Application de la microdissection laser pour découvrir la transcriptomics régionale dans le tissu rénal humain

Résumé

Nous décrivons un protocole pour la microdissection laser des sous-segments du rein humain, y compris le glomerulus, le tubule proximal, le membre ascendant épais, le conduit de collecte et l’interstitium. L’ARN est ensuite isolé des compartiments obtenus et le séquençage de l’ARN est effectué pour déterminer les changements dans la signature transcriptomique dans chaque sous-segment.

Résumé

L’analyse de l’expression génétique du tissu rénal humain est un outil important pour comprendre l’homéostasie et la pathophysiologie des maladies. Il est nécessaire d’augmenter la résolution et la profondeur de cette technologie et de l’étendre au niveau des cellules dans le tissu. Bien que l’utilisation du séquençage d’ARN nucléaire et unicelliste unique soit devenue répandue, les signatures d’expression des cellules obtenues de la dissociation tissulaire ne maintiennent pas le contexte spatial. La microdissection laser (LMD) basée sur des marqueurs fluorescents spécifiques permettrait l’isolement de structures spécifiques et de groupes cellulaires d’intérêt avec localisation connue, permettant ainsi l’acquisition de signatures transcriptomiques ancrées spatialement dans le tissu rénal. Nous avons optimisé une méthodologie de LMD, guidée par une tache basée sur la fluorescence rapide, pour isoler cinq compartiments distincts dans le rein humain et mener le séquençage ultérieur d’ARN des spécimens humains précieux de tissu de rein. Nous présentons également des paramètres de contrôle de la qualité pour permettre l’évaluation de l’adéquation des spécimens recueillis. Le flux de travail décrit dans ce manuscrit montre la faisabilité de cette approche pour isoler les signatures transcriptomiques sous-segmentales avec une grande confiance. L’approche méthodologique présentée ici peut également être appliquée à d’autres types de tissus avec substitution de marqueurs anticorps pertinents.

Introduction

Les progrès technologiques dans l’étude des échantillons de tissus ont amélioré la compréhension de l’état de santé et de la maladie dans divers organes. Ces progrès ont souligné que la pathologie peut commencer dans des régions limitées ou dans des types de cellules spécifiques, mais ont des implications importantes sur l’ensemble de l’organe. Par conséquent, à l’ère actuelle de la médecine personnalisée, il est important de comprendre la biologie à la fois au niveau cellulaire et régional et pas seulement globalement¹. Cela est particulièrement vrai dans le rein, qui est composé de diverses cellules et structures spécialisées qui initient et/ou répondent différemment au stress pathologique. La pathogénie de divers types de maladie rénale humaine n’est toujours pas bien comprise. La génération d’une méthodologie pour étudier les changements dans l’expression des gènes dans des segments tubulaires spécifiques, des structures ou des zones de l’interstitium dans le rein humain améliorera la capacité de découvrir des changements spécifiques à la région qui pourraient éclairer sur la pathogénie de la maladie.

Les spécimens humains de biopsie rénale sont une ressource limitée et précieuse. Par conséquent, les technologies interrogeant la transcriptomique dans le tissu rénal devraient être optimisées pour économiser les tissus. Les méthodes disponibles pour étudier la transcriptomique au niveau cellulaire et régional comprennent le séquençage de l’ARN à cellule unique (scRNaseq), le RNaseq nucléaire unique (snRNaseq), l’hybridation spatiale in situ et la microdissection laser (LMD). Ce dernier est bien adapté à l’isolement précis des régions ou des structures d’intérêt dans les sections tissulaires, pour le séquençage et l’analyse de^{l’ARN en aval 2,3,4,5}. LMD peut être adopté pour s’appuyer sur l’identification de types ou de structures cellulaires spécifiques basés sur des marqueurs validés utilisant l’imagerie basée sur la fluorescence pendant la dissection.

Les caractéristiques uniques de la transcriptomics régionale assistée par microdissection laser comprennent : 1) la préservation du contexte spatial des cellules et des structures, qui complète les technologies cellulaires uniques où les cellules sont identifiées par expression plutôt qu’histologiquement; 2) la technologie informe et est informée par d’autres technologies d’imagerie parce qu’un marqueur d’anticorps définit des signatures d’expression ; 3) la capacité d’identifier les structures même lorsque les marqueurs changent dans la maladie; 4) détection de transcriptions faiblement exprimées dans environ 20 000 gènes; et 5) économie remarquable des tissus. La technologie est évolutive à une biopsie rénale avec moins de 100 μm d’épaisseur d’un noyau nécessaire à l’acquisition suffisante d’ARN et permet l’utilisation de tissus congelés archivés, qui sont couramment disponibles dans les grands dépôts ou centres universitaires⁶.

