implantation dans des études précliniques avec des animaux plus grands ou une utilisation clinique.

Basé sur l’utilisation réussie des moules de tissu pour générer la formation de tissu poreux conçu utilisant des myoblastes squelettiques de rat et des cardiomyocytes^9,les cardiomyocytes humains esc-dérivés¹⁰ et les iPSCs de souris¹¹, nous avons développé un protocole pour produire des tissus implantables plus grands hilosC-dérivés évolutifs utilisant des moules polydiméthylsiloxanes (PDMS). Nous avons évalué une gamme de géométries de moule pour déterminer les caractéristiques les plus efficaces de moule. Les ECT en forme de maille avec plusieurs faisceaux et jonctions présentaient d’excellentes caractéristiques en matière de viabilité cellulaire, de fonction tissulaire et d’évolutivité par rapport aux formats en feuilles simples ou linéaires qui manquaient de pores ou de jonctions. Nous avons implanté l’ECT en forme de maille dans un modèle d’infarctus du myocarde de rat et confirmé ses effets thérapeutiques similaires aux ECT cylindriques implantés¹². Ici, nous décrivons le protocole pour générer un ECT en forme de maille dérivé de hiPSC.

Protocole

1. Entretien des hiPSC et différenciation cardiovasculaire

1. Étendre et maintenir les hiPSC sur la matrice membranaire du sous-sol à couche mince (facteur de croissance réduit, dilution de 1:60) dans un milieu conditionné extrait des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF-CM) avec le facteur de croissance du fibroblaste de base humain (hbFGF)⁴.
   NOTE: Nous avons utilisé une ligne hiPSCs (4 facteurs (Oct3/4, Sox2, Klf4 et c-Myc) : 201B6). Ajouter hbFGF à la concentration appropriée pour chaque lignée cellulaire. Le fragment de laminine-511 peut également être utilisé pour le revêtement du plat de culture au lieu de la matrice de membrane de sous-sol. Le support disponible dans le commerce conçu pour la culture sans alimentation des hiPSC peut être utilisé comme substitut au MEF-CM.
2. Utilisez la solution Versene (0,48 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour détacher et dissocier les cellules lorsque la confluence cellulaire atteint 90\u2012100%.
   REMARQUE : D’autres produits disponibles dans le commerce pour la dissociation cellulaire peuvent également être utilisés.
3. Plaquez des cellules à une densité de 10 000 cellules/mm² sur des plaques de culture cellulaire enduites de matrice dans MEF-CM avec hbFGF et culture pendant deux à trois jours.
4. Lorsque la culture devient complètement confluente, couvrir les cellules avec la matrice (1:60 dilution avec MEF-CM) pendant une journée.
5. Remplacez le MEF-CM par un support RPMI 1640 + B27. Ajouter 100 ng/mL d’Activin A et 100 ng/mL de Wnt3A au milieu pour une journée.
   NOTE: C’est le jour 0 de la différenciation. Pour upréguler la signalisation canonique Wnt, les inhibiteurs de GSK3β peuvent également être utilisés au lieu de Wnt3A.
6. Le premier jour de différenciation, changer le milieu à nouveau RPMI 1640 + B27 avec 10 ng/mL de BMP4 et 10 ng/mL de hbFGF. Cellules de culture pour deux jours (protocole MC) ou quatre jours (protocole CM+EC) sans changement moyen⁵.
   REMARQUE : Le protocole CM+EC est optimisé pour induire simultanément les cellules cardiomyocytes (MC) et les cellules endothéliales vasculaires (CE). Le protocole MC est optimisé pour induire de préférence les cellules murales vasculaires (MC).
7. Cm+EC pour l’induction des MC et DES (Figure 1A).
   1. Remplacer le milieu le jour 5 de la différenciation par RPMI 1640 + B27 complété par 50 ng/mL de VEGF₁₆₅.
   2. Changer le milieu de culture tous les 48 h jusqu’au jour 13\u201215 de différenciation.
8. Protocole MC pour l’induction de cellules murales vasculaires (Figure 1B)
   1. Remplacer le milieu par RPMI1640 + 10% sérum bovin fœtal (FBS) au jour 3 de la différenciation.
   2. Changer le milieu de culture tous les 48 h jusqu’au jour 13\u201215 de différenciation.

