Analyses de la maladie de la pourriture des racines sèches chez les pois chiches : une méthodologie détaillée

Résumé

Cette étude présente des méthodologies pour étudier les mécanismes pathomorphologiques et moléculaires sous-jacents à l’interaction entre le pois chiches etla rhizoctonia bataticola. La méthode du papier buvard est utile pour étudier rapidement les réponses du génotype de pois chiches, tandis que la méthode à base de pot malade peut être utilisée pour imposer simultanément la sécheresse et l’infection à R. bataticola et dépister les génotypes tolérants.

Résumé

La maladie de la pourriture sèche des racines (DRR) est une menace émergente pour le stress biotique pour la culture des pois chiches dans le monde entier. Elle est causée par un pathogène fongique transmis par le sol, Rhizoctonia bataticola. Dans la littérature, les protocoles complets et détaillés étape par étape sur des analyses de maladie sont clairsemés. Cet article fournit des détails complets sur les étapes impliquées dans la mise en place d’une technique de papier buvard pour le dépistage rapide des génotypes pour la résistance à la DRR. La technique du papier buvard est facile et moins coûteuse. Une autre méthode, basée sur l’approche du pot malade, est un mimétisme de l’infection naturelle et peut être appliquée pour étudier les composants en interaction - plante, agent pathogène et environnement - impliqués dans le triangle de la maladie.

De plus, dans la nature, le DRR se produit principalement dans les zones de culture des pois chiches plu la pluie, où l’humidité du sol recule à mesure que la croissance des cultures progresse. Le stress dû à la sécheresse est connu pour prédisposer les plants de pois chiches à la maladie de DRR. La compréhension pathomorphologique et moléculaire de l’interaction plante-pathogène sous le stress dû à la sécheresse peut ouvrir la voie à l’identification de variétés d’élite résistantes au DRR à partir du bassin de germplasmes de pois chiches. Cet article fournit une méthodologie stepwise pour la préparation d’un pot malade et l’essai suivant de maladie. Dans l’ensemble, l’information présentée ci-après aidera les chercheurs à préparer l’inoculum fongique R. bataticola, à maintenir cet agent pathogène, à mettre en place la technique du papier buvard, à préparer la culture malade et le pot malade, et à évaluer l’infection pathogène chez les plantes de pois chiches.

Introduction

La pourriture sèche des racines (DRR) est l’une des maladies économiquement significatives chez les pois^{chiches 1,2}. Il s’agit d’une maladie spécifique aux racines causée par Rhizoctonia bataticola (télomorphe, Macrophomina phaseolina). Les plantes infectées n’ont pas de racines latérales et possèdent des taproots cassants et un feuillage^{jaune 1,3}. DRR sous le stress de sécheresse a été rapporté pour être une menace émergente pour la culture de pois^{chiches 1,2,3}. En outre, l’incidence du DRR serait aggravée par le stress dû à la sécheresse sur le^{terrain 1,2,3}. Le DRR est plus répandu dans les zones plu pleuvoir que dans les champs irrigués⁴. L’utilisation de variétés résistantes est le moyen de surmonter la maladie et de contourner l’utilisation de fongicides^1,13. Étant donné que le germplasme de pois chiches disponible dans le monde entier abrite des variations génétiques pour le caractère^5,le dépistage et l’identification des génotypes résistants/sensibles sont essentiels à la sélection moléculaire pour l’amélioration des cultures.

Des analyses robustes, faciles et rentables de la maladie sont essentielles pour étudier les modèles d’infection à R. bataticola chez les pois chiches. L’analyse primaire de la maladie utilisée pour observer la réponse des génotypes de pois chiches à l’infection à R. bataticola est la technique du papier buvard^1,4. Il s’agit d’une technique simple qui peut être exécutée à l’aide d’inoculum fongique liquide, de semis aux racines et de papier buvard stérile. Cependant, cette technique n’a pas été utilisée à son maximum parce qu’aucun protocole étape par étape n’est disponible dans la littérature.

Pendant ce temps, la technique du pot malade implique la préparation d’une culture malade potentielle et l’imposition du stress dû à la sécheresse. Étant donné que le stress dû à la sécheresse aggrave l’incidence de la maladie de DRR³, il est essentiel d’étudier l’interaction plante-pathogène sous le stress^{dû à la sécheresse 6,7}. La technique du pot malade fournit la plate-forme pour une telle étude simultanée, favorisant de meilleures possibilités pour le criblage de germplasme et comprenant la base mécaniste de l’interaction. Les changements pathomorphologiques tels qu’une augmentation de la longueur des racines et la réduction du nombre de racines latérales — inhérentes à la maladie du DRR — peuvent être abordés à l’aide de la technique du pot^{malade 1,3,7}.

