Retard de l’accouchement intramyocardique des cellules souches après une blessure à l’Ischémie Reperfusion dans un modèle murine

Résumé

Les cellules de tiges sont continuellement étudiées comme traitements potentiels pour des individus avec des dommages myocardiques, cependant, leur viabilité diminuée et la rétention dans les tissus blessés peuvent avoir un impact sur leur efficacité à long terme. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode alternative pour l’administration de cellules souches dans un modèle murine de lésion de la reperfusion d’ischémie.

Résumé

Il y a un intérêt significatif dans l’utilisation des cellules souches (SC) pour le rétablissement de la fonction cardiaque dans les personnes avec des dommages myocardiques. Le plus souvent, la thérapie cardiaque de cellules souches est étudiée en fournissant des SC en même temps que l’induction des dommages myocardiques. Cependant, cette approche présente deux limites importantes : l’environnement ischémique pro-inflammatoire hostile précoce peut affecter la survie des SC transplantés, et elle ne représente pas le scénario d’infarctus subaigu où les SC seront probablement utilisés. Ici nous décrivons une série en deux parties des procédures chirurgicales pour l’induction des dommages d’ischémie-reperfusion et la livraison des cellules souches mésenchymales (MSCs). Cette méthode d’administration des cellules souches peut permettre une viabilité et une rétention plus longues autour des tissus endommagés en contournant la réponse immunitaire initiale. Un modèle de blessure de reperfusion d’ischémie a été induit chez des souris accompagnées de la livraison des cellules souches mésenchymales (3.0 x 10^5),exprimant stably le luciferase de luciferase de gène de journaliste sous le promoteur constitutivement exprimé de CMV, intramyocardially 7 jours plus tard. Les animaux ont été photographiés par ultrason et imagerie bioluminescente pour la confirmation des dommages et l’injection des cellules, respectivement. Fait important, il n’y avait aucun taux de complication supplémentaire lors de l’exécution de cette approche à deux procédures pour la livraison sc. Cette méthode d’administration des cellules souches, collectivement avec l’utilisation de gènes de reporter de pointe, peut permettre l’étude in vivo de la viabilité et de la rétention des SC transplantés dans une situation d’ischémie chronique couramment observée cliniquement, tout en contournant la réponse pro-inflammatoire initiale. En résumé, nous avons établi un protocole pour la livraison retardée des cellules souches dans le myocarde, qui peut être utilisé comme une nouvelle approche potentielle dans la promotion de la régénération des tissus endommagés.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires demeurent la cause la plus fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Les événements ischémiques cardiaques se sont avérés préjudiciables à la fonction globale du myocarde et des cellules environnantes¹. Seulement ̴0,45-1,0% des cardiomyocytes se régénérera chaque année après des dommages myocardes se produit². Malgré la demande croissante et l’accent inhérent sur le développement de traitements, les thérapies aidant à la régénération des tissus blessés ont été difficiles à établir et nécessitent encore une optimisation supplémentaire^3,4,5. Les thérapies de cellules souches ont été introduites comme voie alternative pour rajeunir les tissus endommagés après un événement ischémique ; cependant, l’avancement de ces thérapies a été remis en question par la survie et la rétention limitées des cellules dans une zone blessée⁶.

Le microenvironnement du cœur après un événement ischémique peut être caractérisé comme hypoxique, pro-oxydant, et pro-inflammatoire, présentant des conditions hostiles pour les cellules souches thérapeutiques à s’adapter à la survie^7,8. Comme une réponse immunitaire est déclenchée à la suite d’une blessure, les lymphocytes naïfs, les macrophages, les neutrophiles et les mastocytes tentent de réparer les dommages en enlevant les cellules mourantes et en modulant le processus de remodelage tissu^9,10,11. Dans les 3 premiers jours post-ischémie, l’inflammation est à son apogée avec la libération de cytokines pro-inflammatoires avec un grand nombre de neutrophiles et monocytes dans la zone^10,12. Après 7 jours, une grande partie de l’inflammation s’est calmée et la transition vers les cellules réparatrices commence, se poursuivant jusqu’à ce que la cascade de remodelage est terminée, environ 14 jours chez les souris¹³. Notre méthode chirurgicale est une approche alternative potentielle à l’introduction des produits biologiques dans le myocarde pour contourner la réponse immunitaire innée de pointe après la blessure de reperfusion d’ischémie. Dans le même temps, il permettra l’étude de tout traitement dans un état d’ischémie subaigue/chronique où il peut y avoir différentes variables à considérer par rapport à l’infarctus aigu du myocarde.

