Différenciation des monocytes en macrophages phénotypiquement distincts après traitement par des exosomes dérivés de cellules souches de sang de cordon humain (CB-SC)-Dérivés

Résumé

L’application Exosome est un outil émergent pour le développement de médicaments et la médecine régénérative. Nous établissons un protocole d’isolement exosome avec une grande pureté pour isoler les exosomes de nouvelles cellules souches identifiées appelées CB-SC pour les études mécanistes. Nous coculture également cb-SC-dérivé exosomes avec des monocytes humains, conduisant à leur différenciation en macrophages phénotypiquement distincts.

Résumé

La thérapie d’éducateur de cellules souches (SCE) est une nouvelle approche clinique pour le traitement du diabète de type 1 et d’autres maladies auto-immunes. La thérapie de SCE fait circuler les cellules mononucléaires de sang du patient isolé (par exemple, lymphocytes et monocytes) par une machine d’apheresis, co-cultures les cellules mononucléaires de sang du patient avec des cellules souches adhérentes dérivées du sang de cordon ombilical (CB-SC) dans le dispositif de SCE, et retourne alors ces cellules immunitaires « instruites » au sang du patient. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de taille nanométrique entre 30\u2012150 nm existant dans tous les médias biofluidés et de culture cellulaire. Pour explorer davantage les mécanismes moléculaires sous-jacents à la thérapie SCE et déterminer les actions des exosomes libérés par CB-SC, nous étudions quelles cellules phagocytisent ces exosomes pendant le traitement par CB-SC. En co-culturant les exosomes dérivés du CB-SC étiquetés PAR Dio avec les cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC), nous avons constaté que les exosomes dérivés du CB-SC étaient principalement pris en charge par des monocytes humains CD14 positifs, conduisant à la différenciation des monocytes en macrophages de type 2 (M2), avec morphologie spindle-like et expression des marqueurs moléculaires de surface associés à M2. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et la caractérisation des exosomes cb-SC-dérivés et le protocole pour la co-culture des exosomes CB-SC-dérivés avec les monocytes humains et la surveillance de la différenciation M2.

Introduction

Les cellules souches du sang de cordon ombilical (CB-SC) sont un type unique de cellules souches identifiées à partir du sang de cordon ombilical humain et se distinguent d’autres types connus de cellules souches telles que les cellules souches mésenchymales (MSC) et les cellules souches hématopoïétiques (HSC)¹. En fonction de leurs propriétés uniques de modulation immunitaire et de leur capacité à adhérer étroitement à la surface des boîtes de Pétri, nous avons développé une nouvelle technologie désignée comme thérapie d’éducateur de cellules souches (SCE) dans les essais^{cliniques 2,3}. Pendant la thérapie de SCE, les cellules mononucléaires périphériques de sang d’un patient (PBMC) sont rassemblées et distribuées par un séparateur cellulaire et co-cultivés avec le CB-SC adhérent in vitro. Ces cellules « instruites » (CB-SC-traitées PBMC) sont alors retournées à la circulation du patient dans un système à boucle fermée. Les essais cliniques ont déjà démontré l’innocuité clinique et l’efficacité de la thérapie SCE pour le traitement des maladies auto-immunes, y compris le diabète de type 1 (T1D)^2,4 et l’alopécie areata (AA)⁵.

Les exosomes sont une famille de nanoparticules dont le diamètre est de 30\u2012150 nm et existent dans tous les médias biofluides et de culture cellulaire⁶. Les exosomes sont enrichis de nombreuses molécules bioactives, y compris les lipides, les ARNM, les protéines et les microARN (miARN), et jouent un rôle important dans les communications cellule à cellule. Ces derniers temps, les exosomes sont devenus plus attrayants pour les chercheurs et les compagnies pharmaceutiques en raison de leur potentiel thérapeutique dans les cliniques^7,8,9. Récemment, nos études mécanistes ont démontré que les exosomes CB-SC-libérés contribuent à la modulation immunisée de la thérapie de SCE^10.

