Un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’ARN-seq

Résumé

Le but de ce protocole est d’étudier l’évolution et l’expression des gènes candidats à l’aide de données de séquençage de l’ARN.

Résumé

Distiller et signaler de grands ensembles de données, tels que des données sur le génome entier ou le transcriptome, est souvent une tâche ardue. Une façon de décomposer les résultats est de se concentrer sur une ou plusieurs familles de gènes qui sont importantes pour l’organisme et l’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes bioinformatiques pour générer une phylogénie et quantifier l’expression des gènes d’intérêt. Les arbres phylogénétiques peuvent donner un aperçu de l’évolution des gènes au sein des espèces et entre elles, ainsi que révéler l’orthologie. Ces résultats peuvent être améliorés en utilisant des données RNA-seq pour comparer l’expression de ces gènes dans différents individus ou tissus. Les études de l’évolution et de l’expression moléculaires peuvent révéler des modes d’évolution et de conservation de la fonction des gènes entre les espèces. La caractérisation d’une famille de gènes peut servir de tremplin pour de futures études et peut mettre en évidence une famille de gènes importante dans un nouveau génome ou un nouvel article de transcriptome.

Introduction

Les progrès des technologies de séquençage ont facilité le séquençage des génomes et des transcriptomes d’organismes non modèles. En plus de la faisabilité accrue du séquençage de l’ADN et de l’ARN de nombreux organismes, une abondance de données est accessible au public pour étudier les gènes d’intérêt. Le but de ce protocole est de fournir des étapes bioinformatiques pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans l’organisme d’intérêt.

L’étude de l’évolution d’un gène ou d’une famille de gènes peut donner un aperçu de l’évolution des systèmes biologiques. Les membres d’une famille de gènes sont généralement déterminés en identifiant des motifs conservés ou des séquences de gènes homologues. L’évolution de la famille de gènes a été précédemment étudiée à l’aide de génomes provenant d’organismes modèles lointainement apparentés¹. Une limite à cette approche est qu’il n’est pas clair comment ces familles de gènes évoluent chez des espèces étroitement apparentées et le rôle des différentes pressions sélectives environnementales. Dans ce protocole, nous incluons une recherche d’homologues chez des espèces étroitement apparentées. En générant une phylogénie au niveau de l’embranchement, nous pouvons noter des tendances dans l’évolution de la famille de gènes tels que celle des gènes conservés ou des duplications spécifiques à la lignée. À ce niveau, nous pouvons également étudier si les gènes sont des orthologues ou des paralogues. Bien que de nombreux homologues fonctionnent probablement de manière similaire les uns aux autres, ce n’est pas nécessairement le cas². L’incorporation d’arbres phylogénétiques dans ces études est importante pour déterminer si ces gènes homologues sont des orthologues ou non. Chez les eucaryotes, de nombreux orthologues conservent des fonctions similaires au sein de la cellule, comme en témoigne la capacité des protéines de mammifères à restaurer la fonction des orthologues de levure^3. Cependant, il existe des cas où un gène non orthologue effectue une fonction caractérisée^4.

Les arbres phylogénétiques commencent à délimiter les relations entre les gènes et les espèces, mais la fonction ne peut pas être attribuée uniquement en fonction des relations génétiques. Les études d’expression génique combinées aux annotations fonctionnelles et à l’analyse de l’enrichissement fournissent un solide soutien à la fonction des gènes. Les cas où l’expression des gènes peut être quantifiée et comparée entre les individus ou les types de tissus peuvent être plus révélateurs de la fonction potentielle. Le protocole suivant suit les méthodes utilisées dans l’étude des gènes de l’opsine dans Hydra vulgaris⁷, mais ils peuvent être appliqués à n’importe quelle espèce et n’importe quelle famille de gènes. Les résultats de ces études fournissent une base pour une étude plus approfondie de la fonction des gènes et des réseaux de gènes dans les organismes non modèles. A titre d’exemple, l’étude de la phylogénie des opsines, qui sont des protéines qui initient la cascade de phototransduction, donne un contexte à l’évolution de la détection des yeux et de la lumière^8,9,10,11. Dans ce cas, des organismes non modèles en particulier des espèces animales basales telles que les cnidaires ou les cténophores peuvent élucider la conservation ou les changements dans la cascade de phototransduction et la vision à travers les clades^12,13,14. De même, la détermination de la phylogénie, de l’expression et des réseaux d’autres familles de gènes nous renseignera sur les mécanismes moléculaires sous-jacents aux adaptations.

Protocole

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de l’UC Irvine.