Dans ce cas, un protocole détaillé pour le papier buvard et les techniques de pot malade, qui peut être utilisé pour étudier l’interaction entre les pois chiches et R. bataticola et le germplasme de pois chiches, est présenté. Les détails des matériaux utilisés dans l’étude sont donnés dans le Tableau des matériaux.

Protocole

1. Isolement de R. bataticola et stockage

1. Détails du génotype de pois chiches et des symptômes du DRR
   1. Utilisez des plants de pois chiches (génotype, JG 62) qui présentent généralement des symptômes typiques de DRR, tels que la racine primaire sèche et cassante sans racines latérales et microscléotie sous l’écorce et à l’intérieur du pith^1,3.
2. Collecte et lavage
   1. Plantes déracinées présentant des symptômes tels que le foliar sec de couleur paille et la racine primaire cassante avec microscléotie sous la couche épiderme. Pendant le déracinement, une grande partie des racines resteront à l’intérieur du sol car les racines infectées sont cassantes. Enlever les débris grossiers du sol attachés à la racine. Coupez les racines séparément et recueillez-les dans des enveloppes en papier (27,5 cm x 12 cm) avec l’étiquette appropriée et placez-les dans une boîte de collecte d’échantillons.
   2. Après avoir transporté des échantillons au laboratoire, placez les racines dans un bécher de 200 mL et couvrez-les de maille (maille en nylon de la taille du pore de 3 mm de diamètre) et lavez soigneusement les racines avec de l’eau courante du robinet pour éliminer les particules de sol adhérentes.
   3. Utilisez de l’eau d’osmose inverse (RO) pour rincer une fois à la fin.
3. Stérilisation de surface
   1. Casser les racines en quatre morceaux de 2 cm de longueur chacun avec une lame de scalpel et les mettre dans un bécher propre de 200 mL.
   2. Assemblez de l’eau RO autoclavée, 2 % de NaOCl, un bocal de rejet et du papier buvard autoclavé (5 cm²⁾à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire.
   3. Laver les racines avec 50 mL d’eau RO autoclavée trois fois, puis avec 50 mL de 2% de NaOCl pendant 10 min. Lavez les racines avec 50 mL d’eau RO trois fois de plus pour enlever le NaOCl.
   4. Éponger les racines en plaçant les racines sur du papier buvard autoclavé et laisser jusqu’à ce que les racines soient séchées.
4. Médias et incubation
   1. Retirer les bords des racines à l’l’arme d’une lame de scalpel stérilisée. Fendre les racines à l’aide de la lame et utiliser les forceps stérilisés pour les placer sur une plaque petri de dextrose de pomme de terre (PDA) contenant du sulfate de streptomicine (50 mg L^-1)et de l’ampicilline (50 mg L^-1).
   2. Fermez la plaque, scellez avec du parafilm et incubez dans un incubateur à 28 °C pendant deux jours dans l’obscurité.
5. Méthode de pointe hyphal
   1. Après deux jours d’incubation, apportez les plaques dans la chambre d’écoulement laminaire. Couper la pointe de la croissance hyphale⁸ sous un stéréomicroscope (Stéréomicroscope éducatif Leica EZ4) et le transférer dans une plaque PDA fraîche avec du sulfate de streptomie et de l’ampicilline.
   2. Incuber les assiettes dans l’incubateur à 28 °C pendant dix jours dans l’obscurité.
6. Stockage et entretien de l’inoculum fongique R. bataticola
   1. Faites des obliques PDA dans des tubes à essai et transférez un bouchon d’agar fongique à partir d’une plaque de culture vieille de dix jours à l’aide de la boucle d’inoculation stérilisée par la flamme. Sceller le bouchon du tube à essai avec du parafilm.
   2. Incuber les inclinaisons à 28 °C pendant dix jours dans l’obscurité.
   3. Sceller à nouveau le bouchon avec du parafilm et le conserver à 4 °C au réfrigérateur pour l’utilisation future.
   4. Sous-culture tous les six mois pour maintenir le champignon.
7. Maintien de la virulence
   1. Infecter les plantes avec l’inoculum fongique pur préparé comme mentionné dans la technique de pot malade³. Isoler le même champignon des plantes infectées (postulats de Koch)^{9 et l’utiliser} pour d’autres expériences.
      REMARQUE : Dans cette étude, une souche isolée sur le terrain du champignon a été utilisée (GenBank : MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Technique de papier blotting

REMARQUE : La technique du papier buvard implique la préparation de l’inoculum fongique liquide, la préparation des semis et l’évaluation de la maladie.

