Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Résumé

Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Résumé

Le phénotype cellulaire peut être inversé ou modifié avec différentes méthodes, avec des avantages et des limites spécifiques à chaque technique. Nous décrivons ici une nouvelle stratégie qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Deux étapes principales sont nécessaires. Dans un premier temps, les cellules matures adultes (différenciées en phase terminale) sont exposées à la gomme épigénétique 5-aza-cytidine pour les conduire dans un état pluripotent. Cette partie du protocole a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes épigénétiques contrôlant le devenir et la différenciation cellulaires, et implique l’utilisation du modificateur épigénétique pour effacer l’état différencié cellulaire, puis conduire dans une fenêtre transitoire de haute plasticité.

Dans la deuxième étape, les cellules effacées sont encapsulées dans des micro-bioréacteurs en polytétrafluoroéthylène (PTFE), également connus sous le nom de marbres liquides, pour favoriser le réarrangement cellulaire 3D afin d’étendre et de maintenir de manière stable la haute plasticité acquise. Le PTFE est un composé synthétique hydrophobe non réactif et son utilisation permet la création d’un microenvironnement cellulaire, ce qui ne peut être réalisé dans les systèmes de culture 2D traditionnels. Ce système encourage et stimule le maintien de la pluripotence grâce à des indices liés à la biomécanosension.

Les procédures techniques décrites ici sont des stratégies simples pour permettre l’induction et le maintien d’un état de plasticité élevé dans les cellules somatiques adultes. Le protocole a permis la dérivation de cellules à haute plasticité chez toutes les espèces de mammifères testées. Comme il n’implique pas l’utilisation de la transfection de gènes et qu’il est exempt de vecteurs viraux, il peut représenter une avancée technologique notable pour les applications de médecine translationnelle. En outre, le système de micro-bioréacteur fournit une avancée notable dans la technologie organoïde des cellules souches en recréant in vitro un micro-environnement spécifique qui permet la culture à long terme de cellules à haute plasticité, à savoir en tant que CSE, csi, cellules épigénétiquement effacées et CSM.

Introduction

Au cours des dernières décennies, le concept largement accepté de progression unidirectionnelle vers l’engagement et la différenciation cellulaires a été complètement révisé. Il a été démontré que la spécification cellulaire peut être inversée et qu’une cellule différenciée en phase terminale peut être poussée vers un état permissif moins engagé et plus élevé, en utilisant différentes méthodes.

Parmi les nombreuses méthodes proposées, l’une des plus prometteuses consiste à utiliser des composés chimiques pour induire les cellules dans une pluripotence dite induite chimiquement. Les petites molécules utilisées dans cette approche sont capables d’interagir et de modifier la signature épigénétique d’une cellule mature adulte, évitant ainsi le besoin de tout vecteur transgénique et/ou viral ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10} . De nombreuses études ont récemment montré qu’il est possible de passer de cellules d’un phénotype à un autre en fournissant des stimuli biochimiques et biologiques spécifiques qui induisent la réactivation des gènes hyperméthylés ^{11,12,13,14,15}. Ces événements de déméthylation permettent la conversion de cellules différenciées en phase terminale en un progéniteur primitif, une cellule multipotente ou une cellule à haute plasticité/pluripotente ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}.

Parallèlement, de nombreuses études se sont récemment concentrées sur la compréhension des indices liés à la mécanosension et, plus spécifiquement, sur la possibilité d’utiliser des forces mécaniques pour influencer directement la plasticité cellulaire et/ou la différenciation 16,17,18,19. En effet, il a été clairement démontré que la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle clé dans le contrôle du devenir cellulaire. En particulier, les signaux biomécaniques et biophysiques produits par l’ECM régulent directement les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation, influençant le comportement et les fonctions cellulaires^20,21. Ces données récentes ont ouvert la voie au développement de nouveaux systèmes de culture 3D qui imitent plus étroitement le microenvironnement cellulaire in vivo, reproduisant des stimuli mécaniques et physiques qui déterminent le comportement cellulaire.