Dans les travaux qui ont suivi, nous décrivons en détail la technologie de transcriptomics régionale et en vrac, optimisée avec un nouveau protocole rapide de coloration par fluorescence pour une utilisation avec le tissu rénal humain. Cette approche améliore les explorations classiques du LMD parce qu’elle fournit des données d’expression distinctes pour les sous-segments interstitium et néphron par opposition à l’expression tubulointerstitial globale. On y inclut les mesures d’assurance et de contrôle de la qualité mises en œuvre pour assurer la rigueur et la reproductibilité. Le protocole permet la visualisation des cellules et des régions d’intérêt, ce qui se traduit par l’acquisition satisfaisante de l’ARN de ces zones isolées pour permettre le séquençage de l’ARN en aval.

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Protocole

L’étude a été approuvée pour utilisation par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de l’Indiana.

REMARQUE : Utilisez ce protocole avec du tissu néphrectomie rénale (jusqu’à 2 cm dans les dimensions X et Y) conservé dans le composé de la température optimale de coupe (OCT) et stocké à -80 °C. Effectuez tous les travaux d’une manière qui limite la contamination par l’ARN, utilisez des gants jetables propres et un masque facial. Assurer la propreté de toutes les surfaces. L’équipement pour lequel ce protocole a été optimisé est un système de microdissection laser doté d’un laser UV pulsé.

1. Cryosection

1. Exposer 1,2 μm LMD PPS-membrane (poly(p-phenylene sulfure) glisse à la lumière UV (dans une culture tissulaire capuchon d’écoulement laminaire) pendant 30 minutes, immédiatement avant la cryosection. Rangez les glissières à température ambiante pour une adhérence optimale des tissus.
2. Laisser refroidir le cryostat à -20 °C. Nettoyez les surfaces de travail et installez une nouvelle lame de coupe.
3. Placez une petite boîte à glissière (nettoyée avec la solution de décontamination de surface RNase) à l’intérieur de la chambre cryostat pour stocker les glissières avec du tissu fraîchement coupé.
4. Adhérez l’échantillon en OCT à un porte-tissus et laissez-le équilibrer pendant quelques minutes pour atteindre la température de la chambre et renforcer l’adhérence entre le bloc OCT et le support. Faciliter le processus à l’aide d’un extracteur de chaleur.
5. Coupez l’échantillon à une épaisseur de 12 μm et fixez-le à la diapositive LMD spécialisée, à l’aide de l’adaptateur de diapositives. Chaque diapositive contient une section de néphrectomie par toboggan ou jusqu’à deux sections de biopsie rénale par diapositive. Rangez les glissières à -80 °C à l’aide d’une cartouche de dessiccant et à l’intérieur d’un sac en plastique bien fermé pour éviter que l’excès d’humidité ne s’accumule à l’intérieur de la boîte à glissière.
6. Étiquetez chaque diapositive avec un iD de spécimen, une date et un numéro de diapositive.
7. Utilisez les diapositives avec des spécimens dans les 10 jours suivant la date initiale de cryosection.