Protocole

Les expériences ont été réalisées sur des souris femelles C57BL/6, âgées de 10 à 12 semaines et pesant 20-25 g. Toutes les procédures animales étaient conformes aux normes énoncées dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) et ont été approuvées par le Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Préparation et intubation

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Si plusieurs chirurgies doivent être effectuées en une seule séance, nettoyez les instruments après chaque animal et réstérilisez à l’aide d’un stérilisateur de perles chaudes.
2. Anesthésiez les souris avec 3,5-4% d’isoflurane à 1 L/min O₂ dans une chambre d’induction.
3. Administrer la buprénorphine SR 1 mg/kg (analgésique) sous-cutanée, peser l’animal et entrer le poids dans le ventilateur.
4. Raser le côté gauche de la poitrine du sternum au niveau de l’épaule et appliquer de la crème dépilatoire pour enlever l’excès de fourrure.
5. Pour la procédure de reperfusion d’ischémie maintenir la pression positive d’expiration de fin (PEEP) sur le ventilateur à 2 cmH₂O. Pour l’injection retardée des cellules procédure changer le PEEP à 3 cmH₂O pour prévenir l’effondrement du poumon.
6. Intuber l’animal à l’aide d’un tube endotrachéal de 20 G, transférer sur un coussin chauffant contrôlé pour maintenir une température corporelle de 35 à 37 °C.
7. Placez la souris sur un ventilateur dans la réumbétrie latérale avec l’extrémité crânienne sur l’extrémité gauche et caudale sur la droite.
8. Maintenir l’anesthésie à 2-2,5% isoflurane à 1 L/min O₂ pour le reste de la procédure.
9. Frottez la zone chirurgicale en alternant entre povidone-iode et écouvillons d’alcool trois fois et appliquez l’onguent ophtalmique aux deux yeux.

2. Blessure à la reperfusion d’Ischémie

1. À l’aide d’un scalpel à lame #10 faire une incision verticale de 2,5 mm à droite du mamelon le plus gauche dans le champ de vision.
2. À l’aide de ciseaux couper à travers les couches musculaires superficielles jusqu’à ce que les muscles intercostaux et les côtes sont visibles.
3. Tout en soulevant les côtes et les tissus environnants, couper à travers l’espace intercostal entre les 4e et 5e côtes, puis insérer le rétracteur de paupières dans l’espace ouvert.
4. Rétractez le péricarde à l’aide de forceps incurvés, en déplaçant le poumon vers le haut et hors de vue.
5. Visualisez l’artère LAD et, à l’aide d’une suture en nylon 9-0, passez à travers le myocarde sous l’artère 2,5 mm distal à l’auricule gauche et attachez un nœud carré lâche.
6. Couper 1 cm de tubes en polyéthylène et le placer dans le nœud lâche.
7. Fixer la suture autour du tube, confirmer l’ischémie, puis relâcher après 35 min.
   REMARQUE : Confirmez l’ischémie par la pâleur et l’arythmie ventriculaire.
8. Après avoir libéré la ligature et enlevé le tube, attendre 5 min pour confirmer la reperfusion du myocarde.
9. Placez un tube de cathéter i.V. de 24 G dans la cavité thoracique un espace intercostal à droite de l’ouverture.
10. Fermez l’incision intercostal avec une suture absorbable de 6-0 dans un simple motif interrompu.
11. Fermez la couche musculaire avec une suture absorbable de 6-0 dans un motif de suture continue.
12. Après avoir fermé la couche musculaire superficielle, retirer le tube thoracique tout en retirant l’air de la cavité thoracique à l’aide d’une seringue de tuberculine de 1 mL.
13. Fermez l’incision de la peau avec une suture absorbable 6-0 dans un modèle de matelas horizontal continu
    REMARQUE : Des sutures en nylon et un motif de suture discontinue peuvent également être utilisés pour la couche cutanée.
14. Administrer 1,5 mL de sous-cutanée saline chaude et appliquer un onguent triple antibiotique au site d’incision pour prévenir l’infection.
15. Éteignez l’isoflurane et laissez l’animal respirer à travers le ventilateur à 100% O₂ jusqu’à ce qu’il puisse respirer continuellement sans aide.
16. Transférer la souris dans une cage sans literie ou dans une cage avec literie couverte (serviette en papier ou drapé) sur un tampon chaud à une température de 35 à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit entièrement récupérée.

3. Livraison de cellules souches mésenchymales de souris

REMARQUE : La souche de souris utilisée pour la procédure est une lignée consanguine et est considérée comme génétiquement identique. Les cellules souches mésenchymales ont été obtenues à partir d’animaux de la même souche et, par conception de protocole, l’immunosuppression n’a pas été induite¹.

1. Terminez les étapes de préparation et d’intubation comme cela a été fait précédemment pour la première procédure.
2. Retirez la suture de la couche de peau à l’aide de ciseaux et de forceps.
3. Avec un scalpel #10, faire une incision au même endroit que la chirurgie précédente.
4. Continuer à utiliser le scalpel pour couper à travers le tissu cicatriciel jusqu’à ce que la suture de couche musculaire est visible
5. À l’aide des ciseaux et des forceps, enlever la suture et couper la couche musculaire ouverte.
6. Visualisez et retirez les sutures qui maintiennent les côtes ensemble et continuez à couper à travers le muscle intercostal de l’incision précédente.
   REMARQUE : Les poumons peuvent avoir adhéré à la paroi thoracique, si cela se produit, utiliser des forceps émoussés ou incurvés pour les séparer soigneusement et les relâcher.
7. Placez le rétracteur de paupière dans l’espace intercostal et localisez la zone de la ligature précédente.
8. Charger les cellules souches mésenchymales (3,0 x 10⁵), suspendues dans 20 μL PBS, dans une seringue à insuline de 30 G, plier l’aiguille légèrement au besoin pour que l’angle approprié s’injecte.
   REMARQUE : Les cellules souches mésenchymales (MSC) ont été isolées du tissu adipeux des souris C56BL/6 de 4-6 semaines. Les cellules de passage précoce (p3) ont été transduites avec un vecteur exprimant le gène de luciferase de luciferase de lucfly sous le promoteur de CMV pour permettre la surveillance de la viabilité in vivo de cellules. La souris dérivée de l’adipeux MSC était caractérisée par une cytométrie de flux et les cellules étaient positives pour CD44, CD29, CD90 et CD105, mais négatives pour le marqueur hématopoïétique CD45¹⁴. Avant l’injection, les MSC étaient cultivés pendant au moins un passage afin d’éviter la perte de cellules du processus de dégel.
9. Se déplaçant dans la direction de l’apex vers la base du cœur insérer la seringue dans la région péri-infarctus jusqu’à ce que l’ouverture de l’aiguille est complètement à l’intérieur du myocarde.
10. Une fois à l’intérieur injecter lentement les cellules dans le myocarde, attendre 3 s, puis retirer l’aiguille.
11. Observez le cœur de près pendant 3 min pour être sûr de ne pas avoir de réactions anormales aux cellules telles que la fibrillation ventriculaire.
12. Placez un tube de cathéter iv de 24 G dans la cavité thoracique un espace intercostal à droite de l’ouverture.
13. Fermez les couches intercostal, musculaire et cutanée et retirez le tube thoracique dans la même méthode que la première procédure.
14. Administrer 1,5 mL de sous-cutanée saline chaude et appliquer un onguent triple antibiotique au site d’incision pour prévenir l’infection.
15. Éteindre l’isoflurane et permettre à l’animal de respirer à travers le ventilateur à 100% O₂ jusqu’à ce qu’il soit capable de respirer continuellement sans aide.
16. Transférer la souris dans une cage sans literie ou dans une cage avec literie couverte (serviette en papier ou drapé) sur un tampon chaud à une température de 35 à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit entièrement récupérée.

4. Soins postopératoires suivant les deux procédures

1. Observez l’animal en permanence jusqu’à ce que la respiration spontanée, la réumbétrie sternale et le mouvement normal soient établis.
2. Continuer l’observation toutes les 15-30 min pendant au moins 3 h le jour de la chirurgie.
3. Vérifiez les souris pour la déhiscence de blessure ou la douleur anormale une fois par jour pendant 5 jours, puis 2-3 fois par semaine.
4. Si l’animal présente des signes de douleur (c.-à-d. dos arqué, mouvement minimal, grimace, ou fourrure débraillée) après 72 h post-op, fournir une dose supplémentaire de buprénorphine SR analgésique.

Résultats

La blessure de reperfusion d’Ischémie a été induite chez des souris le jour 0, suivie d’un échocardiogramme post-opératoire et d’un électrocardiogramme le jour précédant l’implantation de cellules souches. L’analyse échographique et électrocardiogramme a confirmé l’infarctus et la diminution de la fonction contractile ventriculaire (figure 1A-D). Un examen plus approfondi des données a montré que la fraction d’éjection et le raccourcissement fract...

Discussion

Plus de 85 millions de personnes dans le monde sont touchées par les maladies cardiovasculaires³. La prévalence élevée de ces événements ischémiques justifie le développement et l’expansion de thérapies alternatives pour promouvoir la régénération des tissus endommagés. Les méthodes traditionnelles utilisent la procédure de reperfusion d’ischémie dans un cadre aigu avec l’administration ultérieure des thérapies¹. Les réactions inflammatoires sont à...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific