Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Résumé

Nous présentons un système microfluidique pour les études à haut débit sur les machines de vie complexes, qui se compose de 1500 unités de culture, une gamme de pompes périsaltiques améliorées et un module de mélange sur place. La puce microfluidique permet d’analyser in vivo les conditions micro-environnementales très complexes et dynamiques.

Résumé

Imiter les conditions environnementales in vivo est crucial pour les études in vitro sur les machines de vie complexes. Cependant, les techniques actuelles ciblant les cellules et les organes vivants sont soit très coûteuses, comme la robotique, soit manquent de volume de nanolitres et de précision milliseconde dans la manipulation liquide. Nous présentons ici la conception et la fabrication d’un système microfluidique, qui se compose de 1500 unités de culture, d’une gamme de pompes périsaltiques améliorées et d’un module de mélange sur place. Pour démontrer les capacités du dispositif microfluidique, les sphères des cellules souches neurales (NSC) sont maintenues dans le système proposé. Nous avons observé que lorsque la sphère de la CSN est exposée au CXCL au jour 1 et au FEM au jour 2, la conformation en forme ronde est bien maintenue. La variation de l’ordre d’entrée de 6 médicaments entraîne des changements morphologiques dans la sphère de la CSN et le marqueur représentatif du niveau d’expression de la stemness NSC (c.-à-d. Hes5 et Dcx). Ces résultats indiquent que les conditions environnementales dynamiques et complexes ont de grands effets sur la différenciation et l’auto-renouvellement de la CSN, et le dispositif microfluidique proposé est une plate-forme appropriée pour les études à haut débit sur les machines de vie complexes.

Introduction

Les techniques à haut débit sont cruciales pour les études biomédicales et cliniques. En effectuant parallèlement des millions de tests chimiques, génétiques ou cellulaires vivants et organoïdes, les chercheurs peuvent rapidement identifier les gènes qui modulent une voie biomoléculaire et personnaliser l’apport séquentiel de médicaments en fonction de ses besoins spécifiques. La robotique^{1 et} les puces microfluidiques en combinaison avec un programme de contrôle des périphériques permettent d’automatiser des procédures expérimentales complexes, couvrant la manipulation des cellules et des tissus, la manipulation liquide, l’imagerie et le traitement/contrôle^{des données 2,3}. Par conséquent, des centaines et des milliers de conditions expérimentales peuvent être maintenues sur une seule puce, selon le débit^{désiré 4,5}.

Dans ce protocole, nous avons décrit la procédure de conception et de fabrication d’un dispositif microfluidique, qui se compose de 1500 unités de culture, d’un éventail de pompes périsaltiques améliorées et de modules de mélange sur place. La chambre de culture cellulaire à 2 niveaux empêche le cisaillement inutile pendant l’échange moyen, ce qui assure un environnement culturel intact pour l’imagerie cellulaire vivante à long terme. Les études démontrent que le dispositif microfluidique proposé est une plate-forme appropriée pour des études à haut débit sur les machines de vie complexes. En outre, les caractéristiques avancées de la puce microfluidique permettent la reconstitution automatisée de conditions microenvironnementales très complexes et dynamiques in vivo, comme les cytokines et ligands toujours changeantes compositions^6,7 , dont^{l’achèvement}prend des mois pour les plates-formes conventionnelles comme la plaque de 96 puits.

Protocole

1. Conception de puces microfluidiques

1. Concevoir le multiplexeur microfluidique composé de 18 entrées, chacune d’entre elle est contrôlée par une valve individuelle et une pompe périssaltique. Pour augmenter le volume liquide entraîné par le cycle de pompage, que la pompe périssaliste soit composée de 3 canaux de commande, qui ont été délibérément élargis à 200 μm, et de 10 lignes d’écoulement connectées.
2. Concevez la chambre de culture sans cisaillement. La réplication de l’unité de culture à 2 niveaux est composée d’une chambre de culture cellulaire inférieure (400 μm x 400 μm x 150 μm) et d’une couche tampon plus élevée (400 μm x 400 μm x 75 μm), ce qui empêche le stress non désiré du cisaillement sur les cellules pendant l’échange moyen (figure 1).
3. Concevoir des fonctionnalités à haut débit. Dupliquer l’unité de culture pour former une matrice de 30 x 50, occupant une superficie d’environ 7 cm par 5 cm de taille.

2. Fabrication et fonctionnement de copeaux

1. Fabrication de la réplique de moulage à l’aide de lithographie UV
   NOTE : Le moulage de réplique a été fabriqué sur la gaufrette de silicium selon le protocole standard de photolithographie^8.
   1. Fabrication des structures du canal
      1. Photorésistant de filature : Manteau de rotation 5 mL du photorésistant négatif SU-8 3025 sur une gaufrette de silicium à 500 rpm pendant 10 s et 3000 rpm pour 30 s.
      2. Cuire au four doux : Mettre la gaufrette sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 2 min, puis 95 °C pendant 10 min, la refroidir à température ambiante.
      3. Alignement et séchage : Fixer la gaufrette et le masque sur le support de l’alignement et allumer la source de lumière pendant 18 s pour guérir le photorésistant exposé.
      4. Cuire au four avant l’exposition : Augmenter la plaquette à 95 °C à 110 °C/h à la température ambiante et la garder au moins 40 min jusqu’à ce qu’elle soit enlevé.
      5. Développer : Tremper la gaufrette dans la solution en développement (développeur SU-8) et l’agiter pendant 2,5 minutes pour laver le photorésistant redondant et obtenir la structure du canal de 25 μm de haut.
      6. Cuire au four dur : Couvrir la gaufrette d’une boîte de Pétri en verre et cuire au four à 65 °C pendant 2 min, puis monter à 160 °C à 120 °C/h et la conserver pendant 3 heures.
   2. Fabrication de la chambre de culture cellulaire avec la couche tampon
      1. Utilisez les paramètres de l’étape 2.1.1.1 pour faire tourner la couche 7 mL du photorésistatif négatif SU-8 3075 sur la gaufrette ci-dessus.
      2. Cuire au four doux (décrit à l’étape 2.1.1.2) la gaufrette et changer le masque pour bien s’aligner avec les marqueurs sur la gaufrette. Ensuite, allumez la source de lumière pendant 24 s pour guérir le photorésiste exposé.
      3. Trempez la gaufrette dans la solution en développement (développeur SU-8) et agitez-la pendant 4 minutes et 40 secondes pour laver le photorésistant redondant et obtenir une structure de couche de 75 μm de haut qui autour de la structure du canal de 25 μm de haut fabriquée auparavant. Cuire dur (décrit à l’étape 2.1.1.6) la gaufrette pour rendre la structure complexe plus forte.
      4. Répétez les étapes 2.1.2.1-2.1.2.3 pour fabriquer une structure de chambre de 75 μm de haut qui s’empile sur la structure de la couche.
   3. Fabrication des structures de vannes
      1. Utilisation du paramètre de l’étape 2.1.1.1 pour faire tourner le manteau 5 mL du photorésisteur positif AZ 50x sur la gaufrette ci-dessus.
      2. Cuire au four doux (décrit à l’étape 2.1.1.2) la gaufrette et faire le masque bien aligné avec des marqueurs sur la gaufrette, puis garder la source de lumière allumée pendant 20 s et hors immédiatement pendant 30 s. Répétez la procédure allumée/éteinte en 5 cercles pour guérir le photorésiste exposé.
      3. Trempez la gaufrette pour le développeur assorti et agitez-la pendant environ 8 minutes pour laver le photorésistant redondant et obtenir les valves en forme ronde qui se chevauchent avec les canaux de commande pour assurer une bonne connexion. Cuire dur (décrit à l’étape 2.1.1.6) la gaufrette à motifs pour rendre l’ensemble du modèle plus fort.
2. Production de puces microfluidiques à l’aide de lithographie douce
   1. Traiter les gaufrettes de silicium à motifs et vierges avec de la rimethylchlorosilane pendant 15 min.
   2. Préparer 3 portions de gel PDMS (10:1 de rapport monomère/catalyseur) correspondant respectivement à 50 g de couche d’écoulement, 20 g de couche de contrôle 2 et 20 g de membrane.
   3. Jetez 50 g de gel PDMS sur la plaquette de silicium à motifs, et dé-gazez-les pendant 1-2 heures dans la chambre à vide à -0,85 MPa pour copier la couche d’écoulement.
   4. Dégazer les 2 portions de 20 g de PDMS et les faire tourner sur la gaufrette à motifs et une gaufrette en silicium blanc à 2000-2800 tours pendant 30 s afin de préparer une couche de contrôle et une couche membranaire.
   5. Mettre les gaufrettes recouvertes de PDMS dans le four de ventilation pendant 60 min à 80 °C pour l’incubation.
   6. Alignez et lier les différentes couches ensemble à l’aide d’un dispositif optique personnalisé (zoom en 100x) et d’une machine à graver plasmatique. Ensuite, gardez-le dans un four de ventilation pendant 2 heures à 80 °C pour améliorer la liaison de la puce.
   7. Percer les trous d’entrée sur la puce, puis les lier sur un couvercle recouvert de PDMS et durci pendant au moins 12 heures à 80 °C avant utilisation.
3. Opération des puces
   1. Connectez les valves solénoïdes pneumatiques miniatures à la couche de commande de la puce et ouvrez l’interface utilisateur graphique^{MATLAB personnalisée 8} pour relier et contrôler l’interrupteur.
   2. Réglez les pressions de fermeture des valves membranaires PDMS push-up à 25 psi.
   3. Fournir des entrées combinatoires/séquentielles qui changent dynamiquement aux chambres désignées (figure 2d) en arrêtant les vannes en temps opportun.

