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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une technique chronique d’implantation de fenêtre crânienne qui peut être employée pour l’imagerie longitudinale des structures neuro-glio-vasculaires, des interactions, et de la fonction dans les conditions saines et malades. Il sert d’alternative complémentaire à l’approche d’imagerie transcrânienne qui, bien que souvent préférée, possède certaines limites critiques.

Résumé

Le système nerveux central (SNC) est régulé par un jeu complexe de cellules neuronales, gliales, stromales et vasculaires qui facilitent sa fonction appropriée. Bien que l’étude de ces cellules dans l’isolement in vitro ou ensemble ex vivo fournit des informations physiologiques utiles; les caractéristiques saillantes de la physiologie des cellules neuronales seront manquées dans de tels contextes. Par conséquent, il est nécessaire d’étudier les cellules neuronales dans leur environnement in vivo natif. Le protocole détaillé ici décrit l’imagerie répétitive in vivo à deux photons des cellules neuronales dans le cortex des rongeurs comme un outil pour visualiser et étudier des cellules spécifiques sur de longues périodes de temps d’heures à mois. Nous décrivons en détail l’utilisation de la vascularisation cérébrale grossièrement stable comme une carte grossière ou des dendrites fluorescentes étiquetées comme une belle carte de certaines régions du cerveau d’intérêt. En utilisant ces cartes comme clé visuelle, nous montrons comment les cellules neuronales peuvent être déplacées avec précision pour l’imagerie in vivo répétitive ultérieure. À l’aide d’exemples d’imagerie in vivo de microglies, de neurones et de cellules NG2+ étiquetées fluorescentement, ce protocole démontre la capacité de cette technique à permettre la visualisation répétitive de la dynamique cellulaire dans le même emplacement du cerveau sur de longues périodes de temps, ce qui peut aider à mieux comprendre les réponses structurelles et fonctionnelles de ces cellules en physiologie normale ou en suivant des insultes pathologiques. Si nécessaire, cette approche peut être couplée à l’imagerie fonctionnelle des cellules neuronales, par exemple, avec l’imagerie du calcium. Cette approche est particulièrement une technique puissante pour visualiser l’interaction physique entre les différents types de cellules du SNC in vivo lorsque des modèles de souris génétiques ou des colorants spécifiques avec des étiquettes fluorescentes distinctes pour étiqueter les cellules d’intérêt sont disponibles.

Introduction

Le système nerveux central (SNC) est régi par un jeu complexe d’interactions entre divers types de cellules résidentes, y compris les neurones, la glia et les cellules associées aux vaisseaux. Traditionnellement, les cellules neuronales ont été étudiées dans des cellules isolées, co-cultivées1,,2,3,4,5 (in vitro) ou des tissus cérébraux excisés (ex vivo)6,7,8,9,10 contextes. Cependant, il est nécessaire de mieux comprendre le comportement des cellules neuronales et les interactions dans l’environnement natif du cerveau intact in vivo. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de cartographie in vivo des régions d’intérêt et de ré-image précise de ces régions dans les futures sessions d’imagerie pour suivre les interactions complexes entre les différents types de cellules du SNC sur de longues périodes de temps.

Le développement d’approches d’imagerie in vivo a fourni des gains significatifs pour la bonne compréhension de la fonction neuronale11,12,13,14,15. Plus précisément, ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux approches traditionnelles in vitro et ex vivo. Tout d’abord, les systèmes d’imagerie in vivo ont des composants cellulaires et tissulaires physiologiquement pertinents tels que la vascularisation avec le répertoire complet des interactions cellulaires pour fournir une compréhension complète de la physiologie du réseau neuronal. Deuxièmement, les résultats récents suggèrent que lorsqu’ils sont retirés de leur environnement natif, certaines cellules neuronales (telles que les microglies) perdent des caractéristiques importantes de leur identité et donc la physiologie16,17 qui peuvent être préservées dans le cadre in vivo. Troisièmement, les systèmes d’imagerie in vivo offrent la possibilité d’étudier des études longitudinales stables de plusieurs semaines à plusieurs mois pour étudier les interactions cellulaires du SNC. Enfin, compte tenu des preuves croissantes des contributions du système immunitaire périphérique18,19 et du microbiome20,21 en physiologie du SNC, les systèmes in vivo fournissent une plate-forme pour interroger ces contributions et effets sur les cellules du SNC. Ainsi, les approches qui utilisent l’imagerie in vivo longitudinale pour étudier la physiologie neuro-immune et les interactions dans les états sains, blessés et malades sont un grand ajout complémentaire aux approches traditionnelles.

