Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

Résumé

L’isolement de cellules à partir d’implants disséqués et leur caractérisation par cytométrie en flux peuvent contribuer de manière significative à la compréhension du schéma de réponse immunitaire contre les implants. Cet article décrit une méthode précise pour l’isolement de cellules d’implants disséqués et leur coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.

Résumé

Le succès de l’implantation d’un tissu cultivé en laboratoire ou d’un dispositif médical chez un individu dépend de la réponse immunitaire de l’hôte receveur. Si l’on considère un implant comme un corps étranger, une réponse immunitaire hostile et dérégulée peut entraîner le rejet de l’implant, tandis qu’une réponse régulée et la récupération de l’homéostasie peuvent conduire à son acceptation. L’analyse des microenvironnements d’implants disséqués dans des contextes in vivo ou ex vivo peut aider à comprendre le modèle de réponse immunitaire, ce qui peut finalement aider à développer de nouvelles générations de biomatériaux. La cytométrie en flux est une technique bien connue pour caractériser les cellules immunitaires et leurs sous-ensembles en fonction de leurs marqueurs de surface cellulaire. Cette revue décrit un protocole basé sur le découpage manuel en dés, la digestion enzymatique et la filtration à travers un tamis cellulaire pour l’isolement de suspensions cellulaires uniformes à partir de tissus implantaires disséqués. De plus, un protocole de coloration par cytométrie en flux multicolore a été expliqué, ainsi que des étapes pour les réglages initiaux du cytomètre afin de caractériser et de quantifier ces cellules isolées par cytométrie en flux.

Introduction

Les progrès dans le domaine de la médecine ont conduit à l’utilisation fréquente de matériaux implantés pour soutenir la fonction ou la repousse des tissus endommagés ^1,2. Il s’agit notamment de dispositifs tels que les stimulateurs cardiaques, les implants cosmétiques reconstructifs et les plaques orthopédiques utilisées pour la fixation des fractures osseuses ^3,4. Cependant, les matériaux utilisés pour fabriquer ces implants et les endroits où ils sont implantés jouent un rôle important dans la détermination du succès de ces implants ^5,6,7. En tant que corps étrangers, ces implants peuvent générer une réponse immunitaire de la part de l’hôte qui peut conduire soit au rejet, soit à la tolérance⁸. Ce facteur a conduit la recherche sur les biomatériaux à générer des matériaux capables d’attirer la réponse immunitaire souhaitée après l’implantation 9,10,11,12.

La réponse immunitaire est une exigence essentielle dans le domaine de la médecine régénérative, où un tissu ou un organe est cultivé autour d’un squelette de biomatériau (échafaudage) dans un laboratoire pour le remplacement d’un tissu ou d’un organe endommagé^13,14,15,16. En médecine régénérative, l’objectif est de remplacer les tissus manquants ou endommagés par l’utilisation de cellules, de signaux et d’échafaudages, chacun pouvant être fortement modulé par les réponses immunitaires¹⁷. De plus, même lorsqu’une absence de réponse immunitaire est souhaitée, c’est très rarement une absence d’activité immunitaire plutôt que la présence d’un profil régulateur qui est souhaitée¹⁸. Des techniques telles que la cytométrie en flux peuvent jouer un rôle important dans la caractérisation du modèle de réponse immunitaire à divers biomatériaux utilisés pour le revêtement des dispositifs implantaires ou pour le développement d’échafaudages pour l’ingénierie tissulaire¹⁹.

Ces informations, à leur tour, aideront à développer des biomatériaux pour les implants qui peuvent être bien tolérés par le système immunitaire ou à développer des échafaudages qui peuvent jouer un rôle constructif dans l’ingénierie tissulaire. La préparation correcte des échantillons pour l’analyse par cytométrie en flux est une étape importante pour éviter des résultats inexacts dans la caractérisation immunitaire par tri cellulaire activé par fluorescence^20,21. Par conséquent, cette revue présente une méthodologie détaillée qui peut être utilisée pour l’isolement des cellules du tissu d’échafaudage, la coloration de la suspension cellulaire et l’analyse par cytométrie en flux.

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Protocole

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu du protocole de cytométrie en flux.