Nous décrivons ici un protocole en deux étapes qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Dans la première étape, les cellules sont incubées avec la molécule déméthylante 5-aza-cytidine (5-aza-CR). Cet agent est capable d’induire une déméthylation globale significative de l’ADN grâce à un effet combiné de l’action ^8,10 médiée par la translocation directe^dix-onze (TET2) et de l’inhibition indirecte des ADN méthyltransférases (DNMT)^22,23. Cette étape induit l’élimination des blocs épigénétiques avec une réactivation ultérieure de l’expression génique liée à la pluripotence et, par conséquent, la génération de cellules à haute plasticité 1,2,3,8,10, ci-après dénommées « cellules épigénétiquement effacées ». Dans la deuxième étape, les cellules sont encapsulées dans un système de culture 3D. À cette fin, le composé synthétique hydrophobe non réactif polytétrafluoroéthylène (PTFE; avec une taille de particule de 1 μm) est utilisé comme micro-bioréacteur, ce qui permet la création d’un microenvironnement cellulaire irréalisable grâce à l’utilisation de systèmes de culture 2D traditionnels¹⁰. Les particules de poudre de PTFE adhèrent à la surface de la goutte de liquide dans laquelle les cellules sont remises en suspension et isolent le noyau liquide de la surface de support, tout en permettant l’échange de gaz entre le liquide intérieur et l’environnement environnant²⁴. Le « micro-bioréacteur PTFE » ainsi obtenu, également connu sous le nom de « marbre liquide », encourage les cellules à interagir librement les unes avec les autres, favorisant le réarrangement cellulaire 3D ^25,26,27, et étend et maintient de manière stable l’état de plasticité élevé acquis grâce à des indices liés à la biomécanosension¹⁰.

Protocole

Toutes les études ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Milan. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publié par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis. L’isolement des cellules humaines d’individus adultes en bonne santé a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Toutes les méthodes de notre étude ont été réalisées conformément aux directives approuvées.

1. Isolement des fibroblastes cutanés

REMARQUE: Toutes les procédures décrites ci-dessous peuvent être appliquées à des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, y compris la souris, le porc et l’homme. Des cellules murines ont été isolées sur des souris mâles âgées de 7 semaines et des tissus cutanés porcins ont été prélevés à l’abattoir local. Des cellules humaines ont été isolées de patients adultes, après consentement éclairé écrit.

1. Préparer une solution de gélatine porcine à 0,1%.
   1. Peser 0,1 g de gélatine porcine et la dissoudre dans 100 mL d’eau. Stériliser la solution de gélatine par autoclavage avant utilisation.
   2. Enduire la boîte de Petri de 35 mm de gélatine porcine à 0,1% en ajoutant 1,5 mL de la solution préparée. Incuber pendant 2 h à température ambiante.
2. Coupez des biopsies cutanées de mammifères (souris, porcins et humains) d’environ 2 à 5 cm de long et placez-les dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco contenant 2% de solution antibiotique antimycotique. Conserver à + 4 °C jusqu’à utilisation.
   NOTE: Les prélèvements de biopsie doivent être effectués en accord et après approbation du comité d’éthique, conformément aux lignes directrices établies.
3. Lavez abondamment les biopsies prélevées trois fois dans du PBS stérile frais contenant 2% de solution antibiotique antimycotique.
4. Prélever les biopsies du dernier lavage et les placer dans une boîte de Petri stérile de 100 mm. Utilisez un scalpel stérile pour les couper en morceaux d’environ 2 mm³ .
5. À la fin de 2 h d’incubation, retirer l’excès de solution de gélatine de la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.1.2) et, à l’aide d’une pince chirurgicale stérile, placer immédiatement 5 à 6 fragments de peau dans chaque boîte de culture pré-enduite.
6. Mouiller les fragments en ajoutant 100 μL de gouttelettes de milieu isolant de fibroblastes (tableau 1) sur chacun d’eux. Culture à 37 °C dans un incubateur à_{CO 2 à} 5 %.
   REMARQUE: Pour empêcher l’évaporation du milieu, placez la boîte de Petri de 35 mm dans une boîte de Petri de 100 mm ou plus contenant de l’eau stérile. Assurez-vous de boucher les deux boîtes de Pétri.
7. Après 24 h de culture, vérifiez la quantité du milieu dans la boîte de Petri de culture de 35 mm. Si nécessaire, ajoutez 500 μL de milieu d’isolement des fibroblastes pour garder les fragments humides.
8. Retirez soigneusement le milieu et rafraîchissez-le au moins tous les 2 jours de culture à l’aide d’une pipette.
9. Lorsque les fibroblastes commencent à se développer à partir des fragments de peau placés dans la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.5.) et commencent à former une monocouche cellulaire (généralement 6 jours). Enlever les morceaux de peau à l’aide d’une pince chirurgicale stérile et les cultiver dans 2 mL de milieu isolant fibroblastique.
10. Continuer à cultiver la monocouche cellulaire à 37 °C dans un incubateur à 5 % de_CO2 jusqu’à 80 % de confluence et rafraîchir le milieu tous les deux jours.