Dans ce protocole, nous décrivons une approche fiable de l’image de différents types de cellules dans le cerveau, y compris les microglies, les neurones et les cellules NG2+ comme exemples. Deux approches pour visualiser les cellules neuronales in vivo ont été développées : l’approche du crâne éclaircie et le crâne ouvert avec une approche crânienne de fenêtre. Bien que les approches minces de crâne soient en usage et sont préférées parce qu’elles surmontent certains des inconvénients de l’approche ouverte de crâne telle que l’activation de cellules gliales, la dynamique plus élevée-que-physiologique de la colonne vertébrale et l’utilisation des agents anti-inflammatoires22,23,24,25, approches de crâne amincie montrent également quelques inconvénients critiques. Tout d’abord, la procédure d’amincissement est une procédure très délicate que de nombreux chercheurs trouvent difficile à perfectionner surtout lorsque le ré-amincissement est nécessaire. C’est le cas parce qu’il est souvent difficile pour les expérimentateurs de s’assurer qu’ils ont éclairci le crâne à une profondeur d’environ 20 μm. Deuxièmement, pour des comparaisons adéquates entre les souris, l’amincissement devrait être identique et une variété de succès d’amincissement entre les séances d’imagerie ou les souris pourrait compliquer la visualisation des structures neuronales. Troisièmement, lorsqu’ils sont utilisés pour l’imagerie longitudinale, les animaux avec des crânes amincis ne peuvent être utilisés que pour un nombre limité de séances lorsque le ré-amincissement du crâne est utilisé. Forth, puisque certains du tissu osseux reste encore, la clarté dans la profondeur de l’imagerie pourrait être compromise à partir de l’approche du crâne éclaircie permettant une grande visualisation de plus superficielle, mais pas autant avec des régions plus profondes. À la lumière de cela, des structures cérébrales plus profondes comme l’hippocampe, ne peuvent pas être correctement photographiés avec l’approche du crâne éclaircie. Ces considérations soulèvent la nécessité d’approches alternatives et complémentaires qui pourraient surmonter ces préoccupations.

Alternative à l’approche du crâne éclaircie, l’approche d’implantation de la fenêtre du crâne ouverte utilise une procédure dans laquelle le crâne est remplacé par un couvercle en verre optiquement clair. Cela permet un nombre quasi illimité de séances d’imagerie. En outre, étant donné le remplacement du crâne par le couvercle en verre, cette méthode permet une fenêtre de visualisation claire des cellules du cerveau marquées fluorescentement pendant de longues périodes de temps d’heures à des mois et, par conséquent, peut être utilisé pour étudier l’activité cellulaire et les interactions qui sont pertinentes pour la physiologie, le vieillissement et la pathologie.

Dans l’ensemble, nous détaillons les étapes qui peuvent être suivies pour implanter des fenêtres crâniennes chroniques à travers une craniotomie stéréotaxique qui permet l’imagerie in vivo des régions cérébrales d’intérêt. Nous décrivons également comment la vascularisation cérébrale grossièrement stable ou les dendrites fluorescentes étiquetées pourraient être utilisées pour générer une carte grossière ou fine, respectivement des régions d’intérêt du cerveau. Cette approche peut ensuite être utilisée pour l’imagerie répétée sur plusieurs séances. L’importance de cette technique réside donc dans sa capacité à imager les changements à long terme ou la stase dans les éléments du cerveau, y compris l’arrangement, la morphologie et les interactions des différents types cellulaires.

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Protocole

Toutes les étapes sont conformes aux lignes directrices établies et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie.

1. Préparation de souris pour l’implantation de fenêtre crânienne

REMARQUE : Diverses lignes de souris transgéniques avec des étiquettes fluorescentes conviennent à l’imagerie.

