Un modèle préclinique d’impact cortical contrôlé pour l’hémorragie traumatique, la contusion et la neuroinflammation

Résumé

L’hémorragie intraparenchymateuse et la neuroinflammation accompagnées d’une contusion cérébrale peuvent déclencher de graves lésions cérébrales secondaires. Ce protocole détaille un modèle d’impact cortical contrôlé (ICC) chez la souris, permettant aux chercheurs d’étudier l’hémorragie, la contusion et les réponses immunitaires post-traumatiques, et d’explorer des thérapies potentielles.

Résumé

La contusion cérébrale est un problème médical grave qui touche des millions de personnes dans le monde chaque année. Il est urgent de comprendre le mécanisme physiopathologique et de développer une stratégie thérapeutique efficace pour ce trouble neurologique dévastateur. L’hémorragie intraparenchymateuse et la réponse inflammatoire post-traumatique induites par l’impact physique initial peuvent aggraver l’activation des microglies/macrophages et la neuroinflammation, qui aggravent par la suite la pathologie cérébrale. Nous fournissons ici un protocole d’impact cortical contrôlé (CCI) qui peut reproduire la contusion corticale expérimentale chez la souris en utilisant un système d’impacteur pneumatique pour délivrer une force mécanique d’une amplitude et d’une vitesse contrôlables sur la surface durale. Ce modèle préclinique permet aux chercheurs d’induire une contusion cérébrale focale modérément sévère chez la souris et d’étudier un large éventail de progressions pathologiques post-traumatiques, notamment la contusion hémorragique, l’activation de la microglie et des macrophages, la toxicité du fer, les lésions axonales, ainsi que les déficits neurocomportementaux à court et à long terme. Le protocole actuel peut être utile pour explorer les effets à long terme et les interventions potentielles pour la contusion cérébrale.

Introduction

La contusion cérébrale est une forme de traumatisme crânien qui figure parmi les problèmes de santé les plus meurtriers de la société moderne¹. Il est principalement causé par des événements accidentels tels qu’un accident de la circulation qui entraîne des forces externes appliquant de l’énergie mécanique à la tête. Les lésions cérébrales traumatiques touchent environ 3,5 millions de personnes et représentent 30 % de tous les décès liés à des blessures aiguës aux États-Unis chaque année². Les patients qui survivent à une contusion cérébrale souffrent souvent de conséquences à long terme, notamment une faiblesse motrice focale, un dysfonctionnement sensoriel et une maladie mentale¹.

La lésion primaire de la contusion cérébrale est induite par des facteurs mécaniques, notamment les forces d’étirement et de déchirure, entraînant une déformation immédiate de la structure parenchymateuse et la mort focale des cellules du SNC³. La contusion hémorragique est un terme général pour les hémorragies cérébrales dues à une déchirure vasculaire au site d’un traumatisme crânien⁴. Plus précisément, l’hémorragie intraparenchymateuse se produit immédiatement après une contusion cérébrale entraînant une formation retardée d’un hématome. Dans l’hématome, l’hémoglobine et le fer libre libérés par les globules rouges lysés peuvent déclencher une toxicité liée au sang ^5,6 qui provoque une hernie, un œdème cérébral et une élévation de la pression intracrânienne ^5,6. Les fonctions collaboratives des neurones (axones), de la glie, des vaisseaux sanguins et des tissus de soutien sont également compromises par l’effet de masse de l’hématome⁷. De plus, une neuroinflammation persistante et diffuse avec neurodégénérescence progressive se poursuit pendant des mois et provoque des dommages secondaires dans le cerveau⁸.

L’activation de la microglie est l’une des nombreuses caractéristiques pathologiques importantes de la contusion cérébrale ^9,10. Après avoir détecté les motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP) et les fuites de sang dans les tissus lésés, la microglie activée déclenche une neuroinflammation qui aggrave les lésions cérébrales secondaires¹¹. De plus, le chimioattractant libéré par la microglie favorise l’infiltration des cellules immunitaires périphériques dans le territoire traumatique, entraînant la production d’espèces réactives de l’oxygène et de cytokines pro-inflammatoires. Cela crée un environnement pro-inflammatoire auto-entretenu qui déclenche des lésions cérébrales progressives ^9,12. Pendant ce temps, la microglie avec un phénotype activé alternativement peut contribuer à la restauration homéostatique des tissus et à la réparation du cerveau en éliminant les débris des tissus blessés¹³. La prévention de la neuroinflammation secondaire en réduisant les réponses immunitaires microgliales préjudiciables s’est avérée particulièrement utile pour favoriser la récupération cérébrale d’une contusion cérébrale 3,9,10,12.