1) Préparation des réactifs

1. Préparer les milieux pour la dilution des enzymes et pour la culture tissulaire.
   1. Ajouter 5 mL de solution tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) dans 500 mL de milieu RPMI et bien agiter. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
2. Calculez le volume de la solution enzymatique.
   REMARQUE : Le volume de la solution enzymatique est le volume du milieu contenant les enzymes (collagénase et DNase I) qui seront nécessaires pour digérer les tissus coupés en dés dans des plaques à 6 puits ; Cela dépend du nombre d’échantillons.
   1. Utilisez l’équation suivante pour calculer le volume requis :
      (Nombre d’échantillons à digérer) × 5 mL de RPMI sans sérum avec tampon HEPES de 10 mM
      REMARQUE : Par exemple, pour 0,1 à 0,3 g de rate disséquée, utilisez 5 mL de milieu pour préparer la solution enzymatique. Le protocole de digestion enzymatique décrit dans ce manuscrit concerne principalement les tissus mous (allant de 0,1 à 1 g) disséqués à partir de souris, notamment le cerveau, les reins, la peau, le foie, les poumons, la rate, les muscles, ainsi que les capsules autour d’implants sous-cutanés faits de matériaux synthétiques ou de protéines de la matrice extracellulaire. La digestion des tissus cartilagineux durs peut nécessiter des conditions et des volumes différents d’enzymes digestives, ce qui ne peut être déterminé que par optimisation.
   2. Calculez la quantité de collagénase et de DNase dont j’avais besoin pour la solution enzymatique.
      REMARQUE : Dans ce protocole, 0,25 mg/mL de collagénase et 0,2 mg/mL de DNase I ont été utilisés. Les concentrations de travail requises pour la collagénase et la DNase peuvent varier selon les types de tissus¹⁹.
3. Préparez une solution de colorant de viabilité de 1 :1000 en ajoutant 1 μL de colorant de viabilité (voir le tableau des matériaux) à 999 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en vortex la solution. Conservez la solution à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à nouvel usage.
4. Préparez le tampon de coloration en ajoutant 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 100 mL de PBS, puis faites vortex la solution jusqu’à ce que la BSA soit complètement dissoute. Conservez la solution à 4 °C jusqu’à la fin de l’utilisation.

2) Mise en place de plaques de digestion enzymatique

1. Installez une plaque à 6 puits avec des crépines cellulaires de 70 μm dans chaque puits. Ajouter 3 mL du milieu préparé à l’étape 1.1.1 dans chaque puits et incuber sur de la glace.
2. Conserver le milieu restant (2 mL/puits) dans un incubateur ou un bain-marie à 37 °C pour mettre en suspension la quantité calculée de collagénase et de DNase I (étape 1.2.2).

3) Isolement des cellules

1. Placez les implants/tissus disséqués dans des assiettes et coupez-les en petits dés à l’aide de ciseaux. Vous pouvez également utiliser une méthode de perturbation mécanique à l’aide d’un dissociateur tissulaire ou d’un homogénéisateur portatif. En raison du nombre élevé de leucocytes, disséquez la rate pour l’utiliser comme contrôle de coloration à chaque passage.
   REMARQUE : Comme certains matériaux induisent des niveaux plus élevés de fibrose, ce protocole s’applique à la fois aux matériaux hautement fibreux et peu fibreux. Cependant, chaque méthode de traitement doit être évaluée à la fois pour le rendement cellulaire et la viabilité après digestion avant la coloration. Éviter la contamination du sang périphérique pendant la dissection.
2. Ajouter la collagénase et la DNase I (volume calculé à l’étape 1.2.2) au RPMI restant (2 mL) qui a été réchauffé à 37 °C. Ajouter 2 mL de la solution enzymatique complète dans chaque puits.
3. Placez les plaques dans un shaker incubé pendant 45 min à 37 °C et 100 tr/min.
   REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous empilez des assiettes car cela peut empêcher un bon transfert de chaleur.
4. Pendant ce temps, préparez un embout de distribution en suspension en hachant 3-4 mm de l’extrémité d’un embout de 1000 μL avec des ciseaux. Après l’incubation, pipetez la suspension dans les puits de haut en bas pour bien la mélanger à l’aide de l’embout haché. Placez le tamis cellulaire sur le dessus d’un tube conique de 50 ml et passez la solution digérée à travers le tamis cellulaire.
   REMARQUE : Le filtre cellulaire de 70 μm est suffisant pour séparer les cellules du biomatériau implanté, tel que l’alginate. Si une plus grande pureté est requise, utilisez des procédés tels que la séparation par gradient de densité pour obtenir une population enrichie de leucocytes.
5. Rincez les puits avec 1x solution PBS et transférez le volume de rinçage à travers la crépine, puis ajoutez les lavages de la crépine avec 1x solution PBS jusqu’à ce que le volume dans le tube atteigne 50 ml.
   REMARQUE : Le PBS 1x doit être à température ambiante pour éviter toute augmentation de la viscosité du digestat et pour permettre la granulation des cellules pendant la centrifugation.
6. Centrifuger le tube à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Après la centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique sans perturber la pastille. Remettre le granulé en suspension dans 1000 μL de 1x PBS, et transférer la suspension dans un tube de microcentrifugation.
7. Mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu trypan, et charger la suspension sur des lames de chambre de comptage pour le comptage des cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules ou sur un hémocytomètre pour compter par la méthode conventionnelle au microscope. Vous pouvez également utiliser des billes de comptage de cellules de cytométrie en flux.