Ici, nous décrivons le protocole pour explorer le mécanisme de la thérapie de SCE ciblant des monocytes par des exosomes CB-SC-libérés. Premièrement, les exosomes libérés par CB-SC ont été isolés des supports conditionnés dérivés du CB-SC à l’aide de méthodes d’ultracentrifugation et validés par cytométrie d’écoulement, tache occidentale (WB) et diffusion dynamique de la lumière (DLS). Deuxièmement, les exosomes dérivés de CB-SC ont été étiquetés avec un colorant lipophile fluorescent vert : Dio. Troisièmement, ils ont été co-cultivés avec PBMC pour examiner les pourcentages positifs d’exosomes dérivés de CB-SC étiquetés Dio aux différentes sous-populations de PBMC par cytométrie de flux. Ce protocole fournit des conseils pour étudier l’action des exosomes sous-jacents à la modulation immunitaire des cellules souches.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices du comité institutionnel d’éthique de la recherche humaine au Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Des unités humaines de sang de manteau buffy ont été achetées du centre de sang de New York (New York, NY). Des unités humaines de sang de cordon ombilical ont été recueillies auprès de donneurs en bonne santé et achetées auprès de la banque de sang Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Le New York Blood Center et Cryo-Cell ont tous deux reçu toutes les accréditations pour les collectes et les distributions de sang, avec l’approbation de la CISR et les formulaires de consentement signés par les donneurs.

1. Culture cellulaire et préparation d’un milieu conditionné dérivé du CB-SC

1. Transférer 25 mL de sang de cordon ombilical (tableau desmatériaux)sur 20 mL de dénivelé moyen (γ = 1,077) dans un tube conique de 50 mL.
2. Centrifugeuse à 1 690 x g pendant 20 min à 20 °C dans un rotor balançant sans frein.
3. Transférer délicatement la couche cellulaire mononucléaire (pelage bouffi) dans un nouveau tube conique de 50 mL. Remplir le tube conique de saline tamponnée de phosphate (PBS) à 40 mL. Mélanger et centrifugeuser les cellules à granulés à 751 x g pendant 10 min à 20 °C.
4. Jetez le supernatant et ajoutez 15 mL de tampon de lyse ACK(Tableau des matériaux)à la pastille cellulaire. Suspendre à nouveau les cellules par pipetage. Puis incuber pendant 10 min à température ambiante.
   REMARQUE : Cette étape élimine les globules rouges.
5. Remplissez le tube conique de 25 mL de PBS. Centrifugeuse à 751 x g pendant 5 min et jeter le surnatant pour obtenir des cellules mononucléaires granulées.
6. Laver 2x avec 40 mL de PBS pour enlever le tampon de lyse restant.
7. Centrifugeuse à 751 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules.
8. Jetez le supernatant et suspendez les cellules mononucléaires du sang de cordon ombilical avec 10 mL de milieu sans sérum défini chimiquement (Tableau des matériaux) par tube.
9. Mélanger les cellules mononucléaires du sang de cordon ombilical à un seul tube.
10. Prendre 20 μL de suspension cellulaire et mélanger avec 20 μL de 0,4% trypan solution bleue (Table of Materials) dans un tube de 1,5 mL.
11. Chargez dans la glissière de chambre et quantifiez le numéro de cellule et la viabilité de la cellule avec un compteur de cellules automatisé.
    REMARQUE : La suspension cellulaire est diluée à 1:10 si la concentration cellulaire est supérieure à 1 x 10⁷ cellules/mL.
12. Cellules mononucléaires de graine dans les plats de Petri de 150 mm x 15 mm à 1 x^{10 6} cellules/mL, 25 mL/plat dans le milieu chimique-défini de culture cellulaire sérique-libre.
13. Incuber à 37 °C sous 8 % de CO₂ pendant 10\u201214 jours jusqu’à ce que le CB-SC atteigne plus de 80 % de confluence.
14. Jeter le surnatant et laver avec 15 mL de PBS par boîte de Pétri; puis, retirez le PBS.
    REMARQUE : Cb-SC sont attachés aux plats de Petri étroitement.
15. Répétez l’étape 1.14 deux fois.
16. Ajouter 25 mL de sérum moyen sans sérum défini chimiquement par boîte de Pétri.
17. Incuber à 37 °C sous 8% de CO₂ pendant 3\u20124 jours.
18. Recueillir le milieu conditionné dérivé du CB-SC en tubes coniques de 50 mL.