  1. Utilisez CX3CR1GFP/+ souris26 pour visualiser les microglies in vivo. Typiquement, les souris juvéniles à jeunes adultes de 4 à 10 semaines qui pèsent 17-25 g sont utilisées.
    NOTE : Bien que, cette approche soit même appropriée pour les souris pré-sevrées, la nécessité de retourner les souris dans leur cage avec leurs mères pour l’alimentation, peut compliquer la récupération si la mère ne prend pas soin adéquate des chiots après la chirurgie. Par conséquent, l’utilisation de souris après le sevrage est recommandée.
  2. Anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane (5% de flux d’oxygène pour l’induction pendant 1 min) dans une chambre anesthésique. Vérifiez que la souris ne montre aucun mouvement ou des réactions de contraction aux pincements d’orteil et/ou de queue. Sortir la souris de la chambre et, en plein air, raser les cheveux sur la tête entre les oreilles d’environ le niveau des yeux jusqu’au sommet de la région du cou à l’aide d’un coupe-cheveux.
    REMARQUE : La concentration d’isoflurane utilisée dépendrait de la taille de la chambre d’induction. Par conséquent, pour les chambres plus petites, 3-4% isoflurane peut être utilisé pour induire efficacement l’anesthésie tandis que les grandes chambres nécessiteront jusqu’à 5%.
  3. Déplacez la souris vers le cône nasal de la station de chirurgie stéréotaxique pour l’anesthésie (1,5-2% pour l’entretien de la chirurgie), stabilisez sa tête à l’aide de barres d’oreille, et maintenez la souris sur un coussin chauffant pour garder la température corporelle chaude.
  4. Lubrifier les deux yeux avec de l’onguent pour les yeux. Injecter 100 μL de bupivicaine à 0,25 % (pour fournir une analgésie locale à la souris qui durera de 8 à 12 h) et 100 μL de 4 mg/mL dexaméthasone (pour réduire l’inflammation qui peut résulter de la procédure chirurgicale) sous-cutanéement au site d’incision. Laissez la souris s’asseoir pendant au moins 5 min avant de passer à l’étape suivante.
  5. Nettoyez la tête rasée avec trois écouvillons alternatifs de bétadine et 70% d’alcool. Faire une incision du cuir chevelu de ligne médiane à l’aide de lame chirurgicale ou de ciseaux s’étendant de l’arrière de la région du crâne entre les oreilles à la zone frontale entre les yeux. La peau restante est coupée pour exposer le crâne.
  6. Nettoyez le tissu conjonctif situé entre le cuir chevelu et le crâne sous-jacent avec 3% de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et localisez la zone du cerveau à imager avec des coordonnées stéréotaxiques.
    REMARQUE : Il y a souvent des saignements (étape 1.5) de l’incision sur la surface du crâne. Ce saignement se résout habituellement par lui-même dans les 3-5 min. Nettoyage avec le peroxyde aide. Le traitement préalable de la bupivacaine (étape 1.4) est également noté pour limiter la quantité de saignement pendant cette période.

2. Chirurgie d’implantation de fenêtre crânienne de souris

  1. Percer une ouverture circulaire d’environ 4 mm dans le crâne à l’aide d’un morceau de perceuse dentaire (diamètre de pointe de 0,7 mm) et enlever soigneusement cette partie du crâne à l’aide de forceps pointus. Pour l’imagerie du cortex somatosensoriel des souris de 6 à 8 semaines, localisez le centre de la craniotomy à -2,5 postérieur et ± 2,0 latérale à bregma. Pendant le forage, humidifiez régulièrement le crâne avec des salines stériles et des cotons-tiges pour refroidir le cerveau, nettoyer les débris osseux et adoucir l’os du crâne pour un éventuel déplacement.
    REMARQUE : Les coordonnées de la craniotomy varieraient selon la région d’intérêt et l’âge des souris.
  2. Une fois le crâne enlevé, placez soigneusement un petit verre de couverture (taille #0 à 0,1 ± 0,02 mm d’épaisseur) humidifié avec de la solution saline dans la craniotomie. Sécher l’excès de solution saline à l’aide d’un lingettes stériles.
  3. À l’aide d’un applicateur pointu (comme une pointe de pipette ou l’extrémité pointue d’un bâton de coton-tige en bois cassé), appliquez de la colle de cyanoacrylate autour de la fenêtre et laissez-la s’attacher au cerveau et au crâne. Appliquer la colle d’amorce sur le reste du crâne et la guérir avec une lumière de durcissement pendant 20-40 s. Préparer un puits autour de la fenêtre avec la colle finale et guérir avec une lumière de durcissement pour 20-40 s.
  4. Collez une petite plaque de tête sur le crâne sur l’hémisphère contralatéral de la craniotomie d’abord avec la colle d’amorce comme amorce, puis avec la colle finale. Guérir les deux avec la lumière de durcissement pour 20-40 s chacun.
    REMARQUE : Les sutures ne sont pas nécessaires si le crâne est totalement recouvert de colle pendant cette procédure.

