Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang

Résumé

Nous présentons une méthode (GM-free) génétiquement modifiée pour obtenir des cellules avec un phénotype neuronal des cellules sanguines périphériques reprogrammées. L’activation d’une voie de signalisation liée à une nouvelle protéine humaine liée au GPI révèle une méthode efficace sans OGM pour obtenir des cellules souches pluripotentes humaines.

Résumé

De nombreux troubles neurologiques humains sont causés par la dégénérescence des neurones et des cellules gliales dans le cerveau. En raison des limites des stratégies pharmacologiques et autres stratégies thérapeutiques, il n’y a actuellement aucun remède disponible pour le cerveau blessé ou malade. Le remplacement cellulaire apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour des conditions neurodegenerative. À ce jour, des cellules souches neurales (CSCN) ont été générées avec succès à partir de tissus fœtaux, de cellules embryonnaires humaines (SE) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Un processus de dédifférenciatation a été initié par l’activation de la glycoprotéine GPI-liée humaine nouvelle, qui mène à la génération des cellules souches pluripotentes. Ces cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs) différencient in vitro en cellules avec un phénotype neural comme montré par brightfield et microscopie d’immunofluorescence. L’analyse d’ultrastructure de ces cellules au moyen de la microscopie électronique confirme leur structure primitive aussi bien que neuronal-comme la morphologie et les caractéristiques subcellulaires.

Introduction

Le développement de méthodes de recherche fondamentale et préclinique sur les cellules souches encourage l’application clinique de thérapies à base de cellules souches pour les maladies neurologiques. Une telle thérapie potentielle dépend de manière critique de la méthode de génération de cellules neurales humaines conduisant à la récupération fonctionnelle¹.

Les cellules souches neurales (CNS) s’auto-renouvellent et se différencient en nouveaux neurones tout au long de la vie dans un processus appelé neurogenèse adulte. Seules les zones cérébrales très restreintes abritent des NSC compétents pour générer des neurones nouveau-nés à l’âge adulte. Ces NSCs peuvent donner naissance à des neurones matures, qui sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire, remplaçant ainsi les neurones perdus ou endommagés. Malheureusement, ces NSC sont présents en quantités restreintes et cette neurogenèse limitée diminue rapidement au cours du développement juvénile². Par conséquent, d’autres sources de cellules neurales doivent être considérées dans un objectif de thérapie cellulaire.

Les maladies neurologiques dégénératives sont difficiles à guérir en utilisant des approches pharmacologiques standard. De nouvelles stratégies thérapeutiques pour embrasser de nombreux troubles neurologiques immédicables sont basées sur des thérapies de remplacement cellulaire de tissus malades et blessés. La transplantation de NSC pourrait remplacer les cellules endommagées et fournir des bienfaits. D’autres sources de remplacement des cellules neurales comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (ESC), qui sont dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes mammifères³, ainsi que les cspi⁴, qui ont une grande capacité d’auto-renouvellement comme les CSE et sont capables de se différencier en diverses lignées cellulaires. Les NSC peuvent également être générés par reprogrammation directe à partir de fibroblastes humains évitant l’état pluripotent^5.

La thérapie de remplacement cellulaire est toujours un problème difficile. Bien que l’ESC, le fœtus ou l’iPS puissent être une source de génération de cellules neuronales pour traiter de nombreuses maladies neurologiques incurables, le remplacement autologue des cellules de SC adultes des tissus endommagés est une meilleure alternative qui contourne les préoccupations immunologiques, éthiques et de sécurité.

L’activation de la protéine humaine liée au GPI par réticulation d’anticorps via la phosphorylation de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN déclenche une dédifférenciatation des cellules progénitrices sanguines et la génération de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs)^6. Ces cellules différencient in vitro vers les cellules neuronales comme confirmé au moyen de brightfield, d’immunofluorescence et d’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM).

Dans ce travail nous décrivons la génération GM-libre de BD-PSCs et leur re-différenciation réussie en cellules avec le phénotype neuronal.

Protocole

Des approbations éthiques ont été obtenues lors de la réalisation des expériences.

1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMNCs)

1. S’assurer que tous les donneurs ont signé un consentement éclairé avant le prélèvement sanguin conformément aux lignes directrices de l’établissement.
2. Prendre 30 ml de sang de donneurs sains par un personnel médical qualifié selon le protocole standard.
3. Isolez les PBMNCs par support de gradient de densité. Utiliser 10 mL de milieux avec 25 mL de sang 1:1 dilué avec une solution saline tampon phosphate (PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 30 min.
4. Isoler la couche interphase entre le plasma et le gradient de densité par pipetage. Laver les cellules isolées avec 5 mL de PBS stérile et centrifuger à 300 x g pendant 10 min. Répéter deux fois.
5. Comptez le nombre de cellules par des méthodes standard à l’aide d’une chambre de comptage.

2. Activation de la glycoprotéine humaine ancrée dans le GPI par réticulation d’anticorps à la surface des PBMNCs

1. Placer les cellules mononucléaires (MNCs) de 6 x^{10 6} dans des tubes de 15 mL et effectuer la réticulation des anticorps en incubant les cellules avec de l’anticorps spécifique à la protéine membranaire lié au GPI humain (30 μg/mL) pendant 30 min dans du PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) à 37 °C.
2. Remplacer le milieu d’incubation par le milieu modifié de Dulbecco d’Iscove complété par 10 % de sérum fœtal bovin (SBF).
3. Cultiver les cellules dans des tubes de polystyrène de 15 mL, mettre les tubes dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 8-10 jours (sans secouer). Sur D5, ajoutez 1 à 2 mL supplémentaires de milieu d’Iscove complété par 10 % de FBS à chaque tube de 15 mL.

3. Tri des cellules dédifférenciées nouvellement générées

1. Comptez les cellules avec un compteur cellulaire automatisé (suspension cellulaire de 18 μL + colorant de fluorescence de 2 μL) ou dans une chambre de comptage.
2. Suspension cellulaire cultivée en centrifugeuse (5-7 x^{10 6)}à 300 x g pendant 10 min et aspirer le surnageant résultant avec une pipette Pasteur stérile.
3. Re-suspendre la pastille cellulaire dans 90 μL de PBS pré-refroidi pH 7,2, 0,5% BSA et 2 mM EDTA.
4. Ajouter des billes magnétiques cd45 positives de taille nanométrique (80 μL) à la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 15 min.
5. Laver les cellules en ajoutant 2 mL de tampon PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
6. Suspendre à nouveau les cellules dans 500 μL de tampon PBS.
7. Laver la colonne avec 500 μL de tampon PBS pré-refroidi et la placer dans le champ magnétique.
8. Placez la suspension cellulaire sur la colonne et lavez-la avec 500 μL de tampon PBS (deux fois) et le flux de centrifugeuse contenant des cellules CD45 négatives. Collectez-les dans le support d’Iscove complété par 1% BSA.
9. Comptez les cellules dans la chambre de comptage.

4. Préparation de plats de culture cellulaire pour la différenciation neuronale des cellules souches nouvellement générées

1. Enrober les vaisseaux de culture de poly-L-ornithine et de laminine pour la croissance des cellules neuronales.
2. Placer les lamelles de verre dans des plaques à 4 puits et les recouvrir de poly-L-ornithine diluée à 1:5 (0,1 mg/mL dans du_ddH2O)dans du ddH_2O.Placer les lamelles dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h. Puis laver avec_ddH2O.
3. Décongeler lentement la laminine (0,5-2,0 mg/mL) et ajouter au sommet des lamaux de couverture. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
4. Préparer le milieu d’induction neuronale N2 composé de 49 mL de D-MEM/F12, de 500 μL de supplément de N2, de 400 μL d’acides aminés non essentiels (NEAA), de solution de FGF de base à une concentration finale de 20 ng/mL (préparée à partir d’une solution mère de 100 μg/mL) et d’héparine à une concentration finale de 2 ng/mL.
5. Éliminer l’excès de laminine par pipetage et ajouter le milieu neuronal N2 aux plats de culture.

5. Culture de cellules sanguines dédifférenciées neuronales

1. Culture de cellules CD45 négatives dérivées de BD sur des lamives de verre recouvertes de laminine/ornithine pendant 2 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % de_CO2 dans le milieu N2 pour initier une différenciation neuronale des cellules nouvellement générées par BD.
2. Cellules de culture supplémentaires dans un milieu de différenciation neuronale composé de 48 mL de milieu neurobasal, 500 μL de L-glutamine, 1 mL de supplément de B27, 500 μL de NEAA, 50 μL de facteur neurotrophique (GDNF) humain recombinant dérivé de glial (GDNF) à 5 μg/250 μL dans PBS/0,1% BSA, et 50 μL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau humain recombinant (BDNF) à 5 μg/200 μL dans PBS/0,1% BSA et 50 μL de solution d’acide ascorbique 2,9 g/50 mL dans PBS. Placer les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5 % de_CO2.