4) Coloration pour cytométrie en flux

1. Reportez-vous à la figure 2 pour obtenir un exemple de disposition de plaque pour une expérience à 14 couleurs avec 45 échantillons, des contrôles de fluorescence moins un (FMO), des contrôles de compensation et un contrôle d’échantillon de rate entièrement coloré. Après avoir estimé le nombre total de cellules, calculer le volume de la suspension cellulaire nécessaire pour la coloration de 1 × 10⁶ cellules pour chaque échantillon, et de 0,5 × 10⁶ cellules pour chaque compensation et contrôle FMO. Distribuez le volume requis de la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à fond en V de 96 puits, et complétez le volume à 100 μL avec 1x PBS.
   REMARQUE : À titre d’exemple, si 1000 μL de suspension cellulaire obtenus à l’étape 3.6 contiennent 40 × 10 6 cellules, alors pour 1 × 10 6 cellules, 1000/40 × 10⁶ = 25 μL de suspension cellulaire seront nécessaires.
2. Centrifuger la plaque à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, aspirer le surnageant, puis remettre en suspension les cellules dans les puits d’échantillonnage et dans un puits de contrôle de compensation pour déterminer la viabilité, avec 100 μL d’une solution 1 :1000 du colorant de viabilité (voir tableau des matériaux).
3. Pour les cellules des autres puits de compensation ainsi que pour les FMO et les puits non colorés, les remettre en suspension avec 100 μL de PBS 1x.
4. Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 30 min à 4 °C.
5. Dans l’intervalle, préparez un cocktail d’anticorps de surface pour la coloration de l’échantillon et des contrôles FMO : 50 μL par échantillon ou FMO. Voir le tableau 1 pour un exemple de cocktail d’anticorps.
6. Après incubation, ajouter 100 μl de 1x PBS dans chaque puits, faire tourner à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
7. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 200 μL de tampon colorant (1x PBS + 1% BSA) ; Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
8. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans la compensation, la FMO et les puits non colorés avec 50 μL de PBS 1x. Ajouter 50 μL du cocktail d’anticorps dans les puits d’échantillons et les puits FMO respectifs. Ajoutez les anticorps respectifs aux différents puits de compensation.
9. Incuber la plaque pendant 45 min à l’obscurité à 4 °C. Après incubation, ajouter 150 μL de tampon colorant dans chaque puits, et centrifuger la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
10. Aspirer le surnageant, remettre les cellules en suspension avec 200 μL de tampon colorant et centrifuger la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
11. Si vous analysez des échantillons sans fixation, les remettre en suspension dans 200 μL de tampon de coloration et passer à la section 6 sur la configuration du cytomètre et l’analyse des échantillons. En cas de fixation des cellules, aspirer le surnageant après le lavage et ajouter 100 μL d’un fixateur tel que le paraformaldéhyde à 4 %. En cas de coloration des marqueurs intracellulaires, passer à la section 5 sur la coloration intracellulaire, fixer et perméabiliser les cellules (voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules pendant 20 min dans l’obscurité à 4 °C.
    REMARQUE : Comme la fixation peut affecter l’intensité de fluorescence de certains fluorophores, évaluez chaque panneau avec et sans fixation.
12. Après incubation, ajouter 100 μL de 1x PBS, suivi d’une centrifugation à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant, le remettre en suspension dans 1x PBS et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
13. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration et les conserver à 4 °C avant l’analyse par cytométrie en flux.

5) Coloration intracellulaire

1. En continuant à partir de l’étape 4.11 pour la fixation et la perméabilisation des marqueurs intracellulaires, ajouter 100 μL du tampon approprié. Centrifuger les cellules à 350 × g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre les pastilles en suspension dans 200 μL de la solution fixatrice-perméabilisante ; centrifuger les cellules à 350 × g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre les pastilles en suspension avec des anticorps intracellulaires dilués dans le tampon approprié.
   REMARQUE : Les types d’anticorps et les dilutions dépendent des cellules cibles. Par exemple, un marqueur intracellulaire courant est la boîte P3 à tête de fourche pour les lymphocytes T régulateurs, qui est fréquemment utilisée à une dilution de 1 :100.
2. Incuber la suspension cellulaire dans l’obscurité pendant 45 min à 4 °C. Après incubation, ajouter 150 μL du tampon approprié et centrifuger la suspension à 350 × g pendant 5 min à 4 °C.
3. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon colorant suivi d’une centrifugation à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.