Plusieurs modèles précliniques ont été développés pour étudier les lésions cérébrales traumatiques, notamment le modèle de perte de poids, le modèle de percussion de fluide latéral et le modèle d’onde de choc^14,15. Cependant, ces modèles ont chacun leurs faiblesses, notamment un taux de mortalité élevé pendant la procédure, une faible reproductibilité des résultats histologiques et une grande variabilité des lésions infligées entre les laboratoires^16,17. En comparaison, le modèle d’impact cortical contrôlé (ICC) est plus adéquat pour étudier la contusion cérébrale focale en raison de son contrôle précis et de sa haute reproductibilité 14,15,18,19.

De plus, en manipulant les paramètres de déformation biomécanique tels que la vitesse et la profondeur de l’impact, la gravité des dommages induits peut être contrôlée pour produire une large gamme d’amplitudes de blessures, ce qui permet aux chercheurs d’imiter différents niveaux de déficience souvent observés chez les patients¹⁷. Le modèle préclinique de l’ICC a été développé pour la première fois en 1896²⁰. Depuis lors, le CCI a été le modèle applicable le plus large à être modifié pour être utilisé chez les primates²¹, les porcs^22, les moutons²³, les rats²⁴ et les souris²⁵. L’ensemble de ces caractéristiques fait de l’ICC l’un des modèles expérimentaux de contusion cérébrale les plus appropriés²⁶.

Notre laboratoire utilise un système d’impact pneumatique CCI disponible dans le commerce et des paramètres de déformation biomécanique testés pour produire une contusion cérébrale focale modérément sévère qui territorialise les zones corticales sensorielles et motrices primaires sans endommager l’hippocampe^27,28. Nous et d’autres avons démontré que cette procédure CCI peut être utilisée pour étudier les caractéristiques cliniques de la contusion cérébrale humaine, y compris la perte de tissu cérébral, les lésions neuronales, l’hémorragie intraparenchymateuse, la neuroinflammation et la déficience sensorimotrice 24,25,27,28,29,30. Ici, nous détaillons un protocole standard pour effectuer des CCI chez la souris qui permet de poser des questions concernant la perte de myéline induite par la CCI, le dépôt de fer, l’inflammation du SNC, la toxicité hémorragique et les réponses des microglies/macrophages à la suite d’une contusion cérébrale focale.

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Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été menées sous l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital général Cheng Hsin et de la Faculté de médecine de l’Université nationale de Taiwan. Des souris mâles de type sauvage C57BL/6 âgées de huit à dix semaines ont été utilisées dans ce protocole.

1. Induction de l’anesthésie

1. Anesthésie la souris avec ~4 % d’isoflurane mélangé à de l’air ambiant à ~0,2 L/min dans une chambre à induction connectée au vaporisateur d’isoflurane.
2. Assurez-vous que le schéma respiratoire est fluide. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en confirmant l’absence de réflexe de pincement des orteils chez l’animal.

2. Préparation préopératoire

1. Rasez la tête de la souris avec une tondeuse électrique dans le sens caudal à rostral. Ne coupez pas les moustaches de la souris.
   REMARQUE : La perte de moustaches peut influencer la précision des résultats des tests comportementaux ultérieurs.
2. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique. Insérez soigneusement les barres auriculaires dans les conduits auditifs. Assurez-vous que la tête de la souris est stabilisée de manière égale par les deux barres d’oreille.
3. Rentrez le cône nasal et maintenez l’anesthésie à 1 % - 2 % d’isoflurane pendant toute la durée de la chirurgie.
4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie. Gardez l’animal sur un coussin chauffant pour maintenir une température corporelle de 37 °C.
5. Désinfectez le crâne rasé avec de la bétadine suivie d’alcool à 70 % à l’aide de cotons-tiges stériles. Répétez l’opération trois fois.