1. Préparation du liquide R. bataticola inoculum
   REMARQUE : L’inoculum fongique liquide R. bataticola contient à la fois du mycélia et de la microscléotie. Ces deux structures agissent comme inoculum primaire.
   1. Préparez 500 mL de supports PDB dans un flacon de 1 000 mL et autoclavez-le à 121 lb pendant 15 min.
   2. Une fois les supports refroidis, inoculer le bouillon avec une boucle de bouchon d’agar fongique d’une culture fongique oblique et incuber à 28 °C pendant cinq jours dans un shaker à 180 rpm dans l’obscurité.
   3. Assembler un entonnoir en verre ou en plastique autoclavé (10 cm), un flacon conique d’un litre et deux couches de maille (taille de 10 cm²⁾ (maille en nylon avec la taille du pore de 3 mm de diamètre) sur la table. Filtrer les mycélia fongiques et la microscléotie à l’aide du maillage. Éponger le champignon dans du papier buvard autoclavé.
   4. Pesez 100 g de mycélie pour 50% d’inoculum et maintenez à température ambiante.
2. Préparation de la plante de pois chiches
   1. Sélectionnez 50 graines saines (dans cette étude, le génotype sensible au DRR JG 62 a été utilisé), placez-les dans un bécher de 100 mL et couvrez-les d’un maillage.
   2. Lavez d’abord les graines avec de l’eau du robinet pour enlever les débris du sol.
   3. Prendre le bécher avec des graines dans la chambre d’écoulement laminaire et les laver avec stérilisé 50 mL d’eau RO trois fois pendant 1 min par lavage.
   4. Stériliser les graines avec 50 mL de NaOCl 2% aqueux pendant 2 min avec des secousses continues et laver les graines avec 50 mL d’eau stérilisée cinq fois pendant 1 min chacune.
   5. Remplir un sac en polyéthène (47,5 cm x 25 cm) de Soilrite (un mélange de perlite élargie de qualité horticole, de mousse de tourbe irlandaise et de vermiculite exfoliée à rapport égal, c’est-à-dire 1/3:1/3:1/3), semer la surface stérilisée 50 graines de deux cm de profondeur, et garder dans une chambre de croissance / pièce avec 28 °C ± 2 °C température, 16 h photopériod avec une intensité lumineuse de 150 μmol m⁻² s⁻¹, et l’humidité relative de 70%. Arrosez-les avec de l’eau RO et déraciner les plantes huit jours après le semis.
   6. Laver les racines dans l’eau du robinet pour enlever les particules soilrite. Rincez les racines à l’eau RO stérilisée et gardez-les dans l’eau RO dans un bécher de 1000 mL.
3. Préparation de papier buvard dans des plateaux
   1. Prenez un papier buvard et coupez-les en morceaux (30 cm × 23 cm) en nombre suffisant pour répondre aux réplications.
   2. Emballez les feuilles dans un sac en polyéthène autoclavable et autoclavez-les à 121 lb pendant 15 minutes et gardez-les dans un four à air chaud pour le séchage.
   3. Plier chaque feuille de papier buvard en deux.
   4. Placez le papier sur un plateau en plastique propre et essuyé par l’esprit, comme le montre la figure 2i-iv.
4. Inoculation des plantes par trempage
   1. Dissoudre 100 g d’inoculum fongique dans 200 mL d’eau RO autoclavée dans un bécher de 200 mL pour obtenir 50% d’inoculum.
   2. Tremper les racines des plantes dans l’inoculum préparé pendant 1 min avec un mouvement intermittent de haut en bas pour assurer un attachement uniforme à l’inoculum fongique.
5. Placer les plantes dans le papier buvard
   1. Mouiller le côté inférieur du papier buvard placé sur le plateau avec de l’eau RO stérile. Placez les plantes sur le papier d’une manière où seules les racines sont couvertes par le papier, et les pousses sont laissées de côté.
   2. Fermez-le en pliant le côté supérieur du papier buvard et mouiller tout le papier pour fournir suffisamment d’eau pour soutenir la croissance des plantes.
   3. Arrosez le plateau une fois par jour et gardez les plateaux à 28 °C. Observez quotidiennement les symptômes tels que la nécrose, la pourriture des racines et le jaunissement des feuilles.

3. Technique de pot malade

NOTE : La technique de pot malade implique la préparation de l’inoculum virulent et d’un pot malade, le maintien du niveau d’humidité, et l’évaluation des symptômes de la maladie.