2. Culture de lignées cellulaires primaires de fibroblastes

1. Lorsque les fibroblastes atteignent 80% de confluence, retirez soigneusement le milieu d’isolement des fibroblastes et lavez les cellules trois fois avec 3 mL de PBS contenant 1% de solution antibiotique antimycotique.
2. Pour le détachement cellulaire, ajouter 600 μL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la boîte de culture et incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min.
3. Ajouter 5,4 mL de milieu de culture de fibroblastes pour neutraliser la trypsine lorsque les cellules commencent à se détacher de la boîte de culture (tableau 1).
4. Déloger les cellules par pipetage répété et doux. Cellules de plaque dans de nouveaux plats de culture (sans gélatine), en maintenant le rapport de passage entre 1:2 et 1:4 (selon le taux de croissance).
   REMARQUE: La centrifugation n’est pas nécessaire.
5. Maintenir les cellules en culture et changer de milieu tous les 2 jours, jusqu’à ce qu’elles aient atteint 80% de confluence et les passent.
   REMARQUE: Propager les fibroblastes deux fois par semaine pour maintenir une croissance vigoureuse.

3. Exposition aux fibroblastes au 5-aza-CR

1. Préparer une solution mère fraîche de 1 mM 5-aza-CR.
   1. Peser 2,44 mg de 5-aza-CR et le dissoudre dans 10 mL de glucose élevé DMEM. Resuspendez la poudre par vortex. Stériliser la solution avec un filtre de 0,22 μm.
      REMARQUE: La solution mère de 5-aza-CR doit être préparée immédiatement avant utilisation.
   2. Préparer la solution de travail 5-aza-CR en diluant 1 μL de solution mère 5-aza-CR (3.1.1.) dans 1 mL de milieu de culture de fibroblastes.
      REMARQUE: La concentration de la solution de travail 5-aza-CR est de 1 μM 1,2,3,8,9.
2. Trypsiniser les cellules comme décrit précédemment (2.1.-2.3.) et déloger les cellules en les piquant de manière répétée et douce.
3. Recueillir la suspension cellulaire et la transférer dans un tube conique.
4. Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage sous un microscope optique à température ambiante. Calculer le volume de milieu nécessaire pour remettre en suspension les cellules afin d’obtenir 4 x 10⁴ cellules dans 30 μL de milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.).
   REMARQUE: La formule à utiliser dépend du type spécifique de chambre.
   
5. Centrifuger la suspension de la cellule à 150 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec le milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.). Pour le volume du milieu de culture de fibroblastes à utiliser, voir l’étape 3.4.
   REMARQUE: Comme témoin négatif, remettre en suspension les cellules à la même concentration dans un milieu de culture de fibroblastes sans 5-aza-CR et procéder à l’encapsulation cellulaire dans de la poudre de PTFE (étape 4.1.-4.13.).