2. Microdissection laser

1. Immédiatement avant la coloration, préparer le mélange anticorps (Ab-Mix) en 10% BSA en PBS sans RNase en ajoutant ce qui suit: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL d’anticorps tamm-horsfall protein (THP) directement conjugués à Alexa Fluor 546, 3,3 μL d’inhibiteur de la RNase et 89,2 μL de 10 % de BSA en PBS (pour atteindre un volume de 100 μL).
   REMARQUE : Des anticorps alternatifs peuvent être utilisés à la place de l’anticorps THP. Par exemple, 2 μL d’anticorps mégalin/LRP2, directement conjugués à Alexa Fluor 568, peuvent être utilisés pour étiqueter le tubule proximal. L’Ab-Mix contient des anticorps LRP2 ou THP (pour visualiser les tubules proximaux ou les membres ascendants épais, respectivement). D’autres anticorps peuvent être validés en fonction des besoins de l’utilisateur.
2. Laver la glissade dans le froid glacial (-20 °C) 100 % d’acétone pendant 1 min et la déplacer dans la chambre d’humidité.
3. Laver le haut de la diapositive avec du PBS sans RNase pendant 30 s. Répéter.
4. Lavez le haut de la diapositive avec 10% BSA en PBS sans RNase pendant 30 s. Répétez.
5. Appliquer l’Ab-Mix pendant 5 min.
6. Lavez le haut de la diapositive avec 10% BSA en PBS sans RNase pendant 30 s. Répétez.
7. Séchez la glissière pendant 5 min et chargez-la sur la plate-forme de coupe de microdissection laser.
8. Installez les tubes de collecte (tubes de microcentrifugeuses autoclavés de 0,5 mL) appropriés pour le travail pcr, contenant 50 μL de tampon d’extraction du kit d’isolation arn.
9. Procédez avec LMD. Terminez chaque session LMD dans un délai maximum de 2 heures.
   1. Recueillir des images d’immunofluorescence avant et après la LMD, à l’aide de la caméra microscope pour valider la dissection pour la variabilité entre opérateurs ainsi qu’à des fins archivistiques, formation et évaluation de la qualité du protocole effectué. Afin d’obtenir 0,5 à 1 ng d’ARN, un minimum de 500 000 μm² est nécessaire. Cela nécessite souvent l’utilisation de sections jusqu’à 8 x 12 μm d’épaisseur pour obtenir une quantité suffisante de matériaux pour tous les sous-segments d’intérêt.
   2. Identifiez les régions d’intérêt en les soudant, en les morphologie et en les acciseant à l’aide d’une puissance laser supérieure à 40.
      REMARQUE : Voici les critères de dissection. Le tubule proximal est défini par l’étiquetage FITC-Phalloidin et LRP2. Le membre ascendant épais est défini par l’étiquetage THP. Le conduit de collecte est défini par la morphologie nucléaire (DAPI) et l’absence d’autres taches. Le glomerulus est défini par fitc-phalloidin et morphologie. L’interstitium est défini comme la zone entre les tubules tachés.
10. Obtenez une signature d’expression transversale en vrac en apposant deux sections de 12 μm sur une diapositive LMD et en disséquant les sections entières en tampon d’extraction.
11. À la fin du processus LMD, fermez les tubes de microcentrifugeuse de collecte et faites-le glisser vigoureusement pour vous assurer que le contenu se déplaçait du bouchon vers le bas du tube.
12. Centrifuger les tubes à 3 000 x g pendant 30 s.
13. Incuber les tubes dans un bain d’eau de 42 °C pendant 30 min.
14. Centrifuger les tubes à 3 000 x g pendant 2 min.
15. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 0,5 mL et le conserver en -80 °C.

3. Isolement d’ARN

REMARQUE : Pour ce protocole d’isolement de l’ARN, nous avons adapté un protocole à partir d’une trousse commerciale d’isolement de l’ARN. Le protocole du fabricant a été modifié pour répondre aux exigences de contrôle de la qualité fixées pour le projet.

1. Ajouter 250 μL de tampon conditionné (CB) à chaque colonne de purification de l’ARN (PC) et incuber pendant 5 min à température ambiante.
2. Centrifugeuse tous les PC pendant 1 min à 16.000 x g.
3. Ajouter 50 μL d’éthanol à 70 % (fourni dans le kit) dans les tubes avec des échantillons de tissus. Bien mélanger les échantillons en faisant des tuyaux de haut en bas. Ne pas vortex. Ne pas centrifugeuse.
4. Transférer le mélange dans des PC conditionnés et une centrifugeuse pendant 2 min à 100 x g (pour lier l’ARN), suivre rapidement avec centrifugation pendant 30 s à 16.000 x g (pour enlever le flux à travers). Répétez cette étape si plus d’un tube avec des échantillons de tissus sont disponibles pour un sous-segment donné.
5. Ajouter 100 μL de Wash Buffer 1 (WB1) dans les PC et la centrifugeuse pendant 1 minute à 8 000 x g.
6. Préparer 40 μL de DNase par échantillon (Ajouter 5 μL de DNase à 35 μL de tampon RDD). Ajouter ensuite 40 μL du mélange directement sur la membrane du PC et incuber pendant 15 min à température ambiante.
7. Ajouter 40 μL de WB1 sur la membrane du PC et une centrifugeuse de 15 s à 8 000 x g.
8. Ajouter 100 μL de Wash Buffer 2 (WB2) sur la membrane du PC, et centrifugeuse pendant 1 min à 8 000 x g.
9. Ajouter 100 μL de WB2 sur la membrane du PC, centrifugeuse pendant 2 min à 16 000 x g,suivre immédiatement par centrifugation pendant 1 min à 16 000 x g.
10. Transférez le PC dans un nouveau tube de 0,5 mL.
11. Ajouter 12 μL d’Elution Buffer (EB) sur la membrane et incuber pendant 7 min à température ambiante. Ainsi, le volume final de tous les échantillons de tissus disséqués mis en commun est de 12 μL par sous-segment.
12. Centrifuger les échantillons pendant 1 min à 1000 x g, puis pendant 2 min à 16 000 x g.
13. Transférer 2 μL dans un tube frais pour l’analyse bioanalyse (pour éviter les événements de gel-dégel).
14. Conserver tous les tubes en -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour un traitement ultérieur.