1. Préparation de la bibliothèque RNA-seq

1. Isolez l’ARN à l’aide des méthodes suivantes.
   1. Prélever des échantillons. Si l’ARN doit être extrait ultérieurement, congeler instantanément l’échantillon ou le placer dans une solution de stockage d’ARN¹⁵ (Table des matériaux).
   2. Euthanasier et disséquer l’organisme pour séparer les tissus d’intérêt.
   3. Extraire l’ARN total à l’aide d’un kit d’extraction et purifier l’ARN à l’aide d’un kit de purificationde l’ARN( Table des matériaux )
      REMARQUE: Il existe des protocoles et des kits qui peuvent mieux fonctionner pour différentes espèces et types de tissus^16,17. Nous avons extrait l’ARN de différents tissus corporels d’un papillon¹⁸ et d’un Hydra gélatineux ¹⁹ (voir discussion).
   4. Mesurer la concentration et la qualité de l’ARN de chaque échantillon(Table des matériaux). Utilisez des échantillons dont le nombre d’intégrité de l’ARN (NRI) est supérieur à 8, idéalement plus près de^{9 20} pour construire des bibliothèques d’ADNc.
2. Construisez la bibliothèque et la séquence d’ADNc comme suit.
   1. Construisez des bibliothèques d’ADNc selon le manuel d’instructions de préparation de la bibliothèque (voir discussion).
   2. Déterminer la concentration et la qualité del’ADNc (Table des matières).
   3. Multiplexez les bibliothèques et séquencez-les.

2. Accéder à un cluster d’ordinateurs

REMARQUE: L’analyse de l’ARN-seq nécessite la manipulation de fichiers volumineux et est mieux effectuée sur un cluster informatique(table des matériaux).

1. Connectez-vous au compte de cluster d’ordinateurs à l’aide de la commande ssh username@clusterlocation sur une fenêtre d’application de terminal (Mac) ou PuTTY (Windows).

3. Obtenir des lectures RNA-seq

1. Obtenir des lectures d’ARN-seq à partir de l’installation de séquençage ou, pour les données générées dans une publication, à partir du dépôt de données où elles ont été déposées (3.2 ou 3.3).
2. Pour télécharger des données à partir de référentiels tels que ArrayExpress, procédez comme suit :
   1. Effectuez une recherche sur le site à l’aide du numéro d’adhésion.
   2. Recherchez le lien pour télécharger les données, puis cliquez avec le bouton gauche de la souris et sélectionnez Copier le lien.
   3. Dans la fenêtre du terminal, tapez wget et sélectionnez Coller le lien pour copier les données dans le répertoire à des fins d’analyse.
3. Pour télécharger les données NCBI Short Read Archive (SRA), procédez comme suit :
   1. Sur le terminal, téléchargez SRA Toolkit v. 2.8.1 en utilisant wget.
      Remarque : téléchargement et l’installation de programmes sur le cluster d’ordinateurs peut nécessiter un accès root, contactez l’administrateur de cluster de votre ordinateur si l’installation échoue.
   2. Terminez l’installation du programme en tapant tar -xvf $TARGZFILE.
   3. Recherchez dans NCBI le numéro d’accession SRA pour les échantillons que vous souhaitez télécharger, il devrait avoir le format SRRXXXXXX.
   4. Obtenez les données RNA-seq en tapant [sratoolkit location]/bin/prefetch SRRXXXXXX dans la fenêtre du terminal.
   5. Pour les fichiers appariés, tapez [emplacement du sratoolkit]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX pour obtenir deux fichiers fastq (SRRXXXXXX_1.FASTQ et SRRXXXXXX_2.FASTQ).
      REMARQUE: Pour faire un assemblage Trinity de novo, utilisez la commande [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX

4. Trim adaptateurs et lectures de faible qualité (facultatif)

1. Installez ou chargez Trimmomatic²¹ v. 0.35 sur le cluster informatique.
2. Dans le répertoire où se trouvent les fichiers de données RNA-seq, tapez une commande qui inclut l’emplacement du fichier jar trimmomatic, les fichiers FASTQ d’entrée, les fichiers FASTQ de sortie et des paramètres facultatifs tels que la longueur et la qualité de lecture.
   Remarque : la commande varie en fonction de la qualité brute et souhaitée et la longueur des lectures. Pour illumina 43 bp lit avec les amorces Nextera, nous avons utilisé: java -jar / data / apps / trimmomatic / 0.35 / trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ paired_READ1. FASTQ unpaired_READ1. FASTQ paired_READ2. FASTQ unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.