2. Caractérisation du CB-SC

1. Détachez CB-SC en pipetant 10 mL de tampon de dissociation cellulaire à base de PBS de haut en bas avec une pointe pipette de 5 mL (Tableau des matériaux).
2. Centrifugeuse à 1 690 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules et suspendre à nouveau en 200 μL de PBS.
3. Fixer et perméabilizer les cellules pour la coloration intracellulaire par l’intermédiaire du kit de préparation de coloration (Tableau des matériaux).
4. Ajouter 5 μL de bloqueur fc(table des matériaux)par échantillon et incuber pendant 15 min à température ambiante.
   REMARQUE : Le bloqueur fc inhibe la liaison non spécifique lors de la coloration avec des anticorps.
5. Ajouter des anticorps monoclonaux anti-humains conjugués à la fluorescence, y compris cd34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 et Galectin 9 à 25 μg/mL(tableau des matériaux)à 100 μL de volume de cellules. Incuber pendant 30 min à température ambiante avec protection contre la lumière.
6. Après coloration, laver les cellules avec 1 mL de PBS et centrifugeuse à 751 x g pendant 10 min pour pelleter les cellules.
7. Suspendre à nouveau les cellules avec 200 μL de PBS et les transférer dans un tube de 5 mL.
8. Effectuer la cytométrie d’écoulement pour valider l’expression de CB-SC-associé au-dessus des marqueurs spécifiques.

3. Isolement des exosomes dérivés du CB-SC

1. Centrifugeuse le milieu conditionné recueilli à partir de l’étape 1.18 à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 mL.
2. Centrifugeuse le supernatant recueilli à partir de l’étape 3.1 à 2.000 x g pendant 20 min à 4 °C. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 mL.
3. Centrifugeuse le supernatant recueilli à partir de l’étape 3.2 à 10.000 x g pendant 30 min à 4 °C. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 mL.
   REMARQUE : Le rotor à angle fixe est utilisé de sorte que les granulés cellulaires soient précipités sur le côté du tube. Marquez le côté du bouchon et dessinez un cercle sur le côté du tube où la pastille est attendue.
4. Filtrez les supernatants recueillis à partir de l’étape 3.3 avec un filtre de 0,22 μm(Tableau des matériaux).
5. Transférer 15 mL de supports à chaque unité de filtre centrifuge de 10 kDa (Tableau des matériaux).
6. Centrifugeuse à 4000 x g pendant 30 min pour isoler les médias exosome concentrés.
7. Transférer les exosomes concentrés dans un tube d’ultracentrifugeuse. Puis, exosomes granulés à 100.000 x g pendant 80 min à 4 °C.
8. Jeter le supernatant et suspendre à nouveau les exosomes de granulés dans 10 mL de PBS.
9. Centrifugeuse à 100.000 x g pendant 80 min à 4 °C pour recueillir les exosomes granulés.
10. Suspendre à nouveau la pastille d’exosomes dans 200 μL de PBS en faisant monter et descendre.