3. Génération d’entrées dynamiques dans les microenvironnements cellulaires

1. Traitement des copeaux et chargement cellulaire
   1. Maintenir les conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO₂₎au microscope pendant au moins 5 heures.
   2. Remplissez la puce d’un milieu de revêtement (c.-à-d. mentionné dans la NOTE) et incubez-la aux conditions de culture standard (décrites à l’étape 3.1.1) pendant au moins une heure.
   3. Rincer la puce par la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) ou le milieu de culture cellulaire (le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco, DMEM) pour construire un environnement culturel sain.
   4. Récoltez les cellules à 80% de confluence, et résuspendez les cellules en utilisant des supports de culture (DMEM) à une densité de ~ 10⁶/mL. Chargez ensuite les cellules dans la puce en pressurisant la solution contenant des cellules.
      REMARQUE : La culture de différentes lignées cellulaires sur puce nécessite un support de revêtement correspondant pour traiter la chambre de culture cellulaire. En règle générale, pour les expériences sur le fibroblaste 3T3 et la culture adhérente de la poule toutes les valves contrôlant les chambres de culture sont ouvertes, les cellules s’écoulent dans toutes les chambres de culture dans la même colonne.
2. Configuration pour l’imagerie cellulaire vivante à haut débit
   REMARQUE : Pour l’acquisition d’images, un microscope inversé avec une étape translationnelle automatisée et une caméra numérique complémentaire semi-conducteur d’oxyde métallique (CMOS) ont été utilisés. L’acquisition de la scène et de l’image a été contrôlée via le logiciel personnalisé.
   1. Visualisez la matrice des chambres de culture à l’aide d’une lentille objective 10x en champ lumineux pour affirmer et définir les coordonnées de localisation de chaque chambre de la matrice de 30 par 50 chambres.
   2. Transformez l’objectif en 20x ou 40x, puis sélectionnez les coordonnées de localisation de la chambre désirée et l’étape translationnelle se déplace vers la position assignée après confirmation. Peaufinez le plan focal x, y, z pour obtenir une image optimale.
   3. L’intensité lumineuse optimale, le temps d’exposition et d’autres paramètres d’image ont été déterminés individuellement pour chaque canal (c.-à-d. imagerie par champ lumineux et fluorescence).
   4. Définissez l’intervalle et la durée du cycle d’imagerie, enregistrez le chemin, puis commencez l’imagerie.

Résultats

La pompe périssaltique conventionnelle sur puce a d’abord été décrite par Stephen Quake en 2000, en utilisant laquelle la péristalsis a été actionnée par le modèle 101, 100, 110, 010, 011, 001 ^8,10. Les nombres 0 et 1 indiquent « ouvert » et « proche » des 3 lignes de commande horizontales. Des études utilisant plus de 3 valves (p. ex., cinq) ont également été rapportées¹¹. Même si la pompe périssaltique composée de ...

Discussion

Divers dispositifs microfluidiques ont été développés pour effectuer des expériences multiplexées et^{complexes 17,18,19,20}. Par exemple, les microwells faits d’un éventail de cavités topologiques peuvent piéger des cellules individuelles sans l’utilisation de la force externe, montrant des caractères avantageux comprenant la petite taille d’échantillon, la parallélisation, le c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL	Sigma
CO2 Incubator HP151	Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)	Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g	Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS	Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL	Millipore, Austria
Glutamax 100x	Gibco
Heating Incubator BGG-9240A	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E	Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin	Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002	Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)	Momentive
polylysine 0.01%	Sigma
Spin coater ARE-310	Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS	Cence
Spin coater WH-SC-01	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025	MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075	MicroChem, Westborough, MA, USA