3. Soins post-opéro-opéro-opéraient

  1. Permettre à la souris de se réveiller en l’absence d’anesthésie (la récupération effectuée sur un coussin chauffant raccourcit le temps de récupération) et le retourner à sa cage à la maison une fois complètement éveillé. Injectez une dose sous-cutanée de buprénorphine SR (0,5 mg/kg) comme analgésie postopératoire suffisante pour 72 h.
  2. Pour faciliter une récupération saine de la chirurgie, fournir à la souris un aliment doux supplémentaire, qui peut être sous la forme de chow solide régulier dans l’eau pour adoucir le chow ou la nourriture sous la forme d’un gel.
    REMARQUE : Une fourniture ponctuelle de la nourriture molle immédiatement après la chirurgie est suffisante.
  3. Surveillez la souris quotidiennement pour la santé et la récupération appropriée pour les 72 premiers h de la procédure de chirurgie. Ensuite, effectuer l’imagerie dès 2 semaines de la chirurgie d’implantation de fenêtre.
    NOTE : Si elles sont bien faites, les souris récupèrent bien montrant des comportements ambulatoires normaux, une exploration suffisante de la cage, une bonne hydratation, un gain de poids stable et des interactions étendues avec d’autres souris dans la cage et d’autres articles dans la cage. Les souris montrant la léthargie, la déshydratation et une perte de poids supérieure à 10% après la chirurgie sont euthanasiés et retirés de l’étude.

4. Cartographie du cerveau à deux photons pour l’imagerie initiale

  1. Anesthésiez la souris (Isoflurane, induction de 5 % et 1,5 % d’entretien). Stabiliser la tête à l’aide de vis pour monter la plaque d’immatriculation au stade du microscope à deux photons, en étant maintenu sur une plaque chauffante à 35 °C. Injecter intraperitononeally 100 μL de colorant des vaisseaux sanguins comme la Rhodamine B (2 mg/mL).
    NOTE : L’imagerie pourrait également être faite chez des souris éveillées sans anesthésie. Cependant, des études récentes indiquent que l’anesthésie affecte la dynamique de surveillance microgliale27,28,29 et que la fixation de la tête pour deux images photons chez les souris éveillées augmente le stress, même pendant l’imagerie chronique pendant au moins 25 jours (voir Juvzewski et al., 2020)30.
  2. Nettoyez doucement la surface de la fenêtre crânienne à l’aide d’un coton-tige tamponné dans 70 % d’éthanol. Mettez quelques gouttes d’eau ou de saline sur la fenêtre crânienne et abaissez la lentille objective dans la solution puisque l’objectif est une lentille d’immersion.
  3. Dessinez à la main une carte grossière pour désigner les principaux repères des vaisseaux sanguins dans un carnet de laboratoire tout en regardant à travers l’oculaire par épiflorescence. Utilisez ce dessin pour identifier les régions spécifiques au cours de deux imagerie photon. Vous pouvez également prendre des photos des vaisseaux sanguins soit par l’intermédiaire d’une caméra installée au microscope, soit par un appareil photo ou un téléphone portatif.
    REMARQUE : Ces images dessinées à la main et ces images doivent faciliter la révision des mêmes vastes régions au microscope avant deux images de photons. Il ne s’agit pas d’une cartographie d’image précise.
  4. Sous deux images photon, recueillir des images de cellules et de vaisseaux fluorescents au besoin. Prenez des notes précises avec les coordonnées appropriées pour vous assurer que les régions précises peuvent être revisitées pour l’imagerie ultérieure. Recueillir plusieurs champs de vue dans cette session d’imagerie initiale, par exemple acquérir des images z-stack tous les 1-2 μm à travers un volume de tissu.
    REMARQUE : Lors de la collecte d’images par deux photons, les repères des vaisseaux sanguins sont utilisés pour la cartographie grossière. Si une cartographie fine est nécessaire, des dendrites étiquetées YFP des souris Thy1-YFP31 sont utilisées.
    1. Utilisez ces paramètres recommandés pour l’imagerie : une longueur d’onde de 880 à 900 nm est optimale; pour l’excitation GFP et/ou dsRed / Rhodamine, un miroir dichroique de 565 nm avec 525/50 nm (canal vert) et 620/60 nm (canal rouge) filtres d’émission sont utilisés; pour la séparation GFP et YFP, un miroir dichroique de 509 nm avec filtres d’émission de 500/15 et 537/26 nm sont utilisés; la puissance du cerveau est maintenue à 25 mW ou moins; la résolution de l’image est de 1024 x 1024 pixels, le champ de vision pris avec un objectif 25X 0.9 NA à un facteur de zoom 1.5X est 295.24 x 295.24 μm.
  5. À la fin de l’imagerie, retirez la souris de la scène, laissez-la se réveiller de l’anesthésie et retournez dans sa cage d’origine jusqu’à une prochaine séance d’imagerie.