6. Analyse par microscopie à immunofluorescence de cellules neurales dérivées du sang

1. Culturez les cellules comme décrit ci-dessus pendant 16 jours et retirez le milieu.
   1. Incuber avec un fixateur préchauffé composé de 75 mL d’eau stérile, 4 g de paraformaldéhyde. Ajouter 10 N NaOH au besoin et remuer jusqu’à ce que la solution se dégage. Ajouter ensuite 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL de_MgCl2, 2 mL d’EGTA 0,5 M et 4 g de saccharose. Titrer à pH 7,4 avec 6 N HCl, et porter à 100 mL d’eau stérile pendant 15 min, selon Marchenko et al.⁷.
   2. Jetez le fixateur et lavez les cellules 3 fois pendant 5 min à chaque fois. Ajoutez immédiatement une solution X de Triton à 0,3% fraîchement faite et perméabilisez les cellules pendant 5 min. Laver 3 fois avec du PBS et ajouter une solution de blocage faite par PBS et BSA à 5%.
   3. Bloquer les cellules à température ambiante sur une plaque à bascule pendant 1 heure.
   4. Préparer une dilution appropriée des anticorps dans 1 % de BSA/PBS et incuber les cellules avec des dilutions d’anticorps sur la plaque bascule pendant 1,5 h à température ambiante. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacune, incuber les cellules avec du DAPI et montez les lamures avec un support de montage pour la visualisation au microscope.
      REMARQUE : Les anticorps directement marqués utilisés dans cette expérience sont énumérés dans la table des matériaux.

7. Analyse par microscopie électronique à transmission de cellules nouvellement générées

1. Ensemencez les cellules pour TEM dans des lames de chambre à 8 puits.
2. Fixer les cellules dans du glutaraldéhyde à 3,5 % pendant 1 h à 37 °C, post-fixer dans 2 %_OsO4 pendant une heure supplémentaire à température ambiante et colorer dans 2 % d’acétate d’uranyle dans l’obscurité à 4 °C pendant 2 h 30 min.
3. Enfin, rincez les cellules dans de l’eau distillée, déshydratez-les dans de l’éthanol et incorporez-les dans de la résine époxy pendant la nuit. Le lendemain, transférer les échantillons dans une étuve à 70 °C pendant 72 h pour le durcissement de la résine.
4. Détachez les cultures cellulaires incorporées de la lame de chambre et de la colle vers des blocs d’araldite.
5. Couper des sections semi-minces en série (1,5 μm) avec une machine, les monter sur des lames de verre et colorer légèrement avec 1% de bleu de toluidine.
6. Collez les sections semi-minces sélectionnées en blocs d’araldite et détachez-les de la lame de verre par congélation répétée (dans de l’azote liquide) et décongélation.
7. Préparer des sections ultramin inthes (0,06-0,08 μm) avec une machine et contraster davantage avec le citrate de plomb.
8. Obtenez des micrographies à l’aide d’un microscope à balayage électronique avec appareil photo numérique.

Résultats

Les résultats fournissent la preuve que cette nouvelle méthode sans OGM est capable de rétablir les cellules progénitrices du sang à leur état le plus primitif sans agir directement sur le génome humain.

Nous avons précédemment montré que la réticulation des anticorps spécifiques aux protéines liées au GPI initie via la régulation à la hausse PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN de gènes hautement conservés pertinents pour le développement tels que WNT, NOTCH et C-Kit, initiant...

Discussion

La méthode non-GM de reprogrammation des cellules humaines décrite dans ce travail est basée sur l’activation de membrane à noyau de la ou des machines de signalisation derrière la glycoprotéine de membrane humaine liée au GPI qui initie le processus de dédifférenciatation menant à la génération ex vivo et à l’expansion de PSCs autorenouvants obtenus à partir de sang périphérique humain non manipulé. Ces cellules, lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux appropriés, sont capables de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400