4. Séquençage de l’ARN

1. Évaluer chaque échantillon, destiné au séquençage, pour la qualité à l’aide d’un bioanalyseur commercial et d’une puce dédiée à la mesure de petites quantités d’ARN.
2. Il faut suivre les paramètres de contrôle de la qualité (QC) avant la préparation et le séquençage de la bibliothèque : quantité d’ARN supérieure à 4 ng en vrac et supérieure à 0,5 à 1 ng pour chaque sous-segment; Le pourcentage de transcriptions de plus de 200 nucléotides (DV200) doit être supérieur à 25 % pour les échantillons de LMD (optimal > 75 %).
3. Effectuer la préparation de la bibliothèque avec une trousse commerciale de préparation de la bibliothèque cDNA destinée à de petites quantités d’ARN dégradé. Pour le kit commercial énuméré dans le supplément, nous vous suggérons d’utiliser l’option 2, qui nécessite un minimum de DV200 de 25% et pas de fragmentation. Certaines technologies de séquençage peuvent nécessiter des seuils de DV200 minimaux plus élevés, tels que 30^{% 7}.
4. Ajoutez des adaptateurs et des index cDNA.
5. Purifiez les bibliothèques RNAseq à l’aide de la technologie des perles magnétiques.
6. Épuisez l’ADND ribosomal à l’aide d’un kit commercial d’enlèvement rRNA avant l’étape d’amplification de la bibliothèque RNAseq.
7. Purifier la bibliothèque finale du RNAseq à l’aide de la technologie des perles magnétiques à une concentration de bibliothèque cDNA de 2 ng/μL.
8. Effectuer le séquençage de l’ARN de 75 pb sur un système de séquençage commercial avec 30 millions de lecture/échantillon pour le vrac et 100 millions de lecture/échantillon pour les sections sous-segmentales.
9. Utilisez un ARN de référence (25 μg) à chaque course de séquençage pour permettre le contrôle de l’effet de lot. La concentration initiale de notre ARN de référence est de 1 μg/μL, tandis que la concentration finale utilisée dans le séquençage est de 25 ng/μL. Exécutez l’ARN de référence comme un échantillon distinct pendant la préparation de la bibliothèque et courez avec tous les spécimens de LMD à chaque fois.
10. Effectuer une analyse des données à l’aide de l’application FastQC pour évaluer la qualité des lectures séquençantes, intergéniques et mitochondriales et pour déterminer les lectures attribuées à un gène.
11. Utilisez Integrative Genomics Viewer (IGV) pour l’alignement et edgeR/rbamtools pour les mesures d’expression de transcription.
12. Retirez les échantillons avec moins de 100 000 lectures. Quantile normalise les lectures brutes dans l’ensemble de données après le filtrage des gènes faiblement exprimés à un seuil défini par l’utilisateur.
13. Quantifier l’expression comme un rapport entre le sous-segment d’intérêt et la moyenne de tous les autres sous-segments et log2-transform. L’expression relative du même gène peut être comparée entre les sous-segments et les échantillons; cependant, il n’est pas idéal de comparer l’expression relative entre deux gènes différents en raison de différences potentielles de dégradation entre les gènes et les espèces d’ARN.
14. Effectuer une analyse d’enrichissement pour comparer l’expression des gènes pour un ensemble de fabricants spécifiques à chaque sous-segment du néphron, tandis que les échantillons d’ARN de référence sont comparés entre lots. Un effet de lot dans un écart type de l’expression moyenne avec valeur R > 0,9 est considéré comme acceptable. Une normalisation supplémentaire est nécessaire pour un score d’effet de lot plus élevé. Toute course qui s’écarte de l’effet de lot accepté peut être signalée. Le Q30 devrait être supérieur à >90% pour chaque course de séquençage.

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Résultats

Échantillons

Nous présentons des données provenant de neuf néphrectomies de référence (3 spécimens obtenus à l’Université de l’Indiana et 6 spécimens obtenus dans le cadre du Kidney Precision Medicine Project), en utilisant le protocole de coloration par fluorescence rapide pour isoler les segments de néphron rénal et les zones interstitielles. Les sections utilisées dans ce processus ont été obtenues des donneurs de rein décédés ou des nephrectomies non ...

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Discussion

La transcriptomics basée sur le LMD est une technologie utile qui ancre l’expression des gènes dans des zones spécifiques du tissu. La base de cette technologie et son application potentielle dans le rein a été décrite précédemment^8. Toutefois, l’optimisation, la modernisation et la rationalisation de la dissection basée sur la fluorescence visant spécifiquement à une dissection de haute précision pour le séquençage de l’ARN en aval sont moins omniprésentes. Parce que cette m?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody	Abcam	ab76969	Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
Microscope camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R&D Systems	AF5144	Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583