5. Obtenir l’assemblage de référence

1. Recherchez sur Google, EnsemblGenomes et NCBI Genomes and Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) un génome de référence ou un transcriptome assemblé pour l’espèce d’intérêt(Figure 1).
   REMARQUE : Si un génome de référence ou un transcriptome n’est pas disponible ou de mauvaise qualité, passez à l’ÉTAPE 6 pour générer un assemblage de novo.
2. S’il existe un génome de référence ou un transcriptome assemblé, téléchargez-le sous forme de fichier fasta où l’analyse sera effectuée en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Trouvez le lien pour télécharger le génome, cliquez avec le bouton gauche de la souris et copiez le lien.
   2. Dans la fenêtre du terminal, tapez wget et collez l’adresse du lien. Si disponible, copiez également le fichier GTF et le fichier FASTA des protéines pour le génome de référence.

6. Générer un assemblage de novo (alternative à l’étape 5)

1. Combinez les fichiers fastq RNA-seq READ1 et READ2 pour tous les échantillons en tapant cat *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ et cat *READ2. FASTQ > all_READ2. FASTQ dans la fenêtre du terminal.
2. Installez ou chargez Trinity²² v.2.8.5 sur le cluster informatique.
3. Générer et assemblage en tapant sur le terminal : Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --droite $all_READ2. FASTQ.

7. Lecture de la carte au génome (7.1) ou au transcriptome de novo (7.2)

1. La carte se lit sur le génome de référence en utilisant STAR²³ v. 2.6.0c et RSEM²⁴ v. 1.3.0.
   1. Installez ou chargez STAR v. 2.6.0c. et RSEM v. 1.3.0 au cluster informatique.
   2. Indexer le génome en tapant rsem-prepare-reference --gtf $GENOME. GTF --star -p 16 $GENOME. FASTA $OUTPUT.
   3. Mappez l’expression et calculez l’expression pour chaque exemple en tapant rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ $INDEX $OUTPUT.
   4. Renommez le fichier de résultats en quelque chose de descriptif à l’aide de mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
   5. Générez une matrice de tous les nombres en tapant rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT.
2. Cartographier l’ARN-seq à l’assemblage de novo Trinity à l’aide de RSEM et de nœud papillon.
   1. Installez ou chargez Trinity²² v.2.8.5, Bowtie²⁵ v. 1.0.0 et RSEM v. 1.3.0.
   2. Mappez l’expression de lecture et de calcul pour chaque échantillon en tapant [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY. FASTA --seqType fq --left $READ 1. FASTQ --droite $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --nœud papillon aln_method --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
   3. Renommez le fichier de résultats en quelque chose de descriptif à l’aide de mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
   4. Générez une matrice de tous les nombres en tapant [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[gènes/isoformes].results

8. Identifier les gènes d’intérêt

REMARQUE: Les étapes suivantes peuvent être effectuées avec des fichiers FASTA nucléotidiques ou protéiques, mais fonctionnent mieux et sont plus simples avec des séquences de protéines. BLAST recherche en utilisant des protéines à des protéines est plus susceptible de donner des résultats lors de la recherche entre différentes espèces.