4. Caractérisation des exosomes dérivés du CB-SC

1. Quantification de la concentration totale en protéines de préparation exosome par kit d’analyse d’acide bicinchoninique (BCA)
   1. Pipette 10 μL de chaque échantillon standard d’albumine et exosome isolé préparé à l’étape 3.10 dans une plaque de 96 puits en double.
   2. Ajouter 200 μL du reagent de travail du kit BCA à chaque puits. Bien mélanger le contenu de l’assiette sur le shaker de l’assiette pendant 10 s.
      REMARQUE : Reagent de travail (WR) : 50 parties de reagent A avec 1 partie de reagent B.
   3. Couvrir les assiettes de papier d’aluminium et les incuber à 37 °C pendant 30 min.
   4. Refroidir les assiettes à température ambiante (RT).
   5. Mesurer l’absorption de l’échantillon à 562 nm par l’intermédiaire d’un lecteur de plaque.
2. Préparation et coloration des exosomes pour la cytométrie du débit
   1. Capturez les exosomes en ajoutant 20 μL de perles magnétiques anti-humains CD63 (taille de 4,5 μm)(tableau des matériaux)en 25 μg d’exosomes dérivés du CB-SC préparés à l’étape 3.10 dans un volume total de 100 μL de PBS.
   2. Incuber le tube toute la nuit (18\u201222 h) à 4 °C sur le shaker à 800 rpm.
   3. Centrifugeuse du tube à 300 x g pendant 30 s pour recueillir l’échantillon au fond du tube.
   4. Ajouter 300 μL de tampon d’isolement (0,1 % d’albumine de sérum bovin (BSA) dans PBS) et mélanger délicatement à l’aide d’un pipetage.
      REMARQUE : Cette étape lave les exosomes liés aux perles.
   5. Placez le tube sur un support magnétique pendant 1 min (Table des Matériaux) et jetez le supernatant.
   6. Répétez les étapes 4.2.4\u20124.2.5.
   7. Suspendre à nouveau les exosomes liés aux perles avec 400 μL de tampon d’isolement.
   8. Aliquot 100 μL d’exosomes liés aux perles à chaque tube.
   9. Ajouter des anticorps conjugués à la fluorescence (CD9-FITC, CD81-PE et CD63-FITC à 25 μg/mL, respectivement) à chaque tube d’écoulement avec des exosomes capturés par des perles CD63.
      REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôles négatifs.
   10. Incuber pendant 45 min à température ambiante avec une protection légère sur le shaker à 800 rpm.
   11. Répétez les étapes 4.2.4\u20124.2.5.
   12. Suspendre à nouveau les exosomes liés aux perles dans 200 μL de tampon d’isolement et les transférer vers des tubes d’écoulement de 5 mL.
   13. Placer les tubes dans le carrousel échantillon du cytomètre d’écoulement.
   14. Ouvrez le protocole pour les tests exosome.
   15. Exécutez l’échantillon automatiquement par cytomètre d’écoulement.
3. Détection exosome par tache occidentale
   REMARQUE: Tache occidentale est une méthode bien établie et nous n’allons pas entrer dans les détails de la méthode elle-même.
   1. Lyse les granulés d’exosomes dérivés de CB-SC de l’étape 3.10 avec 100 μL de tampon RIPA, pipette 20x, puis placer sur la glace pendant 5 min.
   2. Quantifier la concentration protéique de lysate exosome par kit BCA et charger 25 μg de protéines par puits.
   3. Séparer les protéines par électrophorésie gel pendant 40 min à 150 V.
   4. Transférer la protéine à la membrane du fluorure de polyvinylidene (PVDF) à l’aide de la méthode de transfert^{semi-sèche 11}.
   5. Bloquer la membrane avec 5% de lait non gras pendant 30 min.
   6. Incuber avec 2 anticorps anti-humains Alix(Tableau des matériaux)et 1 anticorps anti-humains calnexine μg/mL (Tableau des matériaux).
   7. Détectez la protéine par chimioluminescence à l’aide d’un système d’imagerie numérique.
4. Validation exosome par diffusion dynamique de la lumière (DLS)
   1. Diluer 10 μg d’échantillons d’exosomes dérivés du CB-SC dans 1 mL de PBS.
   2. Transférer le 1 mL d’échantillon dilué dans une cuvette semi-micro jetable( Tableau des matériaux).
   3. Placez la cuvette dans l’instrument DLS. Définissez l’indice réfractif (RI) comme 1,39 pour tous les moniteurs d’échantillon.
   4. Exécutez des échantillons à 25 °C et obtenez trois mesures par fraction pour obtenir une distribution de taille moyenne.
5. Validation exosome par microscopie électronique de transmission (TEM)
   1. Coat formvar sur 300 grilles de cuivre en maille¹² (Tableau des matériaux).
   2. Renforcer le formvar avec la couche supplémentaire de carbone évaporé sur les grilles de cuivre¹².
      REMARQUE : Une telle approche de revêtement est excellente pour le support des spécimens.
   3. Chargez 10 μL d’échantillons d’exosome sur les grilles et laissez sécher à l’air libre.
   4. Colorer négativement les échantillons d’acétate d’uranyle pendant 5 min.
   5. Laver trois fois avec de l’eau DI et laisser sécher à l’air libre.
   6. Observez et photographiez les échantillons sous TEM. Réglez la tension d’accélération à 200 kV et la taille de la tache à 2.