4. Encapsulation des fibroblastes dans des micro-bioréacteurs en PTFE

1. Remplir une boîte de Petri de 35 mm avec de la poudre de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour produire un lit (Figure 1A).
   REMARQUE: Utilisez des boîtes de Petri bactériologiques de 35 mm pour éviter l’adhérence du marbre liquide. Afin d’obtenir une fine coquille hydrophobe et poreuse, utilisez une poudre de PTFE d’une taille moyenne de particules de 1 μm et produite avec un broyage maximal de 2,0 NPIRI. Cela permet la création de billes liquides perméables au gaz. En outre, le revêtement translucide facilite l’observation des processus d’agrégation cellulaire en temps réel Une plus grande taille des particules conduit à une polydispersité élevée qui peut provoquer une évaporation élevée, une déformation et une perte de la forme sphérique, ainsi que la dissolution prématurée des micro-bioréacteurs.
2. Distribuer 30 μL de gouttelette simple contenant 4 x 10⁴ cellules (voir étapes 3.4.- 3.5.) sur le lit de poudre (Figure 1B).
3. Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour vous assurer que la poudre PFTE recouvre entièrement la surface de la goutte liquide pour former un micro-bioréacteur en marbre liquide (Figure 1C).
4. Récupérez le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupée sur le bord, pour s’adapter au diamètre du marbre (Figure 1D,E). Plaquer le micro-bioréacteur en marbre liquide sur une boîte de Petri bactériologique propre pour le stabiliser (Figure 1F).
   REMARQUE: Pour créer un frottement pour saisir le marbre à l’intérieur de la pointe, coupez les embouts de la pipette d’un diamètre environ légèrement inférieur au diamètre du marbre liquide.
5. Transférer le micro-bioréacteur en marbre liquide de la boîte de Petri dans une plaque de 96 puits (une bille/puits) (Figure 1G).
6. Ajouter lentement 100 μL de milieu à partir de la marge du puits. Le micro-bioréacteur commence à flotter sur le support (Figure 1H).
   REMARQUE: Le micro-bioréacteur se brise en contact direct avec le liquide, en raison de la perturbation de l’hydrophobicité du PTFE. Comme approche alternative, les micro-bioréacteurs en marbre liquide peuvent être placés individuellement dans une boîte de culture bactériologique de 35 mm. Dans ce cas, afin d’éviter l’évaporation du marbre liquide, la boîte de Petri de 35 mm contenant le micro-bioréacteur doit être insérée dans une boîte de Petri de 100 mm, préalablement alicitée avec de l’eau stérile
7. Incuber un micro-bioréacteur en marbre liquide pendant 18 h à 37 °C dans un incubateur_{à CO 2 à} 5 % 1,2,3,8,9.
   REMARQUE: La taille des particules de PTFE de 1 μm peut assurer un échange gazeux optimal entre le liquide intérieur et l’environnement environnant.
8. Après une incubation de 5-aza-CR pendant 18 h, prélever le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL coupée sur le bord (voir étape 4.5).
9. Placez le micro-bioréacteur dans une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm (Figure 1D-F).
10. Utilisez une aiguille pour percer le marbre liquide et le casser.
11. Récupérer les sphéroïdes formés à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupés au bord, sous un stéréomicroscope (Figure 1I,J).
    REMARQUE: Les cellules épigénétiquement effacées encapsulées dans du PTFE forment une structure sphérique 3D (un agrégat dans chaque marbre liquide).
12. Pour évaluer l’acquisition de l’état pluripotent en réponse au 5-aza-CR, vérifiez l’apparition de l’expression génique liée à la pluripotence, OCT4, NANOG, REX1 et SOX2, par PCR qualitative (tableau 2).
13. Passez à la deuxième étape du protocole comme décrit ci-dessous.