5. Imagerie et ré-imagerie à deux photons

  1. Pour les futures séances d’imagerie ultérieures, qui pourraient se situer entre quelques heures et quelques mois après la séance d’imagerie initiale, anesthésier la souris (Isoflurane, induction à 5 % et entretien à 1,5 %), monter au microscope à deux photons, maintenir sur une plaque chauffante et réinjecter 100 μl un colorant des vaisseaux sanguins comme la Rhodamine B (2 mg/mL).
  2. Ouvrez les images précédemment obtenues dans ImageJ et, à l’aide de ces images ainsi que les notes de la session précédente, identifiez les zones précédemment images et re-imagez soigneusement.
  3. Répétez cela aussi longtemps que la fenêtre d’imagerie est claire ou essentielle pour l’étendue de l’étude.

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Résultats

Pour visualiser la dynamique microgliale in vivo, des souris CX3CR1GFP/+transgéniques doubles ont été utilisées :Thy1 YFP souris ont été utilisées. La ligne Thy1-YFP H est utilisée par opposition à la ligne Thy1-GFP M pour éviter le chevauchement de la flore des microglies (GFP) et des neurones (YFP). D’autres approches pourraient utiliser une ligne de journaliste dans laquelle les microglies sont étiquetées avec par exemple, tdTomato, puis la ligne Thy1-GFP M peut être utilisée. Un ...

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Discussion

L’avènement de l’imagerie in vivo à deux photons a ouvert des possibilités d’explorer la pléthore d’interactions cellulaires et de dynamiques qui se produisent dans le cerveau sain. Les premières études se sont concentrées sur l’utilisation de l’approche ouverte de craniotomy de crâne à l’image dendrites neuronales par l’imagerie aiguë et chronique37,38. Cela peut également être utilisé pour élucider les interactions neuroimmunes dan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Eyo d’avoir discuté des idées présentées dans ce manuscrit. Nous remercions le Dr Justin Rustenhoven du Kipnis Lab de l’Université de Virginie pour le don de NG2DsRed souris33. Ce travail est soutenu par le financement du National Institute of Neurological Disorders and Stroke du National Institute of Health à U.B.E (K22 NS104392).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Coverglass (3mm)Warner Instruments64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)Amazonhttps://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light SystemDental Health Products, Inc910860-1
Dental DrillOsada: www.osadausa.eduEXL-M40
Drill BitFine Science Tools#19008-07
Eye OintmentHenry Schien1338333
iBond Total Etch (Primer glue)Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)66040094
Rhodamine BMillipore Sigma81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)Top Dent (Ivoclar Vivadent)#595956
Wahl Brav Mini+Amazonhttps://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

Références

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