1. Pour un génome de référence, utilisez le fichier FASTA de protéines de STEP 5.2.2 ou consultez Documents supplémentaires pour générer un GTF de caractéristique de gène personnalisé.
2. Pour un transcriptome de novo, générez une protéine FASTA à l’aide de TransDecoder.
   1. Installez ou chargez TransDecoder v. 5.5.0 sur l’ordinateur cluser.
   2. Trouvez le cadre de lecture ouvert le plus long et la séquence peptidique prédite en tapant [Emplacement du transdécodeur]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. FASTA.
3. Recherchez dans NCBI Genbank des homologues sur des espèces étroitement apparentées.
   1. Ouvrez une fenêtre de navigateur Internet et accédez à https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.
   2. Dans la barre de recherche, tapez le nom du gène d’intérêt et le nom des espèces étroitement apparentées qui ont été séquencées ou un genre ou un embranchement. Sur la gauche de la barre de recherche, sélectionnez protéine, puis cliquez sur Rechercher.
   3. Extrayez les séquences en cliquant sur Envoyer à, puis sélectionnez Fichier. Sous Format, sélectionnez FASTA, puis cliquez sur Créer un fichier.
   4. Déplacez le fichier FASTA des homologues vers le cluster d’ordinateurs en tapant scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR dans une fenêtre de terminal local ou utilisez FileZilla pour transférer des fichiers vers et depuis l’ordinateur et le cluster.
4. Recherchez des gènes candidats à l’aide de BLAST+²⁶.
   1. Installez ou chargez BLAST+ v. 2.8.1 sur le cluster d’ordinateurs.
   2. Sur le cluster informatique, faites une base de données BLAST à partir du génome ou du transcriptome traduit la protéine FASTA en tapant [emplacement BLAST+]/makeblastdb -in $PEP. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
   3. BLAST les séquences de gènes homologues de NCBI à la base de données de l’espèce d’intérêt en tapant [emplacement BLAST+]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.
   4. Affichez le fichier de sortie à l’aide de la commande plus. Copiez les ID de gènes uniques de l’espèce d’intérêt dans un nouveau fichier texte.
   5. Extraire les séquences des gènes candidats en tapant perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP. FASTA > $OUTPUT.
5. Confirmez l’annotation des gènes à l’aide de BLAST réciproque.
   1. Sur le navigateur Internet, accédez à https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   2. Sélectionnez tblastn, puis collez les séquences candidates, sélectionnez la base de données des séquences de protéines non redondantes et cliquez sur BLAST.
6. Identifier d’autres gènes en annotant tous les gènes du génome ou du transcriptome avec des termes d’ontologie de gènes (GO) (voir discussion).
   1. Transférez la protéine FASTA sur l’ordinateur local.
   2. Téléchargez et installez Blast2GO^27,28,29 v. 5.2 sur l’ordinateur local.
   3. Ouvrez Blast2GO, cliquez sur Fichier, allez dans Charger, allez dans Charger les séquences, cliquez sur Charger le fichier Fasta (fasta). Sélectionnez le fichier FASTA et cliquez sur Charger.
   4. Cliquez sur Blast, choisissez NCBI Blast, puis cliquez sur Suivant. Modifiez les paramètres ou cliquez sur Suivant, modifiez les paramètres et cliquez sur Exécuter pour trouver la description de gène la plus similaire.
   5. Cliquez sur mappage, puis cliquez sur Exécuter pour rechercher des annotations d’ontologie génétique pour des protéines similaires.
   6. Cliquez ensuite sur interpro, sélectionnez EMBL-EBI InterPro, puis cliquez sur Suivant. Modifiez les paramètres ou cliquez sur Suivant, puis sur Exécuter pour rechercher les signatures de familles de gènes et de domaines connus.
   7. Exportez les annotations en cliquant sur Fichier, sélectionnez Exporter, cliquez sur Exporter la table. Cliquez sur Parcourir, nommez le fichier, cliquez sur Enregistrer, cliquez sur Exporter.
   8. Recherchez dans le tableau d’annotation les termes d’intérêt go pour identifier d’autres gènes candidats. Extraire les séquences du fichier FASTA (STEP 8.4.5)

9. Arbres phylogénétiques

1. Téléchargez et installez MEGA³⁰ v. 7.0.26 sur votre ordinateur local.
2. Ouvrez MEGA, cliquez sur Aligner, cliquez sur Modifier / Construire l’alignement, sélectionnez Créer un nouvel alignement cliquez sur OK, sélectionnez Protéine.
3. Lorsque la fenêtre d’alignement s’ouvre, cliquez sur Modifier, cliquez sur Insérer des séquences à partir du fichier et sélectionnez le FASTA avec des séquences de protéines de gènes candidats et des homologues probables.
4. Sélectionnez toutes les séquences. Trouvez le symbole du bras et survolez-le. Il devrait dire Aligner les séquences en utilisant l’algorithme MUSCLE^31. Cliquez sur le symbole du bras, puis sur Aligner la protéine pour aligner les séquences. Modifiez les paramètres ou cliquez sur OK pour les aligner à l’aide des paramètres par défaut.
5. Inspectez visuellement et apportez les modifications manuelles, puis enregistrez et fermez la fenêtre d’alignement.
6. Dans la fenêtre principale de MEGA, cliquez sur Modèles, cliquez sur Trouver les meilleurs modèles d’ADN / protéines (ML),sélectionnez le fichier d’alignement et sélectionnez les paramètres correspondants tels que: Analyse: Sélection du modèle (ML), Arbre à utiliser: Automatique (arbre voisin), Méthode statistique: Maximum de vraisemblance, Type de substitution: Acide aminé, Traitement des données gap / manquantes: Utiliser tous les sites, Filtre de site de succursale: Aucun.
7. Une fois le meilleur modèle pour les données déterminé, accédez à la fenêtre MEGA principale. Cliquez sur Phylogénie, puis sur Contruct/Test Maximum Likelihood Tree (Arbre de vraisemblance de contruct/test), puis sélectionnez l’alignement, si nécessaire. Sélectionnez les paramètres appropriés pour l’arbre: Méthode statistique: Maximum de vraisemblance, Test de phylogénie: Méthode Bootstrap avec 100 répétitions, type de substitution: acide aminé, modèle: LG avec Freqs. (+F), taux parmi les sites : gamma distribué (G) avec 5 catégories gamma discrètes, traitement des données manquantes:utiliser tous les sites, méthode heuristique ML : Échange du plus proche voisin (NNI).