2. Analyse de la récolte cellulaire et de la lignée le jour de différenciation 13\u201215

1. Laver les cellules avec ca²⁺ et Mg²⁺ saline à tampons de phosphate libre (PBS).
2. Ajouter la solution de dissociation cellulaire (contenant des protéases, des collagènes et des DNAses) dans le plat de culture cellulaire pour couvrir l’assiette. Incuber la plaque pendant 5 min à 37 °C.
3. Recueillir et dissocier les cellules avec un milieu de culture à l’aide d’une pipette après incubation.
4. Allouer 1 x 10⁶ cellules pour l’analyse de lignée avec cytométrie de flux. Pour éliminer les cellules mortes, tachez les cellules avec un colorant de viabilité réparable.
5. Tacher les cellules avec des marqueurs de surface membranaires dans PBS avec 5% FBS. Utiliser les dilutions suivantes d’anticorps dans le tampon de coloration des cellules activées par fluorescence (FACS) : anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE cadhérine (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
6. Pour les protéines intracellulaires, resuspendez et fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans PBS.
7. Tacher les cellules avec l’isoforme anti-cardiaque de Troponin T (cTnT) dans PBS avec 5% FBS et 0,75% Saponin, puis étiqueter l’anticorps cTnT avec 488 souris IgG1 (dilution 1:50).
8. Resuspendez les cellules tachées dans PBS avec 5% FBS et les mettre dans des tubes FACS avec passoire cellulaire.
9. Analyser la composition cellulaire des cellules tachées de chaque protocole de différenciation avec cytométrie de flux pour faciliter la génération de suspensions cellulaires avec des distributions de lignée définies.
   REMARQUE : Lors de cette procédure, la suspension cellulaire restante pour les ECT est conservée dans un réfrigérateur à 4 °C.

3. Fabrication de moule de tissu de PDMS

1. Lancer une couche de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 0,5 mm d’épaisseur et plus de 30 mm x 30 mm, puis guérir à 80 °C pendant 3 h.
2. Coupez la feuille PDMS et attachez-la à de l’adhésif en silicone pour fabriquer un plateau rectangulaire de 21 mm x 20,5 mm de 7 mm de long, 0,5 mm de large et des poteaux rectangulaires de 2,5 mm de haut à une position décalée. L’espacement horizontal des poteaux entre deux lignes de poteaux est de 2,5 mm (figure 2B).
3. Autoclavez le plateau à 120 °C pendant 20 min.
4. Enrober le plateau de 1% de poloxamère 407 en PBS pendant 1 h. Rincer le poloxamère 407 et rincer le moule avec pbs suffisamment avant l’utilisation.