6) Configuration du cytomètre et de la compensation

1. Immédiatement avant d’exécuter les échantillons, préparez des billes de compensation (voir le tableau des matériaux) si vous utilisez une compensation à base de billes plutôt qu’une compensation à base de cellules.
   1. Étiqueter séparément les tubes de microcentrifugation pour chaque anticorps conjugué au fluorochrome et ajouter 100 μL de PBS 1x suivi d’une goutte complète de billes de compensation de contrôle négatif anti-souris et d’une goutte de billes de compensation de contrôle positif dans chaque tube. Ajouter 1 μL de l’anticorps approprié dans chaque tube séparé. Vortex et incubation pendant 5 min avant l’acquisition.
      REMARQUE : Comme certains colorants, tels que BUV737, ne peuvent pas être liés aux billes, utilisez un contrôle basé sur les cellules.
2. Calibrez le cytomètre en flux avant chaque expérience en exécutant la configuration du cytomètre avec les billes de suivi et conservez les paramètres du cytomètre en flux pour chaque expérience.
3. Avant d’analyser l’échantillon, ajustez le cytomètre en flux en exécutant un échantillon non coloré pour ajuster la population cellulaire sur un diagramme de diffusion latérale (SSC) par rapport à un diagramme de diffusion directe (FSC) afin que la population cellulaire tombe au centre de la parcelle et ne soit pas hors échelle.
4. Exécutez brièvement l’échantillon coloré pour ajuster les tensions pour FSC et SSC et pour chaque canal afin de vous assurer qu’aucun événement ne se situe en dehors de l’échelle logarithmique de chaque canal. Enregistrez 5 000 événements pour chaque contrôle de la rémunération, suivi d’un contrôle des populations positives et négatives. Calculez la matrice de compensation, puis exécutez les échantillons, en rassemblant au moins 1 000 événements pour les populations d’intérêt.
   REMARQUE : La compensation sur les panneaux de couleur plus grande doit être vérifiée, car la compensation automatisée peut être sujette à une surcompensation ou à une sous-compensation. Chaque paramètre doit être représenté graphiquement par rapport à tous les autres paramètres pour surveiller les signes de surcompensation ou de sous-compensation, et chaque contrôle unicolore doit être évalué. La compensation complexe d’expériences de couleur plus grande doit être effectuée avec l’aide d’un collaborateur ou d’une installation centrale ayant une vaste expérience de la cytométrie en flux. Les nouveaux types de cytomètres en flux, tels que les cytomètres spectraux, utilisent le spectre complet d’un fluorophore par le biais d’un processus connu sous le nom de démélange spectral, ce qui peut donner une distinction plus nette du chevauchement fluorescent par rapport à la compensation standard seule²².

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Résultats

Le processus de développement de panels de cytométrie en flux pour l’analyse immunitaire repose souvent sur la comparaison des résultats avec les données existantes et la littérature dans le domaine. La connaissance de la façon dont les populations peuvent se présenter en cytométrie en flux est essentielle pour une interprétation correcte des données. Quoi qu’il en soit, les populations et les types de cellules peuvent apparaître différemment dans différents tissus, il fa...

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Discussion

Cette revue décrit une méthodologie détaillée pour isoler les cellules des implants de biomatériaux afin d’obtenir une suspension cellulaire uniforme. De plus, un protocole détaillé a été fourni pour la coloration de la suspension cellulaire pour la cytométrie en flux multicolore, ainsi que les étapes de configuration d’un cytomètre en flux pour des résultats optimaux. Les méthodes d’isolement cellulaire peuvent impliquer plusieurs étapes, utilisant souvent la dissection manuelle des tissus suivie d?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6 Well Plate	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	For only fixing cells
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A7906	For preparing FACS staining buffer
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clone: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clone: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clone: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clone: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Clone: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD Biosciences	552843	For compensation control
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Clone: 93
Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	For fixing and permeabilization of cells.
HEPES buffer	Thermo Fisher	15630080	Buffer to supplement cell media
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Blend of purified Collagenase I and Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L23105	Viability dye
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clone: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clone: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Clone: M5/114.15.2
Phosphate buffer saline	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Cell culture media
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clone: E50-2440
V-bottom 96-well plate