10. Visualiser l’expression des gènes à l’aide de TPM

1. Pour Trinity, sur le cluster d’ordinateurs, accédez au répertoire où abundance_estimates_to_matrix.pl a été exécuté et l’une des sorties doit être matrice. TPM.not_cross_norm. Transférez ce fichier sur votre ordinateur local.
   Remarque : voir documents supplémentaires pour la normalisation des échantillons croisés.
2. Pour les MTP d’une analyse génomique, suivez les étapes ci-dessous.
   1. Sur le cluster d’ordinateurs, accédez à l’emplacement d’installation RSEM. Copiez rsem-generate-data-matrix en tapant scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix. Utilisez nano pour modifier le nouveau fichier et changer « mon $offsite = 4 » de 4 à 5 pour TPM, il devrait maintenant lire « mon $offsite = 5 ».
3. Accédez au répertoire où se trouvent les fichiers de sortie RSEM .genes.results et utilisez maintenant rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT pour générer une matrice TPM. Transférer les résultats vers un ordinateur local.
4. Visualisez les résultats dans ggplot2.
   1. Téléchargez R v. 4.0.0 et RStudio v. 1.2.1335 sur un ordinateur local.
   2. Ouvrez RStudio à droite de l’écran, accédez à l’onglet Packages et cliquez sur Installer. Tapez ggplot2 et cliquez sur installer.
   3. Dans la fenêtre de script R, lisez dans la table TPM en tapant data<-read.table(« $tpm.txt »,header = T)
   4. Pour les graphiques à barres similaires à la figure 4, tapez quelque chose de similaire à : p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity »)
      fill<-c(« #d7191c »,"#fdae61 », « #ffffbf », « #abd9e9 », « #2c7bb6 »)
      p<-p+scale_fill_manual(values=fill)
      p + thème(axis.text.x = element_text(angle = 90))

Résultats

Les méthodes ci-dessus sont résumées à la figure 1 et ont été appliquées à un ensemble de données de tissus vulgaris Hydra. H. vulgaris est un invertébré d’eau douce qui appartient à l’embranchement Cnidaria qui comprend également des coraux, des méduses et des anémones de mer. H. vulgaris peut se reproduire de manière asexuée par bourgeonnement et ils peuvent régénérer leur tête et leur pied lorsqu’ils sont coupés en deux. Dans...

Discussion

Le but de ce protocole est de fournir un aperçu des étapes pour caractériser une famille de gènes en utilisant des données RNA-seq. Il a été prouvé que ces méthodes fonctionnent pour une variété d’espèces et d’ensembles de données^4,34,35. Le pipeline établi ici a été simplifié et devrait être assez facile à suivre par un novice en bioinformatique. L’importance du protocole est qu’il décrit toutes les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer-DNA kit	Agilent	5067-4626	wet lab materials
Bioanalyzer-RNA kit	Agilent	5067-1513	wet lab materials
BLAST+ v. 2.8.1			On computer cluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (on your PC)			On local computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0			On computer cluster
Bowtie v. 1.0.0			On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Computing cluster (highly recommended)			NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.
Cufflinks v. 2.2.1			On computer cluster
edgeR v. 3.26.8 (in R)			In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0			On computer cluster
Java v. 11.0.2			On computer cluster
MEGA7 (on your PC)			On local computer https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1			On local computer https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II kit	Macherey-Nagel	740955.5	wet lab materials
perl 5.30.3			On computer cluster
python			On computer cluster
Qubit 2.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q32866	wet lab materials
R v.4.0.0			On computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlater	ThermoFisher	AM7021	wet lab materials
RNeasy kit	Qiagen	74104	wet lab materials
RSEM v. 1.3.0			Computer software https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335			On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3			Computer software
SRA Toolkit v. 2.8.1			On computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0c			On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4d			On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0			On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35			On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5			On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzol	ThermoFisher	15596018	wet lab materials
TruSeq RNA Library Prep Kit v2	Illumina	RS-122-2001	wet lab materials
TURBO DNA-free Kit	ThermoFisher	AM1907	wet lab materials
*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.