5. Mesurer les exosomes dérivés du CB-SC étiquetés Dio pris par différentes sous-populations de PBMC

1. Étiquette exosomes dérivés du CB-SC avec colorant lipophile fluorescent vert Dio
   1. Transférer 100 μg d’exosomes dérivés du CB-SC (préparés à l’étape 3.10) dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
   2. Diluer l’échantillon avec PBS à 5 mL.
   3. Ajouter le colorant lipophile fluorescent vert Dio (Tableau desmatériaux) jusqu’àce que la concentration de travail atteigne 5 μM.
   4. Incuber pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière.
   5. Transférer l’échantillon dans un tube d’ultracentrifugeuse.
   6. Centrifugeuse à 100.000 x g pendant 80 min pour pelleter dio-étiqueté CB-SC-dérivé exosomes.
   7. Suspendre à nouveau les exosomes étiquetés dans 200 μL de PBS.
2. Préparation du PBMC humain
   1. Transférer 25 mL de pelage buffy humain(Table of Materials)de plus de 20 mL de dénivelé moyen (γ = 1,077) dans un tube conique de 50 mL.
   2. Répétez les étapes 1.2 à 1.11.
   3. Transférer 1 x 10⁶ PBMC dans une plaque hydrophobe hydrophobe non traitée par les tissus (1 mL/puits).
      REMARQUE : Une plaque non traitée par les tissus a été utilisée pour éviter l’adhérence des monocytes.
3. Co-culture Dio-labeled exosomes avec PBMC
   1. Transférer 40 exosomes dérivés du CB-SC étiquetés μL Dio préparés à l’étape 5.1.7 à chaque puits contenant PBMC dans une plaque de 24 puits à l’aide d’une pipette de 200 μL. Ajouter le même volume de PBS pour contrôler les puits.
   2. Mélanger en pipetting 10x. Incuber pendant 4 h.
   3. Recueillir 200 μL de PBMC traités à l’exosome et l’étiqueter avec Hoechst 33342 pendant 10 min à température ambiante.
   4. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 100 μL de PBS.
   5. Monter les cellules sur des diapositives au microscope.
   6. Observez et photographiez l’interaction d’exosomes dérivés du CB-SC étiquetés Dio avec hoechst 33342 étiquetés PBMC à l’aide d’un microscope.
   7. Transférer les cellules restantes de l’étape 5.3.3 dans un tube de 1,5 mL.
   8. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en 200 μL de PBS.
   9. Ajouter 5 μL de bloqueur Fc par échantillon. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
   10. Ajouter des anticorps (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 et CD56 à 25 μg/mL)(Table of Materials)pour tacher PBMC.
       REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôles négatifs.
   11. Incuber pendant 30 min à température ambiante avec protection contre la lumière.
   12. Ajouter 1 mL de PBS et de centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour pelleter les cellules.
   13. Suspendre à nouveau les cellules avec 200 μL PBS. Ajouter 5 μL d’iodure de propidium.
   14. Utilisez la cytométrie du débit pour évaluer le niveau d’absorption exosome étiquetée Dio dans différentes sous-populations de PBMC.