5. Culture dans des micro-bioréacteurs en PTFE de cellules épigénétiquement effacées

1. Préparer un milieu de culture ESC frais (tableau 1).
2. Transférer des organoïdes dans une boîte de Petri contenant un milieu ESC pour le lavage des résidus de 5-aza-CR (voir étapes 5.1.-5.2.).
3. Préparez une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm contenant du lit de poudre de PTFE (voir aussi l’étape 4.1.).
4. Distribuer un seul organoïde dans une gouttelette de milieu de culture ESC de 30 μL sur le lit de poudre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupée au bord (voir étapes 4.9.; 5.3.).
5. Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour former un nouveau micro-bioréacteur en marbre liquide, ramassez-la à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupez-la sur le bord et placez le micro-bioréacteur nouvellement formé dans un puits de plaque de 96 puits (un marbre / puits) (voir les étapes 4.3.-4.6.).
6. Pour faire flotter les micro-bioréacteurs, ajouter 100 μL de milieu à partir de la marge du puits pour baigner lentement le marbre (voir note 4.7.).
7. Cultivez des micro-bioréacteurs en marbre liquide à 37 °C dans un incubateur à_{CO 2 à} 5 % aussi longtemps que nécessaire. Changez de support tous les deux jours, en suivant la procédure décrite aux points 5.3.-5.7.
   NOTE: Dans le présent manuscrit, les résultats obtenus avec la culture d’organoïdes pendant 28 jours sont fournis. Cependant, si nécessaire, une période de culture plus longue peut être effectuée.

Résultats

Le présent protocole décrit toutes les étapes à effectuer pour générer et maintenir de manière stable les cellules pluripotentes de mammifères à partir de cellules somatiques adultes. Cette méthode a été couronnée de succès avec des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, à savoir la souris, le porc et l’homme. Les résultats représentatifs rapportés ici sont obtenus à partir de toutes les lignées cellulaires, indépendamment de l’espèce d’origine.

Discussion

Au cours des dernières décennies, plusieurs études se sont concentrées sur le développement de stratégies pour ramener une cellule différenciée en phase terminale vers un état permissif moins engagé et plus élevé. Le protocole décrit ici permet la génération et le maintien à long terme de cellules pluripotentes à partir de cellules matures matures différenciées en phase terminale. La méthode combine deux étapes indépendantes qui impliquent l’induction d’un état permissif élevé qui est obtenu ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Component of ESC medium
5-Azacytidine	Sigma-Aldrich	A2385	5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	Component of nucleoside mix for ESC medium
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	Component of fibroblast and ESC media
CFX96 Real-Time PCR	Bio-Rad Laboratories	NA	Thermal cycler for quantitative PCR
Cytidine	Sigma-Aldrich	C4654	Component of nucleoside mix for ESC medium
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	41966052	For fibroblast isolation and culture medium
DMEM, low glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	31885023	For ESC medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	61021	mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Sigma-Aldrich	ESG1106	Component of ESC medium
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	10500064	Component of fibroblast and ESC media
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Component of ESC medium
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	For dish coating
GeneAmp PCR System 2700	Applied Biosystems	NA	Thermal cycler for qualitative PCR
Global DNA Methylation ELISA Kit	CELL BIOLABS	STA-380	Methylation study
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7801	Qualitative PCR
Guanosine	Sigma-Aldrich	G6264	Component of nucleoside mix for ESC medium
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31550031	For ESC medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Component of ESC medium
KOVA glasstic slide 10 with grids	Hycor Biomedical	87144	For cell counting
Leica MZ APO Stereo Microscope	Leica	NA	For organoid observation
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Component of fibroblast and ESC media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140035	Component of ESC medium
Millex-GS 0.22 µm pore filters	Millipore	SLGS033SB	For solution sterilization
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant	Promega	M3681	mRNA reverse transcription
Multiskan FC Microplate Photometer	Thermo Fisher Scientific	51119000	For ELISA plate reading
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope	Nikon	NA	For cell observation
Perkin Elmer Thermal Cycler 480	Perkin Elmer	NA	Thermal cycler for reverse transcription
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size	Sigma-Aldrich	430935	For generating micro-bioreactor
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	Genomic DNA estraction
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1728	Quantitative PCR
Thymidine	Sigma-Aldrich	T1895	Component of nucleoside mix for ESC medium
Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard	Sarstedt	833902	For fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard	Sarstedt	833900	For Fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension	Sarstedt	833900500	Bacteriology petri dish for liquid marble culture
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F	Sarstedt	833924005	For liquid marble culture
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924	For fibroblast dissociation
Tube 15ml, 120x17mm, PS	Sarstedt	62553041	For cell suspension centrifugation
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003	Component of nucleoside mix for ESC medium