3. Chirurgie CCI

1. Administrer 100 μL de bupivacaïne (0,25 %) par voie sous-cutanée à l’aide d’une aiguille à insuline de 31 g avant l’incision. Massez doucement le site d’injection pour une meilleure absorption.
   REMARQUE : Cet anesthésique local soulage la douleur directement sur le site de la chirurgie.
2. Faites une incision longitudinale (~1,5 cm) le long de la ligne médiane du cuir chevelu avec un scalpel ou des ciseaux. Utilisez un hémostat pour maintenir la peau sur le côté droit et laissez le crâne exposé sécher pendant 1 min. Utilisez un coton-tige stérile pour nettoyer tout résidu de sang et de tissus sur le crâne.
3. Vérifiez que la tête de la souris est de niveau dans le plan horizontal.
   1. Identifiez les repères anatomiques Bregma et Lambda et marquez les deux emplacements avec un marqueur chirurgical stérile/crayon.
   2. Assurez-vous que la tête de l’animal est de niveau dans la direction rostrale-caudale. Pour ce faire, mesurez les coordonnées Z de Bregma et de Lambda à l’aide d’une aiguille à insuline de 31 G fixée au cadre stéréotaxique.
      REMARQUE : Ajustez la barre d’oreille verticalement si nécessaire.
   3. Effectuez le positionnement horizontal de la tête de l’animal en suivant la même procédure de vérification des coordonnées Z sur la ligne médiane ainsi que de deux emplacements correspondants sur les côtés gauche et droit de la ligne médiane et ajustez les barres d’oreille si nécessaire.
      REMARQUE : Un placement plat et stable de la tête de l’animal est crucial pour la reproductibilité et la fiabilité du modèle CCI.
4. Utilisez la même aiguille à insuline de 31 G pour identifier le site de la craniectomie. Réglez l’origine XY sur Bregma et déplacez latéralement l’aiguille de 3 mm vers la droite. Marquez cette position comme le site de la craniectomie et tracez un cercle de 4 mm de diamètre sur le crâne avec un marqueur chirurgical stérile ou un crayon.
5. À l’aide d’une micro-perceuse à grande vitesse munie d’un trépan (4 mm de diamètre), coupez le long du cercle délimité par un crayon pour créer un trou ouvert de 4 mm de diamètre. Utilisez un réglage de vitesse de 20 000 tr/min. Évitez d’appliquer une pression excessive.
   REMARQUE : Effectuez cette étape rapidement (généralement dans les 30 s à 1 min) pour éviter tout dommage thermique au cerveau. L’application d’une pression excessive pendant le forage peut entraîner une pénétration accidentelle qui pourrait comprimer et blesser la surface du cerveau.
6. Retirez soigneusement le rabat osseux à l’aide d’une pince à épiler et rangez-le temporairement dans une solution saline normale glacée. Rincez doucement le trou avec une solution saline normale avant d’appliquer une pression sur la surface du cerveau avec la pointe du coton-tige pour arrêter le saignement.
7. Réglez l’extrémité arrondie de l’impacteur de 2,5 mm de diamètre sur l’appareil CCI à un angle de 22,5°. Placez la pointe de l’impact sur la surface de la durale. Réglez les paramètres d’impact sur le boîtier de commande à une vitesse de 4 m/s et une profondeur de déformation de 2 mm. Rétractez l’embout métallique.
   REMARQUE : La mise à zéro de la pointe alors qu’elle est légèrement et statiquement appuyée contre la surface durale en position de course complète améliore la précision du point zéro et la reproductibilité du niveau de blessure.
8. Déchargez le piston pour générer une impaction sur le cerveau. Placez un coton-tige stérile sur la zone blessée pour arrêter le saignement.
9. Replacez le rabat osseux dans le cerveau de la souris et fixez-le avec du ciment dentaire. Fermez le cuir chevelu avec un adhésif pour tissus (par exemple, 3M Vetbond).

4. Récupération postopératoire

1. Placez la souris dans une cage de récupération propre avec de la litière sous la lampe chauffante jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement.
2. Fournir de la nourriture humidifiée et administrer par voie sous-cutanée du kétoprofène (5 mg/kg) pendant deux jours consécutifs après la chirurgie.
3. Effectuer les procédures ci-dessus, à l’exception des étapes 3.7 et 3.8 pour les animaux témoins fictifs.

5. Euthanasie de souris

1. Euthanasier les souris le jour de l’étude par surdosage d’isoflurane puis décapitation.
   REMARQUE : Plusieurs stratégies peuvent être utilisées pour euthanasier les animaux de laboratoire avant le prélèvement de l’échantillon.
2. Prélever des échantillons de cerveau pour une analyse histologique.

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Résultats

Illustration de la mise en place stéréotaxique et de la procédure de craniotomie.

Le modèle CCI est connu pour sa stabilité et sa reproductibilité dans la production de lésions allant de légères à graves¹⁸. Une technique stéréotaxique et une craniotomie appropriées sont des déterminants majeurs dans la production de lésions cérébrales stables et reproductibles induites par l’ICC (...

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Discussion

Le protocole CCI produit des lésions mécaniques cérébrales hautement reproductibles pour la recherche sur les contusions cérébrales. Les étapes suivantes sont cruciales pour générer des lésions cérébrales constantes chez les animaux utilisant ce protocole CCI.

Tout d’abord, la tête de la souris doit être montée de manière stable sur le cadre stéréotaxique et les repères anatomiques Bregma et Lambda doivent toujours être dans le même plan...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4mm Short Trephine Drill	Salvin Dental Specialties, Inc.	TREPH-SHORT-4
anti-Iba1 antibody	Wako chemicals	#019-19741
anti-Ly76 antibody	abcam	ab91113
carboxylate cement	3M	70201136010
cortical contusion injury impactor	Custom Design & Fabrication, Inc.	S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3	CCI device (S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3)
cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042
DAB staining kit	Vector	SK-4105
goat anti-rabbit IgG secondary antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034
goat anti-rat IgG secondary antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11007
Mayer's Hematoxylin	ScyTek	HMM500
tweezers	fine science tools	11252-20 NO. 5
isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.
Bupivacaine 0.25%	Hospira
lithium carbonate	Sigma-Aldrich	62470
steriotexic frame	stoelting
scissors	fine science tools	14068-12
solvent blue 38	Sigma-Aldrich	S3382