1. Préparation du substrat
   1. Prenez un kg de graines de pois chiches disponibles dans le commerce. Enlever les graines infectées (graines dont la croissance fongique est fongique, les taches d’infection et les dommages causés par les insectes). Placez-les dans un bécher en plastique de 5 L et lavez-les à l’eau du robinet 3 à 4 fois pour enlever les débris majeurs.
   2. Laver les graines avec 2 L d’eau RO trois fois et faire tremper les graines de 1 kg dans un bécher de 5 L avec trois fois plus d’eau pendant cinq heures.
   3. Une fois que les graines ont imbibé l’eau, la relivez-les avec de l’eau RO trois fois pour enlever les exsudats de graines.
   4. Retirer complètement l’eau et emballer les graines dans des bouteilles de confiture (300 mL, 12 cm de hauteur, 6 cm de diamètre et 155 g de poids) à environ 1/4^{de capacité} (100 g par bouteille de confiture) et fermer les bouteilles avec des bouchons. Emballez dix bouteilles de confiture dans un sac en plastique autoclavable (48 cm x 30 cm) autoclave deux fois à 121 lb pendant 15 min en continu.
   5. Sécher les graines à 40 °C au four toute la nuit pour enlever les gouttelettes d’eau à l’intérieur de la bouteille.
2. Préparation de la culture malade
   1. Allumez la chambre d’écoulement laminaire de niveau BSL-2. Essuyer le plancher à fond avec 70% d’éthanol, et allumer les UV pendant 15 min. Ensuite, gardez les graines à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire.
   2. Prenez la culture R. bataticola fraîchement isolée de 10 jours (partie 1). Ensuite, prenez trois bouchons d’agar fongiques (diamètre de 4 mm) à l’aide d’une pointe stérile pipette ou de l’agrile du liège, et mettez-les dans des bouteilles de confiture aseptiques. Couvrir les bouteilles de bouchons et sceller avec du parafilm.
   3. Agiter les bouteilles pour mélanger uniformément le disque fongique avec les graines de pois chiches.
   4. Incuber les bouteilles à 30 °C pendant 15 jours dans l’obscurité.
   5. Prenez des bouteilles de confiture avec la croissance fongique noire (figure 4iii) et transférez la culture malade (graines avec la microscléotie) des bouteilles de confiture à une plaque en verre de Petri utilisant des forceps stériles. Séchez-les à température ambiante pendant deux jours dans une assiette de Pétri en verre.
   6. Poudrer la masse fongique à l’aide d’un mortier et d’un pilon, et conserver la poudre à 4 °C.
   7. Autoclave Soilrite deux fois à 121 lbs pendant 15 min.
   8. Séchez le mélange de Soilrite autoclaved sous un parasol.
   9. Mélanger la poudre fongique avec soilrite à 50% w/w, remplir les pots avec le mélange, et les garder à température ambiante pendant une journée.
   10. Semer une graine de pois chiches sensible à la DRR stérilisée de surface par pot (pots ronds de 10 cm)(tableau des matériaux)et maintenir un niveau d’humidité de 80 % de la capacité de champ (FC).
   11. Observez les symptômes tels que la nécrose et la pourriture des racines en déracinant les plantes après la germination.
3. Évaluation de l’efficacité des pots malades
   REMARQUE : Les plantes présentent des symptômes fœlaux jaunes lorsque les racines sont complètement pourries.
   1. Développer un score de maladie basé sur les nombres de lésions (taches nécrotiques)(figure supplémentaire 2C)et la gravité de la pourriture des racines. Les pots malades montrant 90% de mortalité végétale peuvent être utilisés plus loin.
4. Dépistage du génotype
   1. Préparer la culture malade en grande quantité et la mélanger soit avec du soilrite stérilisé, soit du sol de champ (5 % w/w) dans des pots de 30 cm de haut. Arrosez les pots pour mouiller la surface et laissez-les intacts pendant sept jours.
   2. Semer une graine stérilisée de surface par pot rond de 10 cm et trois graines par pot rond de 30 cm et les arroser adéquatement.
   3. Observez les symptômes jaunes de pourriture fœliar et de racine.
5. Sécheresse combinée et infection à R. bataticola
   1. Imposer le stress dû à la sécheresse en suivant les protocoles mentionnés dans Sinha et coll. (2019).

Résultats

Cette étude visait à démontrer des techniques telles que le papier buvard et les techniques de pot malade pour faciliter la compréhension pathomorphologique et moléculaire de l’interaction plante-pathogène sous le stress de la sécheresse. Pour ce faire, les plantes présentant des symptômes de DRR^1,3,4 ont été recueillies dans un champ de pois chiches, et le champignon a été isolé en utilisant la méthode de point...

Discussion

La technique du papier buvard offre une approche simple pour dépister les génotypes de pois chiches dans des conditions de laboratoire. L’inoculation dip permet l’étude de l’interaction sur une base temporelle avec un contrôle facile sur la charge inoculum (Figure supplémentaire 1) et facilite le dépistage in vitro. En outre, même les jeunes semis peuvent être utilisés. La culture fongique de cinq jours (figure 1B) peut produire suffisamment d’inoculum pour ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901