4. Construction ECT

1. Après l’analyse de la lignée cellulaire, combiner les cellules des protocoles CM+EC et MC de sorte que la concentration finale de MC est de 10 à 20% dans un nombre total de cellules de six millions de cellules par construction⁵.
2. Suspendre six millions de cellules mélangées dans le milieu de culture ECT (milieu essentiel minimum alpha complété par 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol et 100 U/mL Péicilline-Streptomycine).
3. Préparation de la solution matricielle
   1. Mélanger 133 μL de solution de collagène de type I de collagène de queue de rat soluble acide (2 mg/mL, pH 3) à 17 μL de milieu essentiel minimum de 10 x (MEM). Mélanger ensuite la solution avec 17 μL de tampon alcalin (0,2 M NaHCO₃, 0,2 M HEPES et 0,1 M NaOH).
      REMARQUE : Le collagène doit être conservé sur la glace (4 °C). Vérifiez la couleur de la mémoire tampon et si le milieu ne devient pas rosé lorsque toutes les solutions sont mélangées, ajoutez un tampon alcalin supplémentaire au milieu. Les étapes de mélange doivent être mélanger collagène I + 10x MEM, puis ajouter tampon alcalin. NE MODIFIEZ PAS cet ordre. Ne pas générer de bulles dans le mélange.
   2. Ajoutez 67 μL de matrice de membrane de sous-sol à la solution neutralisée de collagène.
      REMARQUE : La solution mixte doit être conservée sur la glace (4 °C).
4. Centrifuger la suspension cellulaire préparée contenant six millions de cellules à 1 100 tr/min (240 x g)pendant 5 min et resuspender les cellules avec 167 μL de DMEM à haute teneur en glucose + 20 % FBS + 1 % de pénicilline-streptomycine (100x).
5. Mélangez la suspension cellulaire et la solution matricielle. Le volume total du mélange cellule/matrice pour une construction est de 400 μL.
   REMARQUE : Le mélange cellule/matrice doit être non visqueux et une couleur rosée à cette étape. Gardez-le sur la glace pendant que le gel se solidifie à température ambiante. La concentration finale de collagène de type I est de 0,67 mg/mL.
6. Verser le mélange cellulaire/matrice uniformément sur le moule de tissu pdms enduit de poloxamer 407, qui est placé dans une plaque de culture de six puits^12.
   REMARQUE : Versez soigneusement le mélange pour éviter de générer des bulles afin d’éviter de remplir les défauts dans le gel versé.
7. Incuber le mélange cellule/matrice dans un incubateur standard de CO₂ (37C, 5 % CO₂) pendant 60 min.
8. Après la formation du tissu, tremper le moule tissulaire avec 4 mL de milieu de culture ECT.
   REMARQUE : Bien que la cellule/matrice soit croisée en 60 min, la construction est encore très fragile. Ajouter le milieu doucement pour éviter de l’endommager.
9. Culture du tissu pendant 14 jours avec changement moyen chaque jour.
10. Avant l’implantation ect, retirez l’ECT des poteaux de chargement doucement à l’aide de forceps fins stérilisés.
    NOTE: Les dimensions ect finale après l’enlèvement du moule sont inférieures au moule d’origine. Un moule de 2,1 cm x 2,05 cm génère un ECT libéré d’environ 1,5 cm x 1,5 cm. Un moule plus grand de 3,9 cm x 4,05 cm génère un ECT d’environ 3 cm x 3 cm. L’ECT déchargé montre des battements spontanés intrinsèques dans le milieu de culture chaude. Bien qu’il maintienne d’abord une structure en maille, un ECT déchargé rétrécit et se condense au fil du temps. Il est possible de tenir le tissu doucement avec des forceps fins et ensuite utiliser 7-0 suture de soie pour attacher l’ECT à l’épicardium.

Résultats

La figure 1A,B montre les schémas du protocole CM+EC et MC. Après avoir induit les MC et les EC du protocole CM+EC et des MC à partir du protocole MC, les cellules sont mélangées en ajustant les concentrations finales de MC pour représenter 10 à 20 % du total des cellules. Le moule tissulaire de 2 cm de large est fabriqué selon le dessin de conception à partir de 0,5 mm d’épaisseur de la feuille PDMS (Figure 2A,B). S...

Discussion

Après l’achèvement de notre étude d’un format linéaire, hiPSC dérivé ECT⁵, nous avons adapté le protocole pour mélanger hiPSC-dérivés CM, EC, et MC pour faciliter l’expansion in vitro des cellules vasculaires dans les ECT et le couplage vasculaire in vivo ultérieur entre ects et myocardium receveur.

Pour faciliter la génération de géométries ECT de mailles plus grandes et implantables, nous avons utilisé de fines feuilles DEDM pour concevoir les mo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002