6. Examiner l’action des exosomes dérivés du CB-SC sur les monocytes

1. Isolation des monocytes humains CD14 positifs
   1. Transférer 3 x 10⁷ PBMC humain dans un tube de 15 mL.
   2. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
   3. Placez la colonne de séparation( Tableau des matériaux) dans le séparateur d’aimant ( Tableau desmatériaux).
   4. Laver les colonnes de séparation trois fois avec 2 mL de tampon de fonctionnement à froid( Tableau des matériaux).
   5. Suspendre à nouveau les cellules dans 300 μL de PBS froid. Ajouter 60 μL de microbilles de CD14. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 15 min.
   6. Ajouter 6 mL de PBS froid. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
   7. Suspendre à nouveau les cellules granulées dans 500 μL de tampon de fonctionnement à froid.
   8. Transférez les cellules dans la colonne de séparation (préparées à l’étape 6.14) et laissez-les passer.
   9. Lavez la colonne de séparation trois fois avec 2 mL de tampon en cours d’exécution par lavage. Soulevez la colonne du séparateur d’aimant et placez-la dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
      REMARQUE : Le tube de 15 mL doit être placé sur la glace en raison de l’adhérence des monocytes CD14 positifs au tube à température ambiante.
   10. Transférez 2 mL de tampon de fonctionnement à froid vers le haut de la colonne et isolez les cellules CD14 positives dans le tube de 15 mL.
   11. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour pelleter les cellules CD14 positives.
   12. Suspendre à nouveau les cellules avec 2 mL de sérum froid défini chimiquement milieu libre (Tableau des matériaux).
   13. Transférer 50 μL de cellules dans un tube de 1,5 mL.
   14. Tache avec 10 μL de Krome Orange conjuguée anti-humain CD14 mAb (Table of Materials) pendant 20 min.
       REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôles négatifs.
   15. Ajouter 1 mL PBS aux cellules. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min pour pelleter les cellules.
   16. Suspendre à nouveau les cellules dans 200 μL de PBS et les transférer dans un tube de 5 mL. Déterminer la pureté des monocytes CD14 positifs par cytométrie d’écoulement.
2. Traitement des monocytes avec des exosomes dérivés du CB-SC
   1. Graine 1 x 10⁶ monocytes purifiés avec milieu de culture sans sérum défini chimiquement (Tableau des matériaux) dans la plaque de 6 puits traitée par culture tissulaire (2 mL/puits).
   2. Incuber pendant 2 h à 37 °C sous 5 % de CO₂.
   3. Jeter le supernatant avec une pipette de 1 mL. Ajouter délicatement 2 mL de 37 °C de milieu de culture sans sérum préchauffé défini chimiquement (Table of Materials).
      REMARQUE : Les monocytes ont été adhérés à la plaque dans les 2 h. Les cellules flottantes ont été identifiées comme étant mortes ou d’autres contaminations cellulaires.
   4. Ajouter 80 exosomes dérivés du CB-SC isolés de l’étape 3.10 aux cultures monocytes dans une plaque de 6 puits avec un volume total de 2 mL.
      REMARQUE : Le même volume de PBS a été ajouté aux puits de contrôle.
   5. Incuber à 37 °C sous 5% de CO₂ pendant 3\u20124 jours.
   6. Photographiez la morphologie cellulaire à l’aide d’un microscope inversé à 200 × grossissement(Tableau des matériaux).
   7. Détachez les cellules en pipetage de haut en bas dans 1 mL d’un tampon de dissociation cellulaire à base de PBS avec 1 mL pipette pointe.
   8. Récoltez les cellules attachées restantes à l’aide d’un grattoir cellulaire.
      REMARQUE : Puisque les monocytes primaires ou les macrophages différenciés se fixent étroitement, certaines cellules restent adhérées au fond après le traitement avec le tampon de dissociation. Par conséquent, ces cellules sont récoltées avec un grattoir cellulaire.
   9. Recueillir les cellules à 1 690 x g pendant 5 min. Suspendre à nouveau les cellules dans 200 μL de PBS.
   10. Ajouter 5 μL de bloqueur Fc (25 μg/mL) pour bloquer la liaison non spécifique.
   11. Ajouter des anticorps (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 et CD209 à 25 μg/mL, Table of Materials)aux cellules. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
       REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôle négatif
   12. Ajouter 1 mL de PBS aux cellules et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min. Jetez le supernatant et suspendez avec 200 μL de PBS.
   13. Ajouter 5 μL d’iodure de propidium par échantillon (200 μL) et transférer les cellules dans un nouveau tube d’écoulement de 5 mL.
   14. Effectuez la cytométrie du flux et évaluez les niveaux d’expressions CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 et CD209.

Résultats

Au commencement, le phénotype et la pureté du CB-SC ont été examinés par cytométrie de flux avec des marqueurs CB-SC-associés tels que l’antigène commun de leucocyte CD45, les facteurs de transcription cellule-spécifiques d’ES OCT3/4, et SOX2. Cb-SC afficher des niveaux élevés de CD45, OCT3/4, SOX2, CD270, et galectin 9 expression, mais aucune expression de CD34 (Figure 1A). L’analyse de cytométrie de flux a confirmé l’expression des marqueurs exosome-spécifiques compre...

Discussion

L’application d’exosomes est un domaine émergent pour le diagnostic clinique, le développement de médicaments et la médecine régénérative. Ici, nous présentons un protocole détaillé concernant la préparation des exosomes CB-SC-dérivés et l’étude fonctionnelle des exosomes sur la différenciation des monocytes humains. Le protocole actuel a démontré que les exosomes fonctionnels CB-SC-dérivés sont isolés par centrifugation séquentielle et ultracentrifugation avec la pureté élevée et présentan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-129
15 ml conical tube	Falcon	352196
24-well plate	Falcon	351147	Non-tissue culture plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)	Millipore sigma	D4292-20MG	Store at 4 °C
300 Mesh Grids	Ted Pella	1GC300
50 mL conical tube	Falcon	352070
6-well plate	Falcon	353046	Tissue culture plate
96-well plate	Falcon	353072	Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit	Millipore sigma	UFC901024
Anti-Human Alix	Biolegend	634501	store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin	Biolegend	699401	store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7	BD Bioscience	561356	store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange	Beckman Coulter	B36294	store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE	BD Bioscience	556018	store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5	Beckman Coulter	IM2643U	store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC	BD Bioscience	551135	store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421	BD Bioscience	564127	store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE	Biolegend	318806	store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue	Biolegend	300431	store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC	Beckman Coulter	IM2427U	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC	BD Bioscience	555349	store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7	Beckman Coulter	IM3548U	store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE	Beckman Coulter	IM2073U	store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE	BD Bioscience	561925	store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	A94686	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC	Beckman Coulter	B30642	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC	BD Bioscience	561956	store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	B30646	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC	ThermoScientic	MA5-16860	store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421	Biolegend	348919	store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660	ThermoScientic	50-5841-82	store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488	ThermoScientic	53-9811-82	store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A1933
Buffy coat	New York Blood Center		40-60 ml/unit
Cell scraper	Falcon	353085
Disposable semi-micro cuvette	VWR	97000590
Dissociation buffer	Gibco	131510014	100 ml
Dual-Chanber cell counting slides	Bio-Rad	1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent	ThermoFisher Scientific	10606D	store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media	GE Health	17-1440-03	500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°)	Thermo Scientifc	75003698	Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter		3 lasers 10 Color Max
Human cord blood	Cryo-Cell International		40-100 ml/unit
Human Fc Block	BD Bioscience	564220	store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore Sigma	SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge	Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4	BioExpress	S-3500-1
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	500 ml
Propidium Iodide	BD Bioscience	56-66211E	store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope	Nikon instruments Inc	Eclipse Ti2	NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342	Thermo Scientifc	62249	5 ml
Revert microsopy	Fisher scientific	12563518
Rotor 41 Ti	Beckman Coulter	331362	Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge	Thermo Scientifc	75004381
Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientifc	75003655
TC-20 cell counter	Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	331372
X'VIVO 15 Serum-free medium	Lonza	BEBP04-744Q	1000 ml Culture